Summary
感染プロセス中に、重要なステップは、宿主細胞による病原体の付着です。ほとんどのインスタンスでこの接着ステップは、液体を流すことにより生成される機械的ストレスの存在下で発生します。私たちは、細菌の付着の研究において重要なパラメータとしてせん断応力を導入する手法を説明します。
Abstract
細菌感染の間に相互作用のシーケンスでは、病原体およびそのホストとの間で起こる。宿主の細胞表面への細菌付着がしばしば病因の初期と判断するステップである。実験的に接着が主に静的な条件で検討されていますが、密着性は実際に液体を流れるの存在下で行われます。細菌とその宿主との間の最初の出会いは、多くの粘液は、上皮細胞の表面に沿って流れる粘膜レベル、口、肺、腸、目、などで発生します。後感染症における、病原体は時折そのような敗血症、敗血症や髄膜炎など生命を脅かす病気を引き起こす血液の循環をアクセスする。これらの感染症の決定的な特徴は、血液の循環の存在下で内皮細胞と相互作用するこれらの病原体の能力である。それは病原体に対する機械的な力を生成するので、例えば、液体、粘液や血液を流れるの存在は、密着性を決定する。液体つを流れるの影響を特徴づけるためには、通常ダイン/ cm 2で表される固定壁の近くに移動する流体によって単位面積当たりの行使接線力であるせん断応力の概念、を指します。せん断応力の強度が異なる容器の種類、サイズ、オルガン、場所等（0-100ダイン/ cm 2）に応じて大きく異なります。毛細血管の循環は非常に低いせん断応力の値に到達しても一時的に数分を1に数秒の間の範囲の期間中に停止することができます。細動脈におけるスペクトルのせん断応力のもう一方の端に100ダイン/ cm 2に達することができます。異なる生物学的プロセスでせん断応力の影響が明らかに内皮3白血球の相互作用の中に、インスタンス用として実証されています。細菌付着の過程で考慮に入れて機械的なパラメータを取るように私たちは使い捨てのフローチャンバー4の使用に基づいて、実験手順の利点を取った。宿主細胞は、フローチャンバーで栽培され、蛍光細菌は、シリンジポンプによって制御フローに導入されています。我々は当初、細菌性病原体髄膜炎菌 、敗血症や髄膜炎の責任グラム陰性菌に私たちの調査を集中。セル1に付着し、細胞表面5に増殖すると、新しいサイト6（図1）植民地化するデタッチする：手順は、私たちは細菌の能力へのせん断応力の影響を研究するために許可されてここで説明する。補完的な技術情報は、参考文献7に記載されています。ここで紹介するせん断応力の値は、文献に見られる値を表すために私たちのこれまでの経験1とに基づいて選択されました。プロトコルは、研究の目的に応じて、特定の調整を行っている病原体の広い範囲に適用可能であるべきである。
Protocol
1。ヒト宿主の細胞と細菌培養
- 継代1および5％（v / v）のCO 2の加湿インキュベーター中37℃で9の間の文化HUVECを。継代細胞は使い捨てのフローチャンバー（μ-スライドVI）の75 cm 2の培養フラスコや実験的な文化にメンテナンス文化を提供するために、トリプシン/ EDTAで80％コンフルエントに近づくとき。
- 継代するフラスコから培地を撤回、10mlのPBSで細胞を洗浄、トリプシン/ EDTA 1.5mlでそれを撤回し、交換してください。細胞は37℃で5分間インキュベーター、細胞培養にデタッチすることができます
- 15 mlのコレクションチューブに細胞培養培地の10mlで細胞を集めます。ペレットを室温で5分間の遠心分離（200 gで）、を持つ細胞。遠藤- SFMの4 mlに細胞をサスペンドは、製造業者の指示に従って、10％（v / v）のFBSで補充しMalassez室でそれらを数える。
- チャネルへミリリットル懸濁液（3 × 4個 ）当たり1 × 10 6 HUVEC細胞30μlを紹介し、細胞が5％の雰囲気で加湿インキュベーター中、37 °（V / V）CO 2で3時間付着することができます。井戸を埋めるために遠藤- SFMの120μlの追加のボリュームを追加します。細胞はサブコンフルエント単層（図2）を形成すべきである。
- Nを成長するケロッグのサプリメントと37クロラムフェニコールの5μg/ mlを含むGCB寒天プレート上髄膜炎を発現するGFP（IPTG誘導性プロモーターの制御下で、この場合のひずみ8013表現GFPで）、· V / 5％（含む湿った大気中のC V）16時間CO 2。
2。宿主細胞への個々の細菌の初期付着
- 予め温めておいた遠藤- SFMは、37℃で120分間を10％（v / v）FBSとインキュベートを含む° Cを5％（V /を含む湿った雰囲気の中で、0.05のOD600にGCB寒天プレート上で成長させた細菌の濃度を調整します。 v）を穏やかに振盪（130 rpm）の下でCO 2、。全体の潜伏期間のための培養液中に1mMのIPTGを添加することによりGFPの発現を誘導。
- 37℃で試料温度を維持するために加熱されたプラットフォームを搭載した倒立顕微鏡℃の舞台上で使い捨てのμ-スライドを配置
- 無菌ガラスビーカーに2％（v / v）のFBS添加予め温めておいた遠藤- SFMを注ぎ、この培地で無菌50mlの注射器を埋める。注射器に"エントリ"チューブを接続し、培地を導入することで埋める。
- チャンバー内に空気を導入避けるために、慎重に、μ-スライドする"エントリ"チューブを接続します。その後、慎重に貼付、もう一方の端に"出口"チューブとはチャンバー"出口"から約1 cmの距離に培地を使用してチャネルを埋める。
- 細菌のOD600を測定し、遠藤- SFMは2％（v / v）のFBSを含むで0.15に調整する。個々の細菌を見るためには、任意の凝集体が細菌サンプルの積極的なボルテックスによって破壊されている必要があります。
- 遠藤- SFMの代わりに100μlのは、タンクに2％（v / v）のFBS培地を補給し、残りの細菌の集合体のサンプリングを避けるためにボルテックスソリューションの上部から採取した菌液100μLを加える。
- 慎重にチャンバー内に細菌を注入するためにコックを回して、μ-スライドに200μlのボリュームをご紹介。
- 15分間0.044ダイン/ cm 2の密着性と互換性のせん断応力とシリンジポンプを用いてチャンバーに2％（v / v）のFBS、37℃に維持温水プラットフォームでCを含む遠藤- SFMをご紹介。
ビデオ1または図3の例を参照してください。このステップの後、いずれかのセクション3、4または6に移動します。
3。宿主細胞への個々の細菌の初期付着の定量化
- 液体がまだ循環している間15分間の初期接着した後、ランダムに10個のフィールドの画像を取得する。
- フィールドあたりのadherant細菌の平均数をアクセスするためには、ImageJのソフトウェア8を 、使用して取得された画像を分析する。これは、次のように行われます：まず第一に、各イメージは、細胞からバックグラウンドを最小限に抑えながら、個々の付着蛍光細菌を強調するために"イメージ"メニューにある"しきい値"ウィンドウを使用して閾値処理される。その後、一つ一つの細菌は、プラグインを使用して、"セルカウンター"（で、カウントされますhttp://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html ）。各画像のデータはExcelスプレッドシートで報告され、フィールドごとの付着性細菌の平均数を定量化するために平均化されています。
4。宿主細胞への付着性、個々の細菌の流れに抵抗の測定
- プログラムは、シリンジポンプは、5分間3から100ダイン/ cm 2の範囲のせん断応力を生成するために、セットアップ。
- 5分の終わりには、ステップ3.1で説明したようにランダムに選ばれた10個のフィールドを取得するとして、その流れでPRを停止買収にIOR。
- ステップ3.2で説明したように取得された画像を分析し、フィールドごとに、残りの細菌の平均数を定量化する。
5。微小コロニーに分離された付着細菌の成長を測定する
- 数時間のために選ばれたせん断応力とシリンジポンプを用いてチャンバー内に10％（v / v）のFBS、37℃に維持温水プラットフォームでCを含む遠藤- SFMをご紹介。一つのフレームでのリアルタイムビデオ顕微鏡のための記録画像は5分ごと。
- ビデオ顕微鏡に続いて、シリンジポンプをオフにすることで、せん断応力を停止、2-3追加の画像を取得し、ソフトウェアでの画像取得シーケンスを停止します。細菌の増殖の例は、ビデオ2で見ることができます。
6。付着細菌microcoloniesの流れに抵抗の測定
- 細胞表面上に大規模なmicrocoloniesの形成後（step5.2）フローのアプリケーションの前に2〜3の両方の細胞の画像（位相コントラストによる）と細菌を（GFP蛍光により）取得。実験の残りの部分では、買収のプロトコルは、蛍光のみを監視します。
- 5秒ごとに一つのフレームで5分（300〜100ダイン/ cm 2）と記録的なイメージのために高いせん断応力を加える。
- シリンジポンプをオフにすることで、せん断応力を停止、2-3追加の画像を取得し、ソフトウェアでの画像取得シーケンスを停止します。
- 次に、最初の"出口"チューブを外し、慎重に、チャネルを空にしないようにしてから、"エントリ"チューブを取り外す前に、井戸を埋めるために予め温めておいた新鮮な培地を加える。
- 定量的に細菌の抵抗でせん断応力の影響を判断するには、メッキのアッセイは次のように実行することができます：残りの培地を収集し、チャネルから、残りの培地を除去する（両方の洗浄があるPBS120μlの、で二回μ-スライドを洗うまた、収集された）。
- 37℃で5分間トリプシン/ EDTAを50μlを添加して感染細胞を剥離し、前のステップで収集した懸濁液を用いてこの分離されたサンプルを混ぜる。
- 37プレートのインキュベーション後、翌日の単位（CFU）を形成するコロニーの数を決定するために、PBSとプレート三重のGCB寒天プレート、、上に10μlの割合で希釈系列を行います°のインキュベーターでC 5％（v / v）のCO 2。
動画3と4はpilV変異体と野生型の菌株を比較する。
7。 microcoloniesからバクテリア分離
- 2.8手順2.1を繰り返して、フローチャンバーで細胞に感染し、感染は30分間続行することができます。
- 2分の期間は10ダイン/ cm 2に流量を増加させることにより未結合の細菌を除去し、感染が2時間継続することができます。
- 0.15ダイン/ cm 2までの流れを減らす。
- 毎時間、フローチャンバーから出てくる培地のドロップを集める。
- GCB寒天プレート上のサンプルとプレート、それらの段階希釈を行います。
- 37プレートのインキュベーション後、翌日のコロニー形成単位の数（CFU）、℃インキュベーター内で5％（v / v）のCO 2とを決定する。
8。代表的な結果
図1：手続きの流れの存在下で観察して測定できる携帯単分子層のさまざまなステップ。
図2：実験（せん断応力の欠如）の先頭にフローチャンバ内の内皮細胞単層。約50内皮細胞はサブコンフルエント単層で構成されています。
図3：細胞表面上の細菌の初期付着のグラフィック表現。 3つのフィールドの値は（0044ダイン/ cm 2）期待されるフィールド間の変動のアイデアを与えることが示されている。
ビデオ1。時間の関数（0044ダイン/ cm 2）のような細胞単層上の細菌の初期付着の可視化。 GFPを発現する細菌が流れる媒体の方向に従っている。フィルムが60倍に加速され、ビデオの実際の持続時間は10分です。
ビデオを見るにはここをクリック。
ビデオは2。初期付着菌後7時間の期間のための細胞の表面（1000倍加速）で増殖させた。
ビデオを見るにはここをクリック。
ビデオ3。増殖後、細胞表面上の整備士microcoloniesのアル抵抗は5分を10ダイン/ cm 2にせん断応力のレベルを増加させることによって試験が野生型のmicrocoloniesは60倍加速耐性がありますした。
ビデオを見るにはここをクリック。
pilV変異体によって形成されたビデオ4。Microcoloniesは、フローの増加（10ダイン/ cm 2）によって破壊されています。この変異体は、microcolonies下の原形質膜のリモデリングを誘導するために失敗し、そのためより多くのずり応力の増加（ビデオは60倍に高速化されている）5に非常に敏感です。
ビデオを見るにはここをクリック。
Discussion
せん断応力のと、一般的に生物学における力学的側面の重要性がますます認識されています。例えば、リンパ球の接着と血管壁に圧延の過程におけるタンパク質のセレクチンファミリーの高度に適応した接着剤の特性は、プロセス内のせん断応力を導入することによって認識されている。上記の手順は、グラム陰性菌のナイセリア髄膜炎菌に適用されたが、病原体の広い範囲に適用可能であるべきである。せん断応力の重要性は、他の病原体や他の感染部位にも示されている。せん断応力によって条件付け細菌付着は、尿路病原性大腸菌 （UPEC）9日に発見さFimHアドヘシンの研究によって記述されています。セレクチンと同様に、FimHとその宿主細胞の受容体間の相互作用は、せん断誘起の機械的な力9によって強化されることが示されたと毒素原性大腸菌のCfaEアドヘシンは、せん断依存を経由して腸上皮細胞への接着を媒介することも報告されている機構10。我々は、ストレプトコッカスagalactiae毛が流れの条件11の下上皮細胞にこの病原体の付着のために不可欠であることをこの章で説明する層流チャンバーアッセイのプロトコルを使用して、報告した。このような研究は私たちのフローチャンバーアッセイは、せん断応力の条件下で宿主細胞 - 病原体相互作用を調査するための有用なツールであることを確認してください。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
著者らは、プロシージャの起動、初期設定のためにエミリーMaireyとエマニュエルDonnadieuに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| μ-Slide VI0.4 flow kit | IBIDI | 80606 | |
| Syringe Plastipak 50 ml Luer-Lock | BD Biosciences | 300865 | |
| Tygon Tubing R3603 3.2 x 4.8mm | Fisher Scientific | R3603 | |
| 3-way stopcock, 2 female luer to male luer | Bio-Rad | 7328103 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | |
| Inverted microscope, Nikon | Nikon Instruments | Eclipse Ti | |
| CCD camera | Hamamatsu Corp. | ORCA 285 CCD or ORCA 3-CCD | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | Freeware (http://rsbweb.nih.gov/ij/) |
References
- Mairey, E. Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier. J Exp Med. 203, 1939-1950 (2006).
- Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P.
- Zarbock, A., Ley, K. Neutrophil adhesion and activation under flow. Microcirculation. 16, 31-42 (2009).
- Tissot, O., Pierres, A., Foa, C., Delaage, M., Bongrand, P. Motion of cells sedimenting on a solid surface in a laminar shear flow. Biophys J. 61, 204-215 (1992).
- Mikaty, G. Extracellular bacterial pathogen induces host cell surface reorganization to resist shear stress. PLoS Pathog. 5, e1000314-e1000314 (2009).
- Chamot-Rooke, J. Posttranslational modification of pili upon cell contact triggers N. meningitidis dissemination. Science. 331, 778-782 (2011).
- Soyer, M., Dumínil, G. Bacterial adhesion under shear stress. Neisseria meningitidis: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). Christodoulides, M. , Humana Press Inc. New York. (2011).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J.
- Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force. Cell. 109, 913-923 (2002).
- Tchesnokova, V. Shear-enhanced binding of intestinal colonization factor antigen I of enterotoxigenic Escherichia coli. Mol Microbiol. 76, 489-502 (2010).
- Konto-Ghiorghi, Y. Dual role for pilus in adherence to epithelial cells and biofilm formation in Streptococcus agalactiae. PLoS Pathog. 5, e1000422-e1000422 (2009).
