Summary
Fotolyse av caged forbindelser gjør at produksjonen av raske og lokalisert økning i konsentrasjonen av ulike fysiologisk aktive forbindelser. Her viser vi hvordan du anskaffer patch-clamp opptak kombinert med fotolyse av caged cAMP eller bur Ca for studiet av olfactory transduksjon i dissosiert mus olfactory sensoriske nevroner.
Abstract
Fotolyse av caged forbindelser gjør at produksjonen av raske og lokalisert økning i konsentrasjonen av ulike fysiologisk aktive forbindelser en. Caged forbindelser er molekyler laget fysiologisk inaktive ved en kjemisk bur som kan brytes av en flash av ultrafiolett lys. Her viser vi hvordan du anskaffer patch-clamp opptak kombinert med fotolyse av caged forbindelser for studiet av olfactory transduksjon i dissosiert mus olfactory sensoriske nevroner. Prosessen med olfactory transduksjon (Figur 1) foregår i flimmerhårene av olfactory sensoriske nevroner, hvor odorant binding til reseptorer fører til økning av cAMP som åpner syklisk nukleotid-gated (CNG) kanaler 2. Ca oppføringen gjennom CNG kanaler aktiverer Ca-aktivert Cl kanaler. Vi viser hvordan man skal distansere neuroner fra musen olfactory epitelet 3 og hvordan du kan aktivere CNG kanaler eller Ca-aktivert Cl kanaler ved fotolyse av caged cAMP 4 eller bur Ca 5 </ Sup>. Vi bruker en flash-lampe 6,7 til å søke ultrafiolett blinker til ciliary regionen for å uncage cAMP eller Ca mens patch-clamp opptakene er tatt for å måle strømmen i hele-cellers spenning-klemme konfigurasjon 8-11.
Discussion
Flash fotolyse av caged forbindelser kombinert med patch-clamp opptak er en nyttig teknikk for å oppnå raske og lokale hopper i konsentrasjonen av fysiologisk aktive molekyler både innenfor og utenfor cellene. Flere typer bur compounds1 har blitt syntetisert, og denne teknikken kan brukes til ulike typer celler, inkludert dyrkede celler uttrykker ionekanaler som kan aktiveres eller modulert av fotolyse av noen av de tilgjengelige bur forbindelser 11.
Fotolyse av caged forbindelser krever pulser med høy intensitet nær UV-lys for å uncage en tilstrekkelig mengde molekyler på kort tid. Ulike lyskilder kan brukes: en kontinuerlig operert kvikksølv eller xenon arc lampe styres av en lukker og koplet til epifluorescent port av mikroskopet, en Xenon flash lampe, et UV-laser, og den nylig utviklede høy effekt UV lys emitting diode (LED ). Hver type lyskilde har fordeler og vanskeligstiltekurransemessige fortrinn i henhold til den spesifikke applikasjonen og til kostnaden av apparatet. Sammenlignet med en flash lampe, kontinuerlig opererte lamper har en lavere lysintensitet og dermed varigheten av lys pulser kontrollert av en lukker må økes opptil flere hundre ms å få en tilstrekkelig mengde uncaged molekyler. UV lasere er svært kostbart. Høy effekt UV LED 14 for flash fotolyse er nylig kommersielt tilgjengelig og kan gi et godt alternativ til andre metoder. Men en fordel med flash lamper at de har en bredere utslipp spekter enn UV LEDs, som tillater bruk av flere typer bur forbindelser med ulike spektrale kjennetegn De største fordelene å bruke en Xenon-blits lampe for uncaging i søknaden vår er: en god tidsoppløsning, ja varigheten av lyset puls er ca 1 ms; et bredt UV-spekter som er egnet for fotolyse av molekyler med ulike fotokjemiske egenskaper; muligheten til å velge kronension av den lyse flekken til å lyse opp ciliary regionen, muligheten til enkelt å velge forskjellige lys intensiteter 6. I tillegg har Xenon flash-lampe en rimelig pris, er det lett implementeres i en elektrofysiologiske oppsett, og krever ikke spesielt vedlikehold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adapter module flash lamp to microscope | Rapp OptoElectronic | FlashCube 70 | |
| Air table | TMC | MICRO-g 63-534 | |
| Digitizer | Axon Instruments | Digidata 1322A | |
| Data Acquisition Software | Axon Instruments | pClamp 8 | |
| Data Analysis Software | WaveMetrics | Igor | |
| Mirror for adapter module | Rapp OptoElectronic | M70/100 | |
| Electrode holder | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Faraday’s cage | Custom Made | ||
| Filter cube | Olympus Corporation | U-MWU | Excitation filter removed |
| Flash lamp | Rapp OptoElectronic | JML-C2 | |
| Forceps Dumont #55 | World Precision Instruments, Inc. | 14099 | |
| Glass capillaries | World Precision Instruments, Inc. | PG10165-4 | |
| Glass bottom dish | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | |
| Illuminator | Olympus Corporation | Highlight 3100 | |
| Inverted microscope | Olympus Corporation | IX70 | |
| Micromanipulators | Luigs & Neumann | SM I | |
| Micropipette Puller | Narishige International | PP-830 | |
| Monitor | HesaVision | MTB-01 | |
| Neutral density filters | Omega Optical | varies | |
| Objective 100X | Carl Zeiss, Inc. | Fluar 440285 | Either Zeiss or Olympus |
| Objective 100X | Olympus Corporation | UPLFLN 100XOI2 | Either Zeiss or Olympus |
| Optical UV shortpass filter | Rapp OptoElectronic | SP400 | |
| Patch-clamp amplifier | Axon Instruments | Axopatch 200B | |
| Photo Diode Assembly | Rapp OptoElectronic | PDA | |
| Quartz light guide | Rapp OptoElectronic | varies | We use 600 μm diameter |
| Silver wire | World Precision Instruments, Inc. | AGT1025 | |
| Silver ground pellet | Warner Instruments | 64-1309 | |
| Xenon arc lamp | Rapp OptoElectronic | XBL-JML | |
| Reagent | Company | Catalogue number | |
| BCMCM-caged cAMP | BioLog | B016 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| CaCl2 standard solution 0.1 M | Fluka | 21059 | |
| Caged Ca: DMNP-EDTA | Invitrogen | D6814 | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | C9768 | |
| Concanavalin A type V (ConA) | Sigma-Aldrich | C7275 | |
| CsCl | Sigma-Aldrich | C4036 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D4527 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P1767 | |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | L0649 | |
| MgCl2 | Fluka | 63020 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1274 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| NaPyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 |
References
- Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nat. Methods. 4, 619-628 (2007).
- Pifferi, S., Boccaccio, A., Menini, A. Cyclic nucleotide-gated ion channels in sensory transduction. FEBS Lett. 580, 2853-2859 (2006).
- Bozza, T. C., Kauer, J. S. Odorant response properties of convergent olfactory receptor neurons. J. Neurosci. 18, 4560-4569 (1998).
- Hagen, V., Bendig, J., Frings, S., Eckardt, T., Helm, S., Reuter, D. Highly Efficient and Ultrafast Phototriggers for cAMP and cGMP by Using Long-Wavelength UV/Vis-Activation. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 1045-1048 (2001).
- Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations. Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 6571-6575 (1988).
- Rapp, G. Flash lamp-based irradiation of caged compounds. Methods. Enzymol. 291, 202-222 (1998).
- Gurney, A. M. Flash photolysis of caged compounds. Microelectrodes: Theory and Applications. Montenegro, I., Queiros, M. A., Daschbach, J. L. , Proc. NATO Adv. Study Inst. Portugal. (1991).
- Lagostena, L., Menini, A. Whole-cell recordings and photolysis of caged compounds in olfactory sensory neurons isolated from the mouse. Chem. Senses. 28, 705-716 (2003).
- Boccaccio, A., Lagostena, L., Hagen, V., Menini, A. Fast adaptation in mouse olfactory sensory neurons does not require the activity of phosphodiesterase. J. Gen. Physiol. 128, 171-184 (2006).
- Boccaccio, A., Menini, A. Temporal development of cyclic nucleotide-gated and Ca2+ -activated Cl- currents in isolated mouse olfactory sensory neurons. J. Neurophysiol. 98, 153-160 (2007).
- Sagheddu, C., Boccaccio, A., Dibattista, M., Montani, G., Tirindelli, R., Menini, A. Calcium concentration jumps reveal dynamic ion selectivity of calcium-activated chloride currents in mouse olfactory sensory neurons and TMEM16B-transfected HEK 293T cells. J. Physiol. 588, 4189-4204 (2010).
- Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (44), e2189-e2189 (2010).
- Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording. J. Vis. Exp. (37), e1850-e1850 (2010).
- Bernardinelli, Y., Haeberli, C., Chatton, J. Y. Flash photolysis using a light emitting diode: an efficient, compact, and affordable solution. Cell. Calcium. 37, 565-572 (2005).
