Summary
Fotólise de compostos enjaulado permite a produção de aumentos rápidos e localizados na concentração de vários compostos fisiologicamente ativos. Aqui, nós mostramos como obter patch-clamp gravações combinado com fotólise de cAMP gaiola ou enjaulado Ca para o estudo da transdução olfativos em dissociada do mouse neurônios sensoriais olfativos.
Abstract
Fotólise de compostos enjaulado permite a produção de aumentos rápidos e localizados na concentração de vários compostos fisiologicamente ativos 1. Caged compostos são moléculas feitas fisiologicamente inativo por uma gaiola química que pode ser quebrado por um flash de luz ultravioleta. Aqui, nós mostramos como obter patch-clamp gravações combinado com fotólise de compostos enjaulado para o estudo da transdução olfativos em dissociada do mouse neurônios sensoriais olfativos. O processo de transdução olfativos (Figura 1) ocorre nos cílios dos neurônios sensoriais olfativos, onde odorant ligação aos receptores leva ao aumento de cAMP que abre nucleotídeo cíclico-gated (CNG) canais 2. Ca entrada através de canais CNG ativa os canais de Ca-activated Cl. Mostramos como dissociar os neurônios do epitélio olfativo do mouse 3 e como ativar canais CNG ou canais de Ca-Cl ativado por fotólise de cAMP enjaulado enjaulados Ca 4 ou 5 </ Sup>. Nós usamos uma lâmpada de flash 6,7 aplicar flashes ultravioleta à região ciliar para libertar da gaiola ou cAMP Ca enquanto patch-clamp gravações são tomadas para medir a corrente em toda a configuração de tensão de células-clamp 11/08.
Discussion
Flash fotólise de compostos enjaulado combinado com patch-clamp gravações é uma técnica útil para obter saltos rápidos e local da concentração de moléculas ativas fisiologicamente dentro e fora das células. Vários tipos de compounds1 enjaulado foram sintetizados, e esta técnica pode ser aplicada a vários tipos de células, incluindo células cultivadas expressar canais iônicos que podem ser ativadas ou moduladas por fotólise de alguns dos compostos disponíveis enjaulado 11.
Fotólise de compostos enjaulado requer pulsos de alta intensidade de luz UV perto de soltar da jaula uma quantidade suficiente de moléculas em um curto espaço de tempo. Várias fontes de luz podem ser usados: uma lâmpada de arco continuamente operada de mercúrio ou xenônio controlado por um obturador e acoplado à porta do microscópio de epifluorescência, uma lâmpada de flash Xenon, um laser UV, e os recentemente desenvolvidos alta potência UV de diodos emissores de luz (LED ). Cada tipo de fonte de luz tem vantagens e desvantagenstagens de acordo com a aplicação específica e para o custo do aparelho. Em comparação com uma lâmpada de flash, as lâmpadas continuamente operado têm uma menor intensidade de luz e, portanto, a duração de pulsos de luz controlada por um disparo precisa ser aumentada até várias centenas de ms para obter uma quantidade suficiente de moléculas uncaged. Lasers UV são muito caros. LEDs de alta potência UV 14 para fotólise flash são recentemente disponível comercialmente e pode fornecer uma boa alternativa a outros métodos. No entanto, uma vantagem das lâmpadas de flash é que eles têm um espectro mais amplo de emissão de UV LEDs, permitindo o uso de vários tipos de compostos enjaulado com diferentes características espectrais As principais vantagens de usar uma lâmpada de Xenon flash para uncaging em nossa aplicação são: um bom resolução de tempo, de fato a duração do pulso de luz é de cerca de 1 ms, um amplo espectro UV que é adequado para fotólise de moléculas com diferentes propriedades fotoquímicas, a possibilidade de escolher a moeda de dez centavosnsion do foco de luz para iluminar a região ciliar; a possibilidade de seleccionar facilmente várias intensidades de luz 6. Além disso, o Xenon flash-lâmpada tem um custo razoável, é facilmente implementado em um eletrofisiológicas set-up, e não requer uma manutenção especial.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adapter module flash lamp to microscope | Rapp OptoElectronic | FlashCube 70 | |
| Air table | TMC | MICRO-g 63-534 | |
| Digitizer | Axon Instruments | Digidata 1322A | |
| Data Acquisition Software | Axon Instruments | pClamp 8 | |
| Data Analysis Software | WaveMetrics | Igor | |
| Mirror for adapter module | Rapp OptoElectronic | M70/100 | |
| Electrode holder | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Faraday’s cage | Custom Made | ||
| Filter cube | Olympus Corporation | U-MWU | Excitation filter removed |
| Flash lamp | Rapp OptoElectronic | JML-C2 | |
| Forceps Dumont #55 | World Precision Instruments, Inc. | 14099 | |
| Glass capillaries | World Precision Instruments, Inc. | PG10165-4 | |
| Glass bottom dish | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | |
| Illuminator | Olympus Corporation | Highlight 3100 | |
| Inverted microscope | Olympus Corporation | IX70 | |
| Micromanipulators | Luigs & Neumann | SM I | |
| Micropipette Puller | Narishige International | PP-830 | |
| Monitor | HesaVision | MTB-01 | |
| Neutral density filters | Omega Optical | varies | |
| Objective 100X | Carl Zeiss, Inc. | Fluar 440285 | Either Zeiss or Olympus |
| Objective 100X | Olympus Corporation | UPLFLN 100XOI2 | Either Zeiss or Olympus |
| Optical UV shortpass filter | Rapp OptoElectronic | SP400 | |
| Patch-clamp amplifier | Axon Instruments | Axopatch 200B | |
| Photo Diode Assembly | Rapp OptoElectronic | PDA | |
| Quartz light guide | Rapp OptoElectronic | varies | We use 600 μm diameter |
| Silver wire | World Precision Instruments, Inc. | AGT1025 | |
| Silver ground pellet | Warner Instruments | 64-1309 | |
| Xenon arc lamp | Rapp OptoElectronic | XBL-JML | |
| Reagent | Company | Catalogue number | |
| BCMCM-caged cAMP | BioLog | B016 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| CaCl2 standard solution 0.1 M | Fluka | 21059 | |
| Caged Ca: DMNP-EDTA | Invitrogen | D6814 | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | C9768 | |
| Concanavalin A type V (ConA) | Sigma-Aldrich | C7275 | |
| CsCl | Sigma-Aldrich | C4036 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D4527 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P1767 | |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | L0649 | |
| MgCl2 | Fluka | 63020 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1274 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| NaPyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 |
References
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