Summary
Burada, son derece aktif Hsp104 hexameric AAA + protein mayası, protein ayrıştırılmasıyla çiftler ATP hidrolizi arıtma için bir protokol açıklar. Bu düzeni yakınlık arıtma için His6 etiketli inşa patlatır
Abstract
Hsp104 maya hexameric bir AAA + protein 1, 2-10 protein ayrıştırılmasıyla çiftler ATP hidrolizi (Şekil 1). Bu etkinlik iki anahtar seçici avantaj kazandırır. Birincisi, Hsp104 tarafından düzensiz agrega Yeniden doğallaştırmanın ısı şok 3,5,11,12 dahil olmak üzere, çeşitli protein misfolding gerilmeler sonra maya hayatta kalma güçlendirir. İkincisi, Hsp104 çapraz beta amiloid fibriller itilme, sayısız yarar sağlayan bir rezervuar olarak prion (enfeksiyöz amiloidleri) yararlanmak ve 13-22 fenotipik varyasyon kalıtsal maya sağlar . Enteresandır ki, Hsp104 doğrudan maya prion proteinlerin Sup35 ve Ure2 23-30 oluşan olanlar da dahil olmak üzere preamyloid oligomerler ve amiloid fibriller remodels. Bu amiloid remodeling işlevselliği maya Hsp104 özel bir yönüdür. E. coli orthologue, ClpB, yeni model preamyloid oligomerler veya amiloid fibriller 26,31,32 başarısız olur.
Hsp104 orthologues hayvanlar, perplexingly dışında yaşamın tüm krallıkları bulundu. Gerçekten de, hayvan hücrelerinde herhangi bir enzim sistemine sahip olmadığını Yeniden doğallaştırmanın (yerine bozulması daha) çiftler protein ayrıştırılmasıyla bilinmeyen 33-35 kalır . Bu nedenle, biz ve diğerleri Hsp104 toksik preamyloid oligomerler ve amiloid fibriller 4,7,23,36-38 spesifik proteinlerin misfolding bağlı çeşitli nörodejeneratif hastalıklar için tedavi edici bir ajan olarak gelişmiş olabilir önerdi. Bu hastalıklar ile ilişkili toplanan türlerin doğrudan hedef tedaviler vardır. Ancak, Hsp104, Parkinson Hastalığı 23 gibi PrP 39 amiloid formları ile bağlı alfa-sinüklein oluşan toksik oligomerler ve amiloid fibriller çözünür . Daha da önemlisi, Hsp104 protein agregasyonunu azaltır ve Parkinson Hastalığı 23 ve Huntington hastalığı 38 kemirgen modellerinde nörodejenerasyon düzelir. İdeal olarak, tedavi optimize etmek ve yan etkileri en aza indirmek için, Hsp104 mühendislik ve seçici soru 4,7 hastalığın merkezi özel agrega bozulmasina potansiyelize olacaktır . Ancak, nasıl Hsp104 disaggregates sınırlı yapısal ve mekanik bir anlayış toplanan yapıları ve ilgisiz proteinler gibi farklı bir repertuar bu çalışmaların 30,40-42 köstekliyor .
Hsp104 yapısı ve mekanizması anlamak için, saf protein ve sulandırmak, disaggregase aktivite minimal bileşenleri ile çalışmak için gerekli. Hsp104 ~ 5.3, ADP ve ATP varlığında veya yokluğunda 43-46 nükleotid yüksek protein konsantrasyonları hexamerizes pI 102kDa proteindir. Burada, son derece aktif, istikrarlı Hsp104 E. temizleme için optimize edilmiş bir protokol tarif coli. E. coli basitleştirilmiş büyük ölçekli üretim sağlar ve yöntemi çok sayıda Hsp104 varyantları için hızlı ve güvenilir bir şekilde yapılabilir. Bizim protokol Hsp104 saflığı artar ve E. önceki bir arıtma yöntemi ile karşılaştırıldığında, O'nun 6-tag çıkarma işlemlerini basitleştiriyor coli, 47. Ayrıca, bizim protokol iki daha yeni protokoller 26,48 daha bayağı ve rahat.
Protocol
1. Hsp104, Açıklanması
- Plazmid E. arıtma için istihdam coli, pPROEX-HTB-Hsp104, trc organizatörü 26 indüklenebilir kontrol altında Hsp104 açık okuma çerçevesi içerir. Plazmid TEV proteaz bölünme tarafından kaldırılabilir bir N-terminal Onun 6-etiket Hsp104 üretir. Kodon optimize edilmiş E. içine pPROEX-HTB-Hsp104 Dönüşümü tipik bir bakteriyel dönüşüm prosedürü kullanarak coli BL21-CodonPlus RIL hücreleri (Stratagene, Agilent Technologies) (örneğin, üreticinin talimatlarına göre). Kodon optimize edilmiş E. kullanmak önemlidir. Hsp104 alışılmadık bir kodon önyargı çünkü coli süzün.
- 100 mL 2XYT kültür (USB. Tarif: 16g / L kazein pepton, 10 g / L maya özü, 5 g / L NaCl, pH 7.0) İnokülasyon 100μg/mL ampisilin ve taze transformants 34μg/mL kloramfenikol ile desteklenmiş ve 37 o gecede büyümek ° 200rpm az sallayarak C.
- 6 X 2L şişeler 100μg/mL ampisilin ve 34μg/mL kloramfenikol 1L 2XYT içine 10 ml gecelik kültür İnokülasyon. 37 ° C kadar OD 600 = 0.4-0.6 250rpm az çalkalayınız. Sallayarak durdurun ve 15 sıcaklığını düşürmek ° C 15 ° C'ye ulaşıncaya kadar hücrelerin inkübatör 30dk için unagitated denge sağlaması için izin verin Bir kez 15 ° C 1mm bir final konsantrasyon IPTG ekleyerek protein ekspresyonu neden ulaşılır. (12-16 saat) bir gecede 250rpm sallayarak sürdürün.
2. Hücre Hasat ve Lizis
- 4 20dk için 4.000 rpm santrifüj Hasat hücreleri (bir precooled rotor) ° C (Sorvall RC 3BP + santrifüj kullanın). Hsp104 aktivitesi azaldı çünkü sonraki adımları derhal yapılmalıdır E. coli hücrelerinde dondurulur. Ayrıca, sonraki tüm adımlar buz veya 4 ° C'de yapılmalıdır
- Prechilled yeniden süspanse hücre pelletleri (buz) 10ml lizis tamponu (40mm Hepes-KOH pH 7.4, 500mm KCl, 20mm MgCl 2,% 2,5 (w / v) gliserol, 20mm imidazol, 5μM pepstatin, tam proteaz inhibitörü kokteyl (1 EDTA tablet/50mL-ücretsiz), 2mm β-mercaptoethanol).
- Buzlu suya dalmış bir ısı değiştirici kullanan bir Fransız basını (Emulsiflex) Homojenizatör hücreleri Lyse. Kullanmadan önce, tüm hücre kümeleri çözündüğünü sahip olduğunuzdan emin olun. Lizis tamponu ile homojenizatör değişikti sonra, iki geçiş 15,000-18,000 psi basıncı ile silindir üzerinden tam lizis için yeterli. Fransız basını, mevcut değilse, sonication takip lizozim ile inkübasyon (tartışma) kullanılabilir. SDS-PAGE analizi (1μL) (Şekil Lizat 2) parçalanmış hücreleri küçük bir örnek.
- 4 20dk 16.000 rpm'de santrifüj hücre enkaz kaldırma ° C (+ centifuge bir Sorvall RC5C kullanın). Bir sonraki adım için supernatant saklayın ve SDS-PAGE analizi için süpernatant küçük bir örneği (1μL) tasarruf (Ni Yük Şekil 2).
3. Hsp104 Arıtma
- Lizis tamponu dengelenmiş Ni-sepharose boncuk (GE)% 50 bulamaç 12ml (1L hücre başına 2mL Ni-sepharose boncuk) ile 2,4 adım supernatant karıştırın.
- 4 az 3 saat yavaş örnek Döndür ° C Ni-sepharose eşit kapanmıştır ve Köpüklenmemesine minimize kaldığı gibi. Kısa kuluçka süreleri mümkündür, ancak verim düşecektir. 4 ° C proteaz inhibitörlerinin varlığında, küçük bir bozulma meydana gelir ve Ni-sepharose 3 saatlik bir inkübasyon süresi, nihai ürünün etkinliği düşmediğinden. 2 dakika süreyle santrifüj Ni-sepharose toplayın, 4 ° C 'de 2.000 tane rpm (Eppendorf santrifüj 5810R). SDS-PAGE analizi (1μL) kaydedin ve süpernatant bir küçük örnek (Şekil sayesinde Ni Akış (FT) 2) geri kalanını atın.
- Yıkama tamponu (40mm Hepes-KOH pH 7.4, 150mm KCl, 20mm MgCl 2,% 2.5 (w / v) gliserol, 20mm imidazol, 2mm β-mercaptoethanol), 5 sütun hacimleri 25 sütun hacimleri ile alınan Ni-sepharose yıkayın Hsp104 elektrostatik bağlı kirleticiler ve yıkama tamponu 25 sütun hacimleri kaldırmak için 1M KCl ile tampon yıkayın. 2 dakika süreyle santrifüj her yıkamadan sonra Ni-sepharose toplayın, 4 ° C 'de 2.000 tane rpm (Eppendorf santrifüj 5810R). Her yıkama ve santrifüj çevriminden sonra, aspirasyon tampon kaldırmak.
- Hsp104, mix Ni-sepharose 1mL elüsyon 1mL Ni-sepharose başına tamponu (40mm Hepes-KOH pH 7.4, 150mm KCl, 20mm MgCl 2,% 2.5 (w / v) gliserol, 350mm imidazol, 2mm β-mercaptoethanol) ve Zehir 4 ° C'de 20 dakika çevirin. Yüksek imidazol konsantrasyon Ni boncuk 6 etkileşimi bozar. 4 az 2 dakika süreyle santrifüj boş 1.2 mL dönüş sütun (Bio-Rad) ° C 2.000 rpm (Eppendorf 5810R santrifüj) Ni-sepharose çıkarın. (Şekil Ni eluat 2) SDS-PAGE analizi için eluat, 1μL kaydedin. ~ 15mg, Hsp104 hücrelerin her litre için, bu aşamada elde edilir.
- MWCO 30.000 Amicon Ultra (Mil kullanarak içine Tampon Tampon Q (20mm Tris-HCl, pH 8, 0.5mm EDTA, 5mM MgCl 2, 50mm NaCl) döviz eluatlipore), 15 mL santrifüj konsantratör birimleri. Birincisi, daha sonra 10 kat protein sulandırmak için Tampon Q 14.5mL eklemek ~ 1.5mL protein konsantresi. Tampon değişimi için 3 kez tekrarlayın. Artan pH ve düşük tuz Hsp104 yüksek bir negatif yük sahip olmasını sağlar.
- Buffer S dengelenmiş Kaynak S 6mL sütun (GE) ile anyon değişim kromatografisi yoluyla Hsp104 arındırın. Enjeksiyondan önce, protein, düşük protein bağlayıcı Millex GP PES Membran 0.22μM şırınga filtresi (Millipore) süzülür. Biz 1mL/min bir akış oranı istihdam etmektedir. 1 sütun hacmi ile% 20 Buffer zayıf bağlayıcı proteinlerin uzaklıkta yıkayın S + (20mm Tris-HCl, pH 8, 0.5mm EDTA, 5mM MgCl 2, 1M NaCl). 5 sütun hacimleri üzerinden doğrusal bir degrade Zehir Hsp104 (20% -50% Tampon S +) (Şekil 3). 1ml kesirler toplayın. Hsp104 ve türevlerini en tipik ~ 400mm NaCl (31mS/cm) Zehir. SDS-PAGE analizi (Şekil 3, içerlek) pik fraksiyonları (1μL) örnekleri kaydedin.
- Amicon santrifüj konsantratör kullanarak, O'nun 6-tag kaldırmak için, döviz protein olarak bölünme tampon (20mm Hepes-KOH pH 7.4, 140 KCl ve 10mM MgCl 2) (bkz: adım 3.5) yukarıda tarif. Üreticinin talimatlarına göre proTEV proteaz (Promega) veya AcTEV proteaz (Invitrogen) kullanın. Hsp104 için, biz Hsp104 tam bölünme için gerekli olan: TEV proteaz yüksek oranları bu bulduk. Biz 12μg Hsp104 başına 1 proteaz biriminin bir oran kullanın. Dilinim 2-4 saat süreyle, 16 saat inkübasyon 4 ° C 30 ° C'de olmalıdır Final Hsp104 konsantrasyonu 20-75μM monomer arasında olmalıdır. Ni-sepharose (GE) ile kalan His6 etiketli Hsp104 ve TEV proteaz fazla bölünme tepki Hsp104 miktarı (boncuklar paketlenmiş reçine ml başına protein 15mg bağlayabilirsiniz varsayalım) Ni-sepharose ekleyerek tüketir. 4 2min için 2,000 rpm'de santrifüj boş dönmeye sütun (Bio-Rad) ile boncuk kaldırın ° C Bölünme ve uncleaved protein (Şekil 4) kaldırılmasını sağlamak için SDS-PAGE analizi için bölünme (1μL) öncesi ve sonrası numunelerini.
- MWCO 30.000 Amicon Ultra (Millipore) kullanarak adım 3.5 'te açıklandığı gibi boyut dışlama tampon (20mm Hepes-KOH pH 7.4, 140 KCl, 10mM MgCl 2, 0.1mm EDTA, 1mm DTT) içine Alım Satım.
- Ayrıca boyut dışlama kromatografisi ile Hsp104 arındırmak. Boyut dışlama tampon dengelenmiş Superose 6 veya Superdex 200 sütun (GE) (Şekil 5) kullanın. Enjeksiyondan önce, protein, düşük protein bağlayıcı Millex GP PES Membran 0.22μM şırınga filtresi (Millipore) süzülür. Daha az protein 10mg, 10/300 boyutu sütun (24mL) ve 0.5 ml kesirler toplanır. 10mg daha büyük numuneler için, 12/60 boyutu kolon (120ml) ve 1 ml kesirler toplanan. Akış oranları ve yüklenecek örnek hacmi için üreticinin talimatlarına bakın. Saflaştırma sonrasında, Hsp104 kesirler Şekil toplanmış. 5 ve Amicon Santrifüj Konsantratörü Birimleri (Millipore) yoğunlaşmıştır. Aşağıda açıklandığı gibi Hsp104 saklanır. Tam uzunlukta Hsp104 saflaştırılmış nihai verim kültürünün başlangıç ~ 1-3mg litre Hsp104 bozunma ürünleri ve kirleticiler ayıran malzeme kaybı nedeniyle.
4. Hsp104 Disaggregase aktivitesi
- Arıtma sonra, bir ayrıştırılmasıyla tayininde Hsp104 etkinliğini değerlendirmek için iyi bir uygulamadır. Genellikle, bir lusiferaz reaktivasyonu tahlil 2 (Şekil 6) kullanırlar. Bu testte, HSP70 şaperon sistemi (HSP70 ve Hsp40) disaggregates üre-denatüre ateşböceği lusiferaz agrega 2 ile birlikte Hsp104. Çözünür lusiferaz oxyluciferin, ışık bültenleri bir tepki luciferase oksidasyonunu katalizler. Izleme lüminesans, göreceli reaktivasyonu, ve bu nedenle ayrıştırılmasıyla, lusiferaz tespit edilebilir. Hsp104 HSP70 co-şaperon sistemi ile sinerjik işbirliği mümkün olmalıdır. Kurtarıldı lüminesans miktarı tam HSP70 bağlıdır: Hsp40 çifti kullanılmaktadır. Biz rutin Hsp72 ve Hsp40 (Tahlil Tasarımlar) kullanırlar. Yalnız Hsp40 (Şekil 6): En azından, aktif Hsp104 lusiferaz reaktivasyonu bir Hsp72 ile reaktivasyonuna karşılaştırıldığında 5 kat artış üretmek gerekir. Faaliyet bu seviyeye ulaşmak için başarısız Hsp104 hazırlıkları atılır.
5. Hsp104 Depolama
- Kısa süreli depolama için, Hsp104 4 ° C boyut-dışlanma tampon tutulabilir. Ancak, aktivite, 4 4 ° C ve keskin 1 hafta sonra 2-3 gün sonra azalacak ° C Ayrıştırılmasıyla testlerde Hsp104 arıtma sonra en kısa sürede kullanılması gerektiğini öneriyoruz. İdeal olarak, Hsp104 amiloid ayrıştırılmasıyla deneyleri için hemen kullanılabilir olmalıdır.
- Protein uzun vadeli depolanması gerekiyorsa Hsp104 depolama tampon (20mm Hepes-KOH pH 7.4, 140 KCl, 10mM MgCl 2, 0.1mm EDTA, 1mm DTT,% 10 gliserol (w / v)) değiştirilir. 100μl alikotları sıvı nitrojen içinde dondurulmuş ve -80 ° C'de saklanan ek bileşenini Donma-çözülme çevrimleri Hsp104 aktivite önemli ölçüde azaltmakve bundan kaçınılmalıdır. Biz yavaş yavaş buz üzerinde Hsp104 çözülme tavsiye ederiz. Amiloid-disaggregase faaliyet -80 az 1 ay sonra keskin bir düşüş olacak ° C
6. Temsilcisi Sonuçlar ve Şekiller:
Şekil 1. Hsp104 Bifonksiyonel disaggregase. Düzensiz agrega (solda gösterilen) Disagregasyon HSP70 şaperon sistemi (HSP70 ve Hsp40) 2 işbirliğini gerektirir. Hsp104 remodels in vitro HSP70 ve Hsp40 yardımı olmaksızın amiloid agrega (sağda gösterildiği gibi) emretti, ama HSP70 ve Hsp40 amiloid 26,28 karşı Hsp104 etkinliği artırabilir. Ayrıştırılmasıyla teşvik etmek için merkezi bir kanal aracılığıyla substrat translokasyon Hsp104 çiftler ATP hidrolizi toplu yapılar, her iki tip. Tirozin taşıyan gözenek döngüler, merkezi kanal 49-52 yoluyla servis substrat meşgul .
Şekil 2. Ni-sepharose yakınlık arıtma adım SDS-PAGE analizi. Lizat, Ni Yük, Ni FT ve Ni eluat örnekleri% 4-20 Tris-HCl 1.0mm Kriter jel (Bio-Rad) ve Coomassie vitray kullanarak SDS-PAGE ile fraksiyone . Tüm Hsp104 Ni-sepharose bağlamak mümkün olduğunu unutmayın. Broad Range molekül ağırlığı belirteçleri (Bio-Rad) (şeritli solda) gösterilmiştir.
Şekil 3. Ni-sepharose eluat Kaynak S arıtma Mavi iz 280nm ve yeşil iz absorbans temsil% Tampon S + (maksimum% 50) temsil eder. % 20 oranında elutes ilk zirve, Q + kirleri, bozunma ürünleri ve yanlış katlanmış Hsp104 içerir. Ikinci ve önemli bir zirve düzgün katlanmış ve aktif Hsp104 içerir. Akış hızı 1ml/min idi. % 20-50 Q + Gradient 30 dakika ya da 5 sütun hacimleri. Ankastre: tepe fraksiyonları% 4-20 Tris-HCl 1.0mm Kriter jel (Bio-Rad) ve Coomassie vitray kullanarak SDS-PAGE analizi ile çözümlenir. Broad Range molekül ağırlığı belirteçleri (Bio-Rad) (solda) gösterilmiştir.
Şekil 4. ProTEV proteaz bölünme adım SDS-PAGE analizi, 6-Hsp104 Kaynak S arıtma, 30 ° C daha sonra 4 ° C ve 16 saat 4 saat proTEV proteaz ile tedavi edildi Örnekler% 4-20 Tris-HCl 1.0mm Kriter jel (Bio-Rad) ve Coomassie vitray kullanarak SDS-PAGE ile fraksiyone. ProTEV bölünmüş Hsp104 daha hızlı göç olduğunu unutmayın. Adım 3.7 'de açıklandığı gibi TEV proteaz ve uncleaved Hsp104 Ni-sepharose tükenmiş. Broad Range molekül ağırlığı belirteçleri (Bio-Rad) (solda) gösterilmiştir.
Şekil 5. Hsp104 boyutu dışlanma arıtma Hsp104 Superose 6 jel filtrasyon sütun (10/300, GE) ile saflaştırılmış kesildiler. Debi = 0.4ml/min. Kesik çizgiler arasında zirve toplanmış fraksiyonları temsil eder. Ankastre: tepe fraksiyonları% 4-20 Tris-HCl 1.0mm Kriter jel (Bio-Rad) ve Coomassie vitray kullanarak SDS-PAGE analizi ile çözümlenir. Broad Range molekül ağırlığı belirteçleri (Bio-Rad) (solda) gösterilmiştir.
Şekil 6. Lusiferaz reaktivasyonu tahlil Denatüre ateşböceği lusiferaz agrega (50 nm) Hsp72 ve Hsp40 (1 mikrona kadar) (Testi Tasarımlar hem de), Hsp104 (6μM monomer) veya Hsp104, Hsp72 ve 90 dk için Hsp40 ya da 25 ° C'de inkübe edildi. Denatüre lusiferaz sadece Hsp104 ve Hsp40/Hsp72 varlığı tamamen yeniden. Kurtarılan lüminesans Sonsuz M1000 plaka okuyucu (Tecan) ölçülür. Değerler anlamına gelir ± SEM (n = 3) temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zaman Çizelgesi: maksimum Hsp104 aktivite için tüm arıtma düzeni mümkün olduğunca hızlı bir şekilde tamamlanmış olması tavsiye edilir . Ancak, arıtma adımları her zaman pratik olmayabilir zorlu bir program yapar. Saflaştırma adımları en kısa sürede yapılması durumunda, 30 inkübasyon 2-4 saat gece ifade sonundan itibaren zaman ° C TEV proteaz ile yaklaşık 9-11 saattir. Duraklatmak için potansiyel bir yer TEV bölünme adım takip ediyor. Kesinlikle gerekli ise, Hsp104 ek bileşenini (Adım 5.2) Yukarıda açıklandığı gibi, bu adımdan sonra donmuş olabilir. Çözülme ve biyokimyasal deneyleri için saflaştırılmış Hsp104 sonra hemen kullanılması gerekir, sonra Boyut dışlama kromatografisi (Adım 3.9) hemen ardından yapılır. Ayrıca indüksiyon adım da 37 az 2 saat için aerodinamik ° C Bu azaltmasına karşın genel verim.
Potansiyel komplikasyonlar: Bu arıtma şeması düz ileri. Ancak, birkaç kritik adımlar ve alternatif prosedürler aşağıda tartışılmıştır.
Alternatif hücre parçalama: Fransız Basın mevcut değilse, daha sonra sonication takip lizozim tedavi etkili bir hücre parçalama yöntemidir. Lizis tampon yeniden süspanse hücreleri 1L-hücre pelet başına tavuk yumurta lizozim (Sigma) son bir 2mg/ml lizozim konsantrasyonu buz üzerinde 30 dakika için 20 mg ile inkübe edilir. Hücreler daha sonra bir mikrotip ile 3000 MisonixSonicator kullanarak az iki seviye 9 30 saniyelik patlamaları sonicated. Hücre süspansiyonu sonication patlamaları arasında 1dk için buz üzerinde inkübe edilir. Lizis süspansiyon viskozite ve renk değişiklikleri meydana gelmiştir. (Adım 2.4) Yukarıda açıklandığı gibi hücre artıkları sonra kaldırılır. Fransız basını lizis sonication için tercih edilir, çünkü bu en aza indirir Hsp104 bozulması ve Hsp104 aktivite kaybı.
TEV Proteaz Dilinim: İlginçtir ki, pPROEX-HTB-Hsp104 6 tag TEV proteaz tarafından bölünme özellikle dayanıklı ve üretici tarafından önerilen TEV proteaz yaklaşık iki katı miktar gerektirir. Bu etiketin kaldırılması, tamamen kaldırılmış değilse, O'nun 6-tag Hsp104 disaggregase aktivite ile müdahale pPROEX-HTB olarak esastır. Tamamen işlevsel Onun 6-etiketli Hsp104 gerekiyorsa (örneğin 26 tükenmesi deneyler için) kullanmanızı öneririz Onun 6 etiketli Hsp104 Onun 6-tag disaggregase aktivite 26 etkilemez Schirmer ve Lindquist 47 tarafından açıklanan oluşturmak. Bu protein, TEV bölünme adımı ihmal dışında, yukarıda açıklanan protokol kullanarak saflaştırılmış olabilir.
Yukarıda belirttiğimiz protokol, daha önceki yaklaşımlar 26,47,48 daha uyduruk . Adım hız ve azalmış protein az pertürbasyon için izin verir ve bu nedenle yapısal ve mekanik çalışmaları için son derece Hsp104 uygun arıtılmış ve aktif verimleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH (5T32GM008275 22) ve Amerikan Kalp Derneği (EAS) predoctoral dostluk bir hibe ile desteklenen; Kimya-Biyoloji Arabirimi NIH (2T32GM071339-06A1) (MED) Bursu; ve hibe NIH (1DP2OD002177-01 ve NS067354-0110), Ellison Tıp Vakfı ve Bill ve Melinda Gates Vakfı (JS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BL21-CodonPlus-RIL Competent Cells | Stratagene, Agilent Technologies | 230255 | |
| 2XYT broth | USB Corp., Affymetrix | 75864 | |
| Complete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablets | Roche Group | 1836170 | |
| Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 | |
| Ni-Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5318-02 | |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter units (MWCO 30,000) | EMD Millipore | UFC903008 | |
| Resource Q - 6ml column | GE Healthcare | 17-1179-01 | |
| proTEV Protease | Promega Corp. | V6052 | |
| AcTEV Protease | Invitrogen | 12575015 | |
| Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
| Hsp40 | Assay Designs | SPP-400 | |
| Hsp72 | Assay Designs | ADI-NSP-555 |
References
- Erzberger, J. P., Berger, J. M. Evolutionary relationships and structural mechanisms of AAA+ proteins. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 93-114 (2006).
- Glover, J. R., Lindquist, S. Hsp104, Hsp70, and Hsp40: A Novel Chaperone System that Rescues Previously Aggregated Proteins. Cell. 94, 73-82 (1998).
- Parsell, D. A., Kowal, A. S., Singer, M. A., Lindquist, S. Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hsp104. Nature. 372, 475-478 (1994).
- Vashist, S., Cushman, M., Shorter, J. Applying Hsp104 to protein-misfolding disorders. Biochem Cell Biol. 88, 1-13 (2010).
- Parsell, D. A., Sanchez, Y., Stitzel, J. D., Lindquist, S. Hsp104 is a highly conserved protein with two essential nucleotide-binding sites. Nature. 353, 270-273 (1991).
- Doyle, S. M., Wickner, S. Hsp104 and ClpB: protein disaggregating machines. Trends Biochem Sci. 34, 40-48 (2009).
- Shorter, J. Hsp104: a weapon to combat diverse neurodegenerative disorders. Neurosignals. 16, 63-74 (2008).
- Glover, J. R., Lum, R.
- Mogk, A., Haslberger, T., Tessarz, P., Bukau, B. Common and specific mechanisms of AAA+ proteins involved in protein quality control. Biochem Soc Trans. 36, 120-125 (2008).
- Grimminger-Marquardt, V., Lashuel, H. A. Structure and function of the molecular chaperone Hsp104 from yeast. Biopolymers. 93, 252-276 (2010).
- Sanchez, Y., Lindquist, S. L. HSP104 required for induced thermotolerance. Science. 248, 1112-1115 (1990).
- Sanchez, Y., Taulien, J., Borkovich, K. A., Lindquist, S. Hsp104 is required for tolerance to many forms of stress. Embo J. 11, 2357-2364 (1992).
- Alberti, S., Halfmann, R., King, O., Kapila, A., Lindquist, S. A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins. Cell. 137, 146-158 (2009).
- Halfmann, R., Alberti, S., Lindquist, S. Prions, protein homeostasis, and phenotypic diversity. Trends Cell Biol. 20, 125-1233 (2010).
- Shorter, J., Lindquist, S. Prions as adaptive conduits of memory and inheritance. Nat Rev Genet. 6, 435-450 (2005).
- True, H. L., Berlin, I., Lindquist, S. L. Epigenetic regulation of translation reveals hidden genetic variation to produce complex traits. Nature. 431, 184-187 (2004).
- True, H. L., Lindquist, S. L. A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity. Nature. 407, 477-483 (2000).
- Tyedmers, J., Madariaga, M. L., Lindquist, S. Prion switching in response to environmental stress. PLoS Biol. 6, e294-e294 (2008).
- Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi+]. Science. 268, 880-884 (1995).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Epigenetics in the extreme: prions and the inheritance of environmentally acquired traits. Science. 330, 629-632 (2010).
- Satpute-Krishnan, P., Langseth, S. X., Serio, T. R. Hsp104-dependent remodeling of prion complexes mediates protein-only inheritance. PLoS Biol. 5, e24-e24 (2007).
- Sweeny, E. A., Shorter, J. Prion proteostasis: Hsp104 meets its supporting cast. Prion. 2, 135-140 (2008).
- Lo Bianco, C. Hsp104 antagonizes alpha-synuclein aggregation and reduces dopaminergic degeneration in a rat model of Parkinson disease. J Clin Invest. 118, 3087-3097 (2008).
- Narayanan, S., Walter, S., Reif, B. Yeast prion-protein, sup35, fibril formation proceeds by addition and substraction of oligomers. Chembiochem. 7, 757-765 (2006).
- Savistchenko, J., Krzewska, J., Fay, N., Melki, R. Molecular chaperones and the assembly of the prion Ure2p in vitro. J Biol Chem. 283, 15732-15739 (2008).
- Shorter, J., Lindquist, S. Hsp104 catalyzes formation and elimination of self-replicating Sup35 prion conformers. Science. 304, 1793-1797 (2004).
- Shorter, J., Lindquist, S. Destruction or potentiation of different prions catalyzed by similar Hsp104 remodeling activities. Mol Cell. 23, 425-438 (2006).
- Shorter, J., Lindquist, S. Hsp104, Hsp70 and Hsp40 interplay regulates formation, growth and elimination of Sup35 prions. Embo J. 27, 2712-2724 (2008).
- Doyle, S. M. Asymmetric deceleration of ClpB or Hsp104 ATPase activity unleashes protein-remodeling activity. Nat Struct Mol Biol. 14, 114-122 (2007).
- Wendler, P. Atypical AAA+ subunit packing creates an expanded cavity for disaggregation by the protein-remodeling factor Hsp104. Cell. 131, 1366-1377 (2007).
- Hinault, M. P. Stable alpha-synuclein oligomers strongly inhibit chaperone activity of the Hsp70 system by weak interactions with J-domain co-chaperones. J Biol Chem. 285, 38173-38182 (2010).
- Tipton, K. A., Verges, K. J., Weissman, J. S. In vivo monitoring of the prion replication cycle reveals a critical role for Sis1 in delivering substrates to Hsp104. Mol Cell. 32, 584-591 (2008).
- Bieschke, J., Cohen, E., Murray, A., Dillin, A., Kelly, J. W. A kinetic assessment of the C. elegans amyloid disaggregation activity enables uncoupling of disassembly and proteolysis. Protein Sci1. 8, 2231-2241 (2009).
- Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. 313, 1604-1610 (2006).
- Cohen, E. Reduced IGF-1 signaling delays age-associated proteotoxicity in mice. Cell. 139, 1157-1169 (2009).
- Cushman, M., Johnson, B. S., King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. Prion-like disorders: blurring the divide between transmissibility and infectivity. J Cell Sci. 23, 1191-11201 (2010).
- Carmichael, J. Bacterial and yeast chaperones reduce both aggregate formation and cell death in mammalian cell models of Huntington's disease. Proc Natl Acad Sci. 97, 9701-9705 (2000).
- Vacher, C., Garcia-Oroz, L., Rubinsztein, D. C. Overexpression of yeast hsp104 reduces polyglutamine aggregation and prolongs survival of a transgenic mouse model of Huntington's disease. Hum Mol Genet. 14, 3425-3433 (2005).
- Liu, Y. H. Heat Shock Protein 104 Inhibited the Fibrillization of Prion Peptide 106-126 and Disassembled Prion peptide 106-126 Fibrils in vitro. Int J Biochem Cell Biol. , (2011).
- Wendler, P., Saibil, H. R. Cryo electron microscopy structures of Hsp100 proteins: crowbars in or out. Biochem Cell Biol. 88, 89-96 (2010).
- Wendler, P. Motor mechanism for protein threading through Hsp104. Mol Cell. 34, 81-92 (2009).
- Lee, S., Sielaff, B., Lee, J., Tsai, F. T. CryoEM structure of Hsp104 and its mechanistic implication for protein disaggregation. Proc Natl Acad Sci. 107, 8135-8140 (2010).
- Parsell, D. A., Kowal, A. S., Lindquist, S. Saccharomyces cerevisiae Hsp104 protein. Purification and characterization of ATP-induced structural changes. J Biol Chem. 269, 4480-4487 (1994).
- Schirmer, E. C., Queitsch, C., Kowal, A. S., Parsell, D. A., Lindquist, S. The ATPase activity of Hsp104, effects of environmental conditions and mutations. J Biol Chem. 273, 15546-15552 (1998).
- Schirmer, E. C., Ware, D. M., Queitsch, C., Kowal, A. S., Lindquist, S. L. Subunit interactions influence the biochemical and biological properties of Hsp104. Proc Natl Acad Sci. 98, 914-919 (2001).
- Hattendorf, D. A., Lindquist, S. L. Cooperative kinetics of both Hsp104 ATPase domains and interdomain communication revealed by AAA sensor-1 mutants. EMBO J. 21, 12-21 (2002).
- Schirmer, E. C., Lindquist, S. Purification and properties of Hsp104 from yeast. Methods Enzymol. 290, 430-444 (1998).
- Hattendorf, D. A., Lindquist, S. L. Analysis of the AAA sensor-2 motif in the C-terminal ATPase domain of Hsp104 with a site-specific fluorescent probe of nucleotide binding. Proc Natl Acad Sci. 99, 2732-2737 (2002).
- Lum, R., Niggemann, M., Glover, J. R. Peptide and protein binding in the axial channel of Hsp104. Insights into the mechanism of protein unfolding. J Biol Chem. 283, 30139-30150 (2008).
- Lum, R., Tkach, J. M., Vierling, E., Glover, J. R. Evidence for an unfolding/threading mechanism for protein disaggregation by Saccharomyces cerevisiae Hsp104. J Biol Chem. 279, 29139-29146 (2004).
- Tessarz, P., Mogk, A., Bukau, B. Substrate threading through the central pore of the Hsp104 chaperone as a common mechanism for protein disaggregation and prion propagation. Mol Microbiol. 68, 87-97 (2008).
- Weibezahn, J. Thermotolerance requires refolding of aggregated proteins by substrate translocation through the central pore of ClpB. Cell. 119, 653-665 (2004).
