Summary
De complete bouw van een aangepaste, real-time confocale scanning imaging-systeem is beschreven. Dit systeem, dat gemakkelijk kan worden gebruikt voor video-rate microscopie en microendoscopy, zorgt voor een scala aan imaging-geometrieën en toepassingen die niet toegankelijk zijn met behulp van standaard commerciële confocale systemen, tegen een fractie van de kosten.
Abstract
Confocale microscopie is uitgegroeid tot een onmisbaar hulpmiddel in de biologie en de biomedische wetenschappen, waardoor een snelle, hoge gevoeligheid en hoge-resolutie optische sectie van complexe systemen. Confocale microscopie wordt routinematig gebruikt, bijvoorbeeld om specifieke cellulaire doelwitten 1, monitor dynamiek studie in levende cellen 2-4, en de driedimensionale ontwikkeling van de hele organismen 5,6 visualiseren. Uitbreidingen van confocale beeldvormende systemen, zoals confocale microendoscopes, zorgen voor hoge resolutie imaging in vivo 7 en worden momenteel toegepast op de ziekte van beeldvorming en diagnose in klinische settings 8,9.
Confocale microscopie biedt drie-dimensionale resolutie door het creëren van zogenaamde "optische secties" met behulp van eenvoudige geometrische optica. In een standaard wide-field microscoop, is fluorescentie gegenereerd op basis van een monster verzameld door een objectief en doorgegeven rechtstreeks naar een detector. Terwijl het accepterenstaat voor beeldvorming dunne monsters, dik stalen vertroebeld door fluorescentie gegenereerd boven en onder de doelstelling focal plane. In tegenstelling, confocale microscopie in staat stelt virtueel, optische sectie van de monsters, verwerpen out-of-focus licht om een hoge resolutie drie-dimensionale representaties van de monsters te bouwen.
Confocale microscopen bereiken prestatie met behulp van een confocale opening in de detectie stralengang. De fluorescentie verzameld uit een steekproef door de doelstelling is terug doorgestuurd via het scannen spiegels en door de primaire dichroïsche spiegel, een spiegel zorgvuldig geselecteerd om kortere golflengten, zoals de laser excitatie straal reflecteren, terwijl het passeren van de langere, Stokes-verschoven fluorescentie-emissie. Deze lange-golflengte fluorescentie-signaal wordt vervolgens doorgegeven aan een paar lenzen aan weerszijden van een pinhole die is gepositioneerd op een vliegtuig precies conjugaat met het brandvlak van het objectief. Fotonen verzameld uit de focale volume van het object worden gecollimeerdedoor het objectief en gericht door de confocale lenzen door het gaatje. Fluorescentie opgewekt boven of onder het brandvlak zal daarom niet goed gecollimeerd, en zullen niet door de confocale pinhole 1, het creëren van een optische gedeelte waarin alleen het licht van de microscoop focus is zichtbaar. (Afb. 1). Dus de pinhole werkt doeltreffend als een virtuele opening in het brandvlak, beperken de gedetecteerde emissie naar slechts een beperkte ruimtelijke locatie.
Moderne commerciële confocale microscopen bieden de gebruikers volledig automatische bediening, waardoor voorheen complexe beeldvormende procedures relatief eenvoudig en toegankelijk. Ondanks de flexibiliteit en kracht van deze systemen, zijn commerciële confocale microscopen niet goed geschikt voor alle confocale beeldvorming taken, zoals veel in vivo imaging-toepassingen. Zonder de mogelijkheid om op maat gemaakte beeldvormende systemen te creëren om hun behoeften te voldoen, kan belangrijke experimenten uit te blijven van de reach voor veel wetenschappers.
In dit artikel geven we een stap-voor-stap methode voor de complete bouw van een aangepaste, video-rate confocale imaging systeem van basis-componenten. De oprechten microscoop zal worden gebouwd met behulp van een resonante galvanometrische spiegel om het snel scannen as bieden, terwijl een standaard snelheid resonante galvanometrische spiegel zal de langzame as scan. Voor het maken van een precieze gescand balk in de objectieve lens focus, zullen deze spiegels worden geplaatst op de zogenaamde telecentrische vliegtuigen met behulp van vier relais lenzen. Confocale Detectie zal worden uitgevoerd met behulp van een standaard, off-the-shelf fotomultiplicatorbuis (PMT), en de beelden zullen worden vastgelegd en weergegeven met behulp van een Matrox framegrabber-kaart en de meegeleverde software.
Protocol
De keuze van de laser golflengte, dichroïsche spiegel en optische filters moeten worden bepaald op basis van de specifieke kleurstoffen worden gebruikt in het experiment. Bijvoorbeeld, is confocale beeldvorming van een monster gekleurd met Alexa Fluor 488 best bewerkstelligd met behulp van een 488 nm laser, een 500 nm lange-pass dichroïde spiegel, en een 30 nm bandbreedte bandpass spiegel gecentreerd op 515 nm. In tegenstelling, zou confocale beeldvorming van de rode kleurstof Alexa Fluor 647 vereisen een andere set van componenten. De microscoop in dit protocol werd gebouwd aan een kleurstof die sterk absorbeert bij 400 nm en 450 nm uitzendt verder te visualiseren. We hebben daarom gekozen voor een 406 nm excitatie-laser en een 425 nm lange-pass dichroic aan de laserstraal te reflecteren. Opgewonden fluoroforen kunnen selectief worden verbeeld door het selecteren van de juiste emissie-filters. Het is belangrijk om een goede optische bevestigingsmateriaal gebruik in de gehele protocol waar aangegeven, onjuist of geïmproviseerde hardware zal niet in het bezit uitlijning zo goed en kan een gevaar voor de veiligheid zijn.
<p class = "jove_title"> 1. Het opzetten van de resonante galvanometrische spiegel en relais optiekEen belangrijk concept in het bouwen van elke vorm van confocale scanning systeem is telecentricity. In een telecentrisch optisch systeem, zijn lenzen op afstand van elkaar door de som van hun brandpuntsafstanden, zodanig dat de vergroting van het systeem gewoon wordt bepaald door de verhouding van de brandpuntsafstanden 1. Dit maakt de bouw van een optisch relais systeem waar de vergrotingen, en daarmee de eigenschappen van het systeem, gemakkelijk worden bepaald door de keuze van de lenzen. Een ander belangrijk concept bestaat uit de zogenaamde 'stationaire' optische vlakken, ook wel aangeduid als 'diafragma vliegtuigen ". Een opening vliegtuig is een positie langs de optische pad waar de lichtstraal ondergaat geen enkele vorm van laterale beweging. In deze microscoop ontwerp, zijn er drie belangrijke opening vliegtuigen: de eerste en tweede scan spiegels, en de back-diafragma van het objectief. Met het oog op een optimale straal sca te bereikennning in het brandvlak van de doelstelling, moet de bundel via de achterkant diafragma van het objectief worden stationair, vegen alleen maar in de hoek. Om dit stationaire, hoek-swept vlak te maken, moeten we de eerste en tweede scan spiegels op conjugaat, telecentrische vliegtuigen plaats om de doelstelling te back-diafragma. Lenzen geplaatst tussen de spiegels en het objectief dienen om de hoek relay-gescande straal tussen deze stilstaande vliegtuigen (afb. 2). Het scannen spiegels zijn gemonteerd op twee scanning galvos, die elk is verantwoordelijk voor het scannen van een bepaalde richting van de imaging-vliegtuig (X en Y). Voor het verkrijgen van de gewenste lijn scan rate voor video-rate imaging, is een hoge frequentie resonant galvo nodig is om de x-as (ook bekend als de "snelle" as) te scannen. Deze galvos maken gebruik van een gevoelige, closed-loop feedback-schakeling naar een sinusvormige scan patroon te maken en zijn in staat om te werken bij zeer hoge frequenties, selecteerden we een 8 kHz galvo voor deze te bouwen.
- Instellende vezel collimator in de optische berg en ongeveer sturen de bundel met behulp van de stelschroeven zodanig dat het reizen in een rechte lijn zowel horizontaal als verticaal. Neem nu een iris en plaats deze in de voorkant van de vezel collimator, het aanpassen van verticale hoogte van de iris is zodanig dat de bundel netjes loopt door de iris centrum. Vervolgens beweegt de iris weg van de collimator langs de stralengang en goed opletten of de bundel nog steeds reist door de iris centrum. Zo niet, stel de straal positie op de iris met de twee stelschroeven.
- Plaats de gemonteerde dichroïsche spiegel in de bundel pad met de laserstraal zich op ongeveer het midden van de spiegel. Voor klemmen de spiegel naar de tafel, draait de spiegel houder aan de straal van ongeveer 90 graden weer te geven en aan te passen ruwweg de reflectie, zodat de gereflecteerde laserstraal van de verticale hoogte niet verandert.
- Plaats een gemonteerde resonante galvanometrische spiegel in de laserstraal pad, waarbij de autoe ervoor te zorgen dat de laserstraal is geplaatst op het exacte horizontale midden van de spiegel oppervlak. In dit protocol werd de resonante galvo spiegel direct expoxied om een spiegel te monteren. Draai de spiegel monteren aan de laserstraal reflecteren op een hoek van 90 graden. Ruwweg aanpassen van de reflectie van de spiegel om dezelfde laserstraal verticale hoogte te houden.
- Om elke lichtstraal direct in een bepaalde richting, moet men definiëren per definitie twee punten in de ruimte, waardoor de straal zal reizen. Dit wordt meestal bereikt door het plaatsen van twee irissen langs de gewenste horizontale en verticale pad en het manipuleren van de laserstraal om door het midden van elke iris. Vier graden van vrijheid zijn nodig om de bundel aan te passen; twee horizontale en verticale graden van vrijheid voor elke iris. De meest voorkomende en eenvoudige manier om deze graden van vrijheid te bereiken is het gebruik van twee spiegels om te sturen, of 'lopen', een laserstraal.
Neem twee irissen, en stel hun verticale hoogte alsin stap 1.1, met behulp van de laserstraal gereflecteerd door het resonante galvo spiegel als een referentie. Nu, met behulp van de schroefgaten op de optische breadboard als een gids voor het oog, naar beneden klem de twee irissen in een rechte lijn. - Pas de dichroïsche spiegel en resonant galvo spiegel om de laserstraal te sturen door het midden van de twee irissen. Gebruik de eerste spiegel in het pad (de dichroïsche spiegel) tot het centrum van de bundel op de eerste iris, dan de tweede spiegel in het pad (de resonerende galvo spiegel) te gebruiken om het centrum van de straal op de tweede iris. Iteratief aanpassen van deze twee spiegels totdat de bundel is uitgelijnd door beide irissen, zodat het hele dat de laserstraal gereflecteerd door de resonerende galvo spiegel nog steeds is terug te vinden van het geschatte spiegel centrum. Als de straal is afgeweken, past u de vezel collimator monteren en herhaalt u de bovenstaande iteratieve stappen.
- Met de bundel gecentreerd op beide irissen, zullen we nu plaats de twee relais lenzen die image onze eerste stationaire, telecentrische plannene (dat wil zeggen, de resonante galvo spiegel) op onze seconden stilstaat, telecentrische vliegtuig (dat wil zeggen, de standaard snelheid galvo spiegel). Voor deze microscoop, de gekozen contactlenzen in de eerste relais op dezelfde brandpuntsafstand, "f" hebben, dus de afstand tussen de twee spiegels in onze telecentrische systeem is gewoon 4f. Om ervoor te zorgen dat de lenzen precies gecentreerd zijn in de bundel pad, gebruik maken van de lens uitlijning truc. Plaats de eerste lens in de bundel pad en kijken naar de laserstraal plek op de iris volgende in de lichtbaan naar aanleiding van de lens. Pas vervolgens de lens hoogte verticaal, zodat het verticale midden van de balk is in de iris centrum. Tot slot, past u de horizontale balk staat tot het centrum van de straal op de iris. Voer dezelfde procedure voor de tweede lens.
2. Het opzetten van de tweede scan spiegel en draaien van de microscoop
- Om de exacte positie van de tweede telecentrische vliegtuig, het aansluiten van de resonerende galvo aande scanning unit en zet hem aan. Gebruik een witte visitekaartje aan de aftaststraal spoor door de twee lenzen. U vindt de telecentrische vliegtuig op de geschatte afstand van 4f van de resonerende galvo, waar de laserstraal zal verschijnen volledig stilstaat. Markeer deze positie op de breadboard.
- Plaats de standaard scanning galvo spiegel op dit exacte telecentrische vliegtuig locatie, en pas de spiegel hoogte en zodanig dat de bundel op de telecentrische vliegtuig precies in het midden van de scanning spiegel stakingen. Het is cruciaal om de macht van de spiegel controle hardware en een spanning van 0 volt op de scanner spiegel ingang gezet, zodat de spiegel bezinkt in de neutrale positie tijdens dit proces. Voorzichtig aan te passen hoek van de spiegel aan de balk verticaal directe, en voorzichtig draai de spiegel op zijn plaats.
- Zoals we bouwen een rechtopstaande microscoop, zullen we nu hechten de tweede breadboard op een hoek van 90 graden met 90 graden beugels. Zorg ervoor dat uit te schakelende laser en scannen elektronica, koppelt u de vezel, en koppel de scanning spiegels tijdens dit proces. Om de rest van de afstemming eenvoudiger, zodra de beugels worden vastgeschroefd in de plaats, voorzichtig draai de hele microscoop, zodat de nieuwe breadboard nu plat ligt. Gebruik een klem om de breadboard bevestigen aan het werkblad. Nu de rest van de voormalige verticale setup kan gemakkelijk worden uitgevoerd op het vlakke breadboard.
3. Het opzetten van de scan, buis en objectieven
Vervolgens gaan we het opzetten van de tweede set van het relais lenzen, formeel aangeduid als de "scan lens" en "tube lens". Het is belangrijk om te kiezen van de juiste combinatie van lenzen om de juiste vergroting op het doel gericht te bereiken en het optimaliseren van de uiteindelijke beeldresolutie. Ten eerste, de maximale numerieke apertuur (NA) van een bepaalde doelstelling lens bereiken, moet de laserstraal het slaan van de achterkant van de doelstelling vullen deterug diafragma volledig, alleen dan zal het objectief in staat zijn om de kleinste focus te creëren. Objectief lenzen hebben een bereik van back opening maten; gekozen voor een lens vergrotingsfactor iets te vol de achterkant opening van de geselecteerde doelstelling. Ten tweede, om de juiste vergroting te bereiken, moet het objectief worden afgestemd met de buis brandpuntsafstand van het objectief waarvoor het is ontworpen. Jammer genoeg hebben verschillende microscoop doel fabrikanten ervoor gekozen om verschillende buizen lens brandpuntsafstand te gebruiken, dus is het belangrijk om een microscoop te bouwen met de juiste buis lens voor het specifieke gebruikte objectief. Bovendien zijn bepaalde fabrikanten, zoals Zeiss, ontwerp hun buis lenzen ter compensatie van de specifieke chromatische aberraties van hun afgedekte doelstelling, zoals dat het gebruik van een onjuiste objectief-lens tube pair in feite nieuwe afwijkingen die anders niet zou aanwezig zijn introduceren. Geven wij de voorkeur Olympus doelstellingen, zoals alle chromatische compensatie is uitgevoerd in the doel zelf, waardoor het objectief / lens tube paring gemakkelijker. Hoewel de microscoop werkt nog steeds als de doelstelling en de buis lens niet overeenkomen, zal de eigenlijke microscoop vergroting waarschijnlijk niet overeen met de vergroting die op het objectief. Voor deze bijzondere microscoop te bouwen, was de optimale grootte van het diafragma terug vastbesloten om 4 mm te zijn, waarbij een vergroting 01:04 verhouding tussen de scan-lens en de buis lens. Voor deze aangepaste microscoop te bouwen, zullen we gebruik maken van een scan lens lengte van 75 mm en een tube lens lengte van 300 mm.
- Aangezien de totale afstand tussen de tweede scan spiegel en objectieve focus is groot, dit segment van de microscoop te bouwen zal eerst lay-out de spiegels die nodig is om de bundel te sturen aan de doelstelling lens. Plaats de eerste grote, 2 "(50 mm) diameter spiegel dicht bij de rand van het bord, en draai de spiegel monteren aan de laserstraal ongeveer 90 graden weer te geven. Ruwweg aanpassen van de reflectie van de spiegel om dezelfde hoogte te houden beam hoogte. Plaats de andere 2 "spiegel aan de tegenoverliggende rand van de breadboard op een oriëntatie die de bundel richt naar beneden op een hoek van 90 graden. Gebruik de stelschroeven om ervoor te zorgen van de bundel verticale hoogte verandert niet. Stel twee irissen, zoals in stap 1.4, en pas de twee spiegels zoals aangegeven in stap 1.5 tot het centrum van de straal op de irissen.
- Met de irissen nog op zijn plaats, plaats de scan lens in de bundel pad en pas de horizontale en verticale positie tot het centrum van de laser plek op de eerste iris. Op een afstand van 75 mm + 300 mm van de lens (tussen de twee spiegels), plaatst u voorzichtig het grote 2 "buis lens en pas de horizontale en verticale positie te midden van de balk op de eerste iris. Ten behoeve van het handhaven van aanpassing in de toekomst, is het nuttig om deze irissen laten zitten, voor deze toepassing, een visitekaartje met een geschikte grootte gat zou kunnen worden verlijmd op een staan en opgenomen in de bundel pad.
- Met alle spiegels en lenzennu op zijn plaats, beginnen met het scannen van de resonante galvo spiegel en de standaard scanning spiegel. In deze build, zal de standaard scan spiegel uiteindelijk gesynchroniseerd met de scan snelheid van de resonante spiegel door middel van een custom-built controle circuit, zoals beschreven in figuur 3, dit zorgt voor een superieure verticale en horizontale synchronisatie. Echter, voor de afstemming doeleinden en tal van imaging-toepassingen, kan de spiegel eenvoudig worden gescand met behulp van een zaagtand patroon van een functie generator. Met behulp van een visitekaartje, zoekt u de laserstraal op een ligging: op 300 mm na de buis lens. Hoewel de bundel is elders in het scannen van de microscoop in zowel de verticale als horizontale richting, moet de balk perfect stationair de buurt van deze locatie. Dit is waar de achterkant diafragma van het objectief wordt geplaatst. Als de horizontale en verticale vlakken stationaire niet samenvallen op hetzelfde vlak langs de stralengang, zorgvuldig ontspan en vertalen de buis lens langs de optische pad om ervoor te zorgenbeide vlakken elkaar overlappen zo dicht mogelijk. Re-center de verticale en horizontale positie van de buis lens en veilig klem deze op zijn plaats.
- Plaats het objectief in de bundel weg, en zorg ervoor dat het objectief positie terug diafragma zo dicht mogelijk bij de stationaire vliegtuig mogelijk te maken. De ware doel achter het diafragma misschien niet altijd worden gevestigd op de fysieke opening aan de achterkant van de doelstelling te wijten aan variërende fabrikant ontwerpkeuzes. Het is daarom altijd de beste contact op met de fabrikant om het ware terug te diafragma positie te bepalen.
- Stel de monster etappe, en zorg ervoor dat de vertaling mount waarmee voor z-as beweging kan over zijn volledige gamma gaan zonder in de objectieve lens mount.
4. Het opzetten en afstemmen van de confocale pinhole en detector
- Koppel alle voedingen en glasvezel, en draai de microscoop montage zodanig dat het weer rust op het bord die de resonantienant scannen spiegel. Klem de breadboard op zijn plaats, dan opnieuw aansluiten van de fiber to the collimator, en sluit zowel galvos en hun controle kabels. Net als voorheen, plaats 0 volt op de stuurspanning het besturen van de standaard-scanning galvo.
- Op het monster podium, plaatst u een visitekaartje of een klein volume van een heldere kleurstof in het doel focus, ingeklemd tussen twee dekglaasjes. De keuze van de verf zal afhangen van de laser en dichroic geselecteerd, in dit geval zullen we de fluorescentie emissie uit een witte visitekaartje te gebruiken om de confocale detectiesysteem te lijnen. Quantum dots kan ook nuttig zijn voor uitlijning doeleinden, zoals ze zijn helder en niet photobleach. Andere alternatieven zijn fluorescerende kralen en / of stof samples zijn blootgesteld aan kleur / wasserij bleekmiddel, die beide fluoresceren helder. Schakel de laserbron en breng het monster in de microscoop scherpstellen met behulp van de vertaling podium. Eenmaal in focus, moet de fluorescentie gegenereerd op basis van de steekproef worden zichtbaar achter tHij dichroïde spiegel, zoals beschreven in de volgende stap. Maximaliseren van de laser macht om de fluorescentie zo helder mogelijk te maken.
- Met behulp van een visitekaartje, spoor de fluorescentie-emissie van het monster door het objectief en terug door de scanning systeem om de dichroïsche spiegel. De dichroïsche spiegel wordt het doorsturen van de fluorescentie-emissie, terwijl als gevolg van de laserstraal, vinden deze fluorescentie-signaal aan de andere kant van de dichroïsche spiegel. Plaats nu een spiegel achter de dichroïsche spiegel en gebruik deze om de emissie bij een hoek van 90 graden weer te geven. Neem een iris, zoals werd gedaan in stap 1.1, en gebruik het in combinatie met de spiegel aan de fluorescentie straal direct als recht en evenwijdig aan het breadboard als mogelijk. Deze stap kan het best worden uitgevoerd bij weinig licht.
- Stel de confocale pinhole-eenheid, zoals beschreven in figuur 2. We hebben geconstateerd dat de ruimtelijke filter kooi monteren assemblage van Thorlabs is ideaal voor deze taak. Het is belangrijk dat u een geschikte pinhole grootte om ervoor te zorgen dat de confocale systeem de optimale resolutie bereikt zonder concessies te veel signaal. Voor deze gewoonte microscoop, was een pinhole grootte van 100 micrometer geselecteerd. Plaats de ruimtelijke filter unit in lijn met de fluorescentie stralengang, zorg ervoor dat het centrum de eerste focus lens te monteren op de fluorescentie-emissie balk. Na montage van een korte brandpuntsafstand lens in het toestel (een microscoop doelstelling kan ook gebruikt worden), schuif de z-vertaling monteren tot een duidelijke focus kan worden waargenomen op het pinhole oppervlak. Zorg ervoor dat het geheel gericht is langs de exact rechte lijn die door de fluorescentie balk. Klem de unit op de breadboard.
De emissie van de meeste monsters is zwak in vergelijking met omgevingslicht, zelfs in donkere ruimten. Het is daarom van cruciaal belang dat voldoende afscherming / licht verbijsterend worden gebruikt om de uitstoot pad ter bescherming tegen strooilicht besmetting. Bovendien, een hoge omgevingslicht niveaus zal overbelasting en schade vele PMT's, met name die met geen cUIDIGE bescherming. Lezers worden dan ook met klem verzocht om objectief buizen te gebruiken om de uitstoot stralengang omsluiten, van een goed afgeschermde systeem, zoals het een bewezen hier, in staat is om de werking in de kamer het licht met weinig tot geen strooilicht verontreiniging. - Nu, met behulp van de aanpassing knoppen aan de vertaling podium, systematisch te verplaatsen van de confocale pinhole tot het punt waar de fluorescentie-signaal door de pinhole is gemaximaliseerd te vinden. Deze positie is het meest gemakkelijk te herkennen door middel van iteratieve aanpassing van de twee assen om een 2D-zoeken over het pinhole monteren oppervlak uit te voeren. Zodra het signaal te maximaliseren positie is gevonden, plaats het collimeren lens op de kooi berg na de pinhole. Zoek de fluorescentie-emissie, dat gaat door de confocale unit met behulp van een visitekaartje, en schuif de collimeren lens langs de posten tot het uitgezonden fluorescentie-signaal wordt zo gecollimeerd mogelijk te maken. Zodra de bundel is gecollimeerd, moet u de juiste filter in de bundel pad in een lens bade.
- Stel de fotomultiplicatorbuis (PMT) montage. Plaats een 50 mm brandpuntsafstand lens in de fluorescentie-emissie stralengang en vindt zijn brandpunt met behulp van een visitekaartje. Markeer deze positie op de breadboard. Nu, schakelt u de laser geheel - dit is belangrijk, als strooi-of unattenuated laser licht kan permanent beschadigen meeste PMT's. Plaats de PMT zodat de actieve gebied is zo dicht mogelijk bij de gemarkeerde brandpunt mogelijk te maken. Sluit de PMT assemblage naar de lens met behulp van verstelbare lens buizen, en zorgvuldig donkere tape wrap rond alle zichtbare balken wegen naar aanleiding van de pinhole.
- Zet de laser, maar zorg ervoor dat zijn macht extreem lage zodanig dat de fluorescentie-emissie is nauwelijks zichtbaar te houden. Zet de PMT, zorgvuldig lezen van haar spanning op een oscilloscoop als de stuurspanning wordt verhoogd. Een PMT genereert signaal via een aantal stadia elektron te vermenigvuldigen, als de fotostroom te hoog is voor het invallende licht niveau van de buis kanonherstelbaar beschadigd. PMT's met de huidige beperking van circuits zijn dan ook zeer aan te bevelen, vooral voor gebruikers die nog niet met zulke detectoren gewerkt.
Verhoog de PMT stuurspanning totdat er een spike-achtige uitlezing en / of een DC-offset kan worden gezien op het oscilloscoop scherm, voor de meeste PMT's, dit signaal zal negatief ten opzichte van de grond te zijn. Bevestigen dat dit inderdaad het signaal komt voort uit de fluorescentie door het draaien van de laser power off tot een verlies van het signaal te observeren. - Tot slot, iteratief richt de pinhole voor een maximale signaal op de oscilloscoop door eerst het manipuleren van de focus lens z-positie, en vervolgens het aanpassen van de yz vertaling podium.
- De video-rate microscoop hardware is compleet! Nu het aansluiten van de spiegels, custom control boards, en de computer als diagram in figuur 3. Zoals hierboven, is het aanbevolen om de imaging systeem te gebruiken om eerst te visualiseren een bekend formaat standaard om de optimale resolutie van de microscoop te vinden en de pixel te berekenen-To-resolutie constante voor de imaging-systeem. Er zijn vele grootte van standaarden die gebruikt kunnen worden, zoals witte visitekaartjes met de bekende brief maten, fluorescentie of reflecterende luchtmacht doelen, en fluorescerende microsferen.
5. De voorbereiding van het systeem voor confocale scanning microendoscopy
In deze build gebruiken we een coherent beeld vezel, die bestaat uit een bundel van vele duizenden vezels kernen; een dergelijke regeling kan een beeld worden doorgegeven via de vezel en gemakkelijk gereconstrueerd en / of uitgebreid aan de andere kant (afb. 4). De coherente bundel vezels gebruikt in de bouw van deze endoscoop is gepolijst aan beide uiteinden, waardoor het een zogenaamde 'contact-mode "microendoscope. Een in-focus beeld wordt dus alleen worden gevormd wanneer de microendoscope tip is gebracht in nauw contact met een object. In deze pseudo-confocale regeling, van de microscoop scan actie richt zich de laser op een fIber kern in een tijd, terwijl de confocale gaatje zorgt ervoor dat er geen out-of-focus licht van de omliggende vezels is toegestaan om door te geven aan de detector. Voor verschillende imaging-toepassingen, kan een set van lenzen worden toegevoegd op de distale tip om voor het naar voren gerichte, lange afstand fluorescentie beeldvorming. Microoptic lenzen, evenals gradiënt brekingsindex (GRIN) lenzen kan gemakkelijk worden aangepast voor dit gebruik, en kan worden aangebracht op de distale vezelpunt met behulp van optische kwaliteit lijmen.
- Voor het instellen van de imaging-systeem voor microendoscopy, verwijder voorzichtig de steekproef podium en vervang deze door een vezel holding stadium (figuur 5). Dip het ene uiteinde van de vezel bundel in een zwakke oplossing van kleurstof, zodat fluorescentie-emissie is gelijkmatig over alle kernen van de vezel gegenereerd. Zet het scansysteem en stel de vezel houder aan de andere kant van de vezel bundel (het proximale uiteinde, of het einde het dichtst bij de microscoop optiek) in focus te brengen. Gebruik eerst omrekeningsverschillen scrEWS tot het centrum van de vezels in het gescande gebied. Nu, kijk naar de fluorescentie-emissie beeld van de proximale vezelpunt tijdens het scannen. Wanneer de gehele microendoscope oppervlak is in het brandvlak van de doelstelling zal de fluorescentie-emissie in alle vezels cores worden zo uniform mogelijk te maken. Gebruik de hoekinstelling knoppen om de vezel gezicht aan te passen om alle vezels cores gelijkmatig licht. Tijdens deze aanpassing, zal het waarschijnlijk nodig zijn om opnieuw aan te passen de vertaling positie opnieuw te midden van de vezels in het gescande gebied. Doorloop deze aanpassingen totdat de hele vezel tip is juist in focus is.
- Voordat u de microendoscope voorzichtig schoon met behulp van de distale tip lensreinigingspapier licht bevochtigd met HPLC-grade methanol. Zoals eerder, gebruik dan een bekend formaat standaard te meten en berekenen van de resolutie van het microendoscope imaging systeem.
6. Representatieve resultaten:
Figuur 6 toont een voorbeeld van een afgewerkt UPRight confocale scanning microscoop geconfigureerd voor microendoscopy. De laser-en emissie-stralen zijn getekend als een leidraad voor het oog. Een vezel mount houdt het beeld vezels in plaats tijdens microendoscopy werking. Deze vezel mount kan gemakkelijk worden vervangen door een xy-of xyz vertaling podium voor gebruik als een rechtop microscoop platform. Thorlabs delen PT3 (XYZ vertaling) of twee gestapelde PT1 fasen (XY vertaling) werken goed voor deze toepassing, samen met een haakse beugel, zoals Thorlabs onderdeel AP90.
Een video-rate framegrabber kaart wordt gebruikt om beelden te genereren uit het inkomende signaal. Figuur 7 toont een representatief testbeeld gehouden met een kleine letter "m" gedrukt op een witte visitekaartje met behulp van de video-rate microscoop scansysteem. Gebleekt wit papier bevat fluoroforen die worden opgewekt door UV en blauw licht, wat resulteert in de heldere achtergrond van donkere letter "m". Een emissie filter gecentreerd op 515 nm werd gekozen om deze fluorescentie-emissie te verzamelen. Een mleine vervorming van het beeld kan worden waargenomen, vooral in de buurt van de zijkanten van het beeld frame. Deze vervorming het gevolg van de sinusvormige scannen patroon van de 8kHz gavlo spiegel, en zal worden besproken in detail beschreven.
Figuur 1. Diagram tonen het werkingsprincipe van een confocale microscoop. Stralen afkomstig van de doelstelling gericht zijn weer terug doorgestuurd door het systeem en richt zich door middel van de confocale pinhole (rood). Stralen uit ofwel boven (blauw) of onder (groen) de doelstelling zich niet voort uit gecollimeerd het doel, en daarom zijn niet efficiënt doorgegeven via de confocale pinhole.
Figuur 2. Schematische weergave van al het licht paden door de beam scanning systeem. Het scannen spiegels zitten vliegtuigen telecentrische met de STAnaire, objectieve terug diafragma vliegtuig. Paren van lenzen tussen de stilstaande vliegtuigen handelen om relais de gescande balken. De eerste twee relais lenzen hebben dezelfde brandpuntsafstand, de vorming van een 1:1 telescoop. Het tweede paar lenzen, formeel bekend als de scan lens en de buis lens, hoeven niet gelijk te zijn in brandpuntsafstand, en vaak dienen als een bundel uit te breiden telescoop om de doelstelling te back-opening is te vol te verzekeren. Uitgestraalde licht van het monster reist terug door de scanning-systeem en wordt door de dichroïsche spiegel. Een korte focus lens richt de emissie licht door de confocale pinhole, die vervolgens wordt gecollimeerd door een lens. Een laatste lens focust de confocale gefilterde emissie op een fotomultiplicatorbuis. Klik hier om een full-sized versie van deze foto te bekijken.
Figuur 3. (A) Overzicht diagram van de scanning elektronica setup. De microscoop de totale referentie-signaal en tijdbasis is de "sync" TTL-uitgang van de fast as resonante galvo spiegel, die een TTL puls genereert aan het einde van gescande elke regel (dat wil zeggen, wanneer de galvo heeft een scan cyclus is afgewerkt). Dit biedt de H-sync signaal naar de framegrabber kaart. Van de galvo's sync-uitgang is ook verbonden met de V-sync control board, die stap voor stap de uitgangsspanning stijgt in reactie op elke H-sync puls te genereren van de zaagtand golfvorm dat de trage scan as drives. Als alle lijnen zijn gescand, de V-sync board reset de zaagtand golfvorm en genereert een TTL-puls die dienst doet als V-sync van de framegrabber het signaal van. De laatste input voor de framegrabber kaart is het analoge signaal van de fotomultiplicatorbuis (Merk op dat veel PMTs negatieve uitgangsspanning te genereren; moet u uw circuit design eend dus kies je hardware). De video-rate beelden worden gegenereerd en weergegeven in de Matrox framegrabber software. (B) Voorbeeld controle circuit. In dit ontwerp, is de spanning van elk H-Sync pulse "toegevoegd" / geïntegreerd in de op amp integrator om de zaagtand golfvorm helling te genereren; pulsen worden gelijktijdig verrekend tegen de TTL balie podium. Wanneer het gewenste aantal lijnen is bereikt (dat wil zeggen, wanneer de raster scan voltooid is), de teller genereert een active-low "carry out" puls, die de Schmitt-trigger rijdt voor het genereren van een reset puls voor de integrator. Hiermee wordt zowel de teller en de op amp integrator, klaarmaken het circuit voor de volgende cyclus. Juiste component keuze maakt dit circuit breed toepasbaar op een verscheidenheid van raster formaten. Dit is slechts een implementatie; tal van andere implementaties zijn mogelijk en kan de voorkeur onder bepaalde omstandigheden. Ook is dit circuit ontworpen voor gebruik met Matrox framegrabber kaarts, die detecteren en automatisch te corrigeren imago fase. Als het circuit te worden gebruikt met andere framegrabbers, kan fasecorrectie circuit of de software vereist. Klik hier om een full-sized versie van deze foto te bekijken.
Figuur 4. Image transmissie door middel van een coherent vezel bundel. In dit schema, de lenzen aan weerszijden van de bundel zijn om zowel het beeld geprojecteerd op de vezel bundel ingang evenals de uitbreiding van het beeld op de vezel bundel uitgang schaal.
Figuur 5. Voorbeeld van een vezelbundel gemonteerd in een 5-assige monteren. Een kleine 1 "diameter aluminium blok was verveeld, zodat het beeld vezelbundel kunnen worden opgenomen. De vezel is geëpoxeerd in het aluminium blok op both de boven-en onderkant van het blok voor de stabiliteit.
Figuur 6. Afbeelding van het ingevulde microscopie-systeem, met daaraan de microendoscope. Om beter te visualiseren de lichtpaden, is de excitatie stralengang getekend in het blauw, terwijl de uitstoot stralengang nadat de dichroïsche spiegel is getekend als een rode lijn.
Figuur 7. Voorbeeld image gegenereerd door de video-tarief confocale scanning microscopie systeem. Een donkere kleine letter "m" verschijnt op het heldere fluorescentie achtergrond van een witte visitekaartje.
Discussion
Deze video-rate imaging systeem maakt gebruik van een resonante galvanometrische spiegel werken op ongeveer 8 kHz. Resonant spiegels kan heel hard als draaien op volle kracht, en hun hoge toonhoogte kunnen hinderlijk of zelfs gevaarlijk zijn bij voldoende blootstelling tijden. Hoewel hier niet aangetoond, is het raadzaam om de resonante galvanometrische spiegel in een transparante kast schild om een aanzienlijke vermindering van het systeem volume en / of passende horen beschermingsmiddelen, zoals oordoppen te dragen.
Het resonante galvanometrische spiegel scans in een sinusvormige patroon. Echter, framegrabber kaarten te lezen in het signaal, uitgaande van een volledig lineaire sweep tarief in zowel de horizontale en verticale richting. Aangezien een sinusvormige vegen vertraagt aan de randen van de scan, kan beeldcompressie artefacten worden waargenomen langs de snelle (horizontaal) beeld as. Een manier om dit probleem te minimaliseren is om opzettelijk rijden de resonante galvo spiegel scannen bereik aanzienlijk groter is dan derelais lens diameter. In dit te doen, zal alleen de bijna lineaire centrale oprit van het sinusvormige scan patroon doorkruisen van het monster, het minimaliseren van beeldvervorming. Een andere benadering zou zijn om na te bewerken verzamelde beelden om de snelle as lineariseren. Dit kan worden bereikt door beeldvorming een bekende fluorescerende patroon (zoals een rooster) en het gebruik van de bekende patroon afmetingen een verwerking script dat de verzamelde beelden unwarps te creëren.
Deze bijzondere scanning systeem werd ontworpen voor het doel van de in vivo beeldvorming, die vaak vraagt om een rechtopstaande georiënteerde video-rate microscoop. Voor cellulaire beeldvorming experimenten, zijn omgekeerde microscopen meer typisch gebruikt. De hier gepresenteerde ontwerp kan eenvoudig worden aangepast om een dergelijke omgekeerde microscoop te bouwen, alles wat nodig is is een rotatie van de laatste 2 "diameter spiegel. In plaats van het oriënteren van de spiegel om het scannen bundel naar beneden direct, kan de spiegel omhoog direct de balk. Het plaatsen van de objectief lens eent op dezelfde afstand van de spiegel, samen met een monster podium zou voor de beeldvorming in een omgekeerde geometrie. Als het imaging systeem wordt uitsluitend gebouwd voor microendoscopic imaging, is er geen reden om te "vouwen" de microscoop ontwerp verticaal helemaal. In plaats daarvan kan het hele scan systeem worden gebouwd op een enkele horizontale breadboard met het objectief gericht parallel aan de optische tafel.
Merk op dat de microscoop in deze build een vaste pinhole configuratie gebruikt, terwijl dit biedt voor het grootste bouw eenvoud en het gemak van de aanpassing, gebruikers verlangen naar een meer veelzijdig systeem zou kunnen beraden over de integratie van een variabele pinhole, zoals te vinden in de meeste commerciële confocale microscopen. Doordat de gebruiker de grootte van het gaatje om te compenseren voor monsters van verschillende emissie-intensiteit aan te passen, dit kan de gebruiker de afweging tussen de signaalsterkte en de resolutie beter optimaliseren voor een bepaald monster.
Het loice van het beeld vezels geselecteerd voor de microscoop is belangrijk. Wij raden u aan Sumitomo coherent beeld vezels vanwege hun nauwe vezelkern afstand en lage relatieve autofluorescentie. Image vezels vervaardigd door Fujikura is gebleken dat grote hoeveelheden autofluorescentie 10, die een zwakke fluorescentie signalen kunnen overweldigen door een monster en beperking van de uiteindelijke gevoeligheid van de microendoscope hebben. Sumitomo vervaardigd vezels, zoals de 8-30N die in deze configuratie, hebben een veel lager niveau dan de autofluorescentie Fujikura equivalenten. Terwijl leeched vezelbundels kan worden beschouwd als aantrekkelijk voor microendoscopy, hun ontwerp plaatst typisch individuele vezel kernen te ver uit elkaar, wat betekent dat de vezel kernen dun staal objecten, het weglaten van belangrijke regio's van potentieel belang.
Ten slotte moet worden opgemerkt dat, terwijl de microscoop hier beschreven nuttig zal zijn in een verscheidenheid van in vitro en in vivo applications en kunnen worden gemaakt voor een fractie van de kosten van een full-featured commercieel systeem, heeft het geen functies zoals doorgelaten licht detectie, een oculair voor het bekijken, of een straalpad voor niet-confocale groothoek epifluorescentie. Hoewel het mogelijk is om een systeem te bouwen met deze kenmerken uit het niets, kunnen lezers verlangen naar een dergelijk systeem willen een bestaand commercieel systeem om hun behoeften te voldoen in plaats van te starten een geheel nieuw te bouwen te wijzigen.
Disclosures
De productie van deze video-deze video werd gesponsord door Thorlabs, Inc
Acknowledgments
De auteurs willen graag Thorlabs bedanken voor hun ondersteuning van dit project. AJN wil de steun van een NSF Graduate Fellowship.
Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de National Institutes of Health via New Innovator Award van de NIH directeur Program verlenen nummer 1 DP2 OD007096-01. Informatie over de New Innovator Award Programma is op http://nihroadmap.nih.gov/newinnovator/ . De auteurs willen Tom Hayes bedanken voor het gebruik van de Harvard Electronics lab.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 515 nm Band Pass Filter | Chroma Technology Corp. | HQ515/50M | 46 FWHM |
| Achromatic Doublet Lens 25.4mm Dia. x 50mm FL, MgF2 Coating | Edmund Scientific | NT49-766 | |
| Achromatic Doublet Lens 25.4mm Dia. x 76.2mm FL, MgF2 Coating | Edmund Scientific | NT49-768 | |
| Achromatic Doublet Lens 25.4mm Dia. x 88.9mm FL, MgF2 Coating | Edmund Scientific | NT49-769 | |
| Achromatic Doublet Lens 50mm Dia. x 300mm FL, MgF2 Coating | Edmund Scientific | NT45-179 | |
| 8 kHz R High Frequency Optical Scanner | Electro-Optical Products Corporation (EOPC) | SC-30 | 8 kHz |
| AGC Driver | Electro-Optical Products Corporation (EOPC) | ACG:8K | |
| H7422-PA Photosensor Module | Hamamatsu Corp. | H7422-PA | Current limiting recommended |
| M9012 Power Supply | Hamamatsu Corp. | M9012 | For use with H7422-PA |
| HC PL APO CS Objective | Leica Microsystems | 11506284 | 10x/0.40 |
| Solios eA/XA Framegrabber Card | Matrox | Solios eA/XA | MIL software required; –M interconnects recommended |
| 12V Power Supply | Meanwell | LPV-100-12 | +12V, 8.5A |
| 5x Microscope Objective Lens | Newport Corp. | M-5X | 0.10 NA, 25.4 mm Focal Length |
| Coherent Image Fiber | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | 8-30N | |
| 1/4"-20 Cap Screw and Hardware Kit | Thorlabs Inc. | HW-KIT2 | |
| 100 μm Mounted Pinhole | Thorlabs Inc. | P100S | Ideal for building spatial filters |
| 30 mm Cage Cube Clamp | Thorlabs Inc. | B6C | |
| 30 mm Cage System Cube, 4-Way | Thorlabs Inc. | C4W | |
| 406 nm, 5 mW, B Pin Code, SM Fiber Pigtailed Laser Diode, FC/PC | Thorlabs Inc. | LPS-406-FC | Product obsolete; replaced by LP405-SF10 |
| 5-Minute Epoxy, 1 Ounce | Thorlabs Inc. | G14250 | |
| 6 Axis Kinematic Optic Mount | Thorlabs Inc. | K6X | |
| 8-32 Cap Screw and Hardware Kit | Thorlabs Inc. | HW-KIT1 | |
| 8-32 Setscrew and Hardware Kit | Thorlabs Inc. | HW-KIT3 | |
| Adapter with External RMS Threads and Internal SM1 Threads | Thorlabs Inc. | SM1A4 | |
| Adj. FC/PC and FC/APC Collimator, f = 2.0 mm, ARC: 400-600 nm | Thorlabs Inc. | CFC-2X-A | f = 2.0 mm |
| Adjustable Fiber Collimator Adapter, SM1 Threaded | Thorlabs Inc. | AD9.5F | |
| Aluminum Breadboard, 12" x 18" x 1/2" | Thorlabs Inc. | MB1218 | 1/4"-20 Threaded |
| Benchtop Laser Diode/TEC Controller | Thorlabs Inc. | ITC4001 | 1 A/96 W |
| DMLP 425 nm Long-Pass Dichroic Mirror | Thorlabs Inc. | DMLP425 | |
| Kinematic Mount for 1" Optics | Thorlabs Inc. | KM100 | |
| LD/TEC Mount for ThorLabs Fiber-Pigtailed Laser Diodes | Thorlabs Inc. | LM9LP | |
| Lens Mount for 18 mm Optics | Thorlabs Inc. | LMR18 | One retaining ring included |
| Lens Mounts for 2" Optics | Thorlabs Inc. | LMR2S | With internal and external threading; retainer ring included |
| Mini Series Cage Assembly Rod, 6" Long, 4 mm, Qty. 1 | Thorlabs Inc. | SR6 | |
| 1.0" Pedestal Pillar Post, 8-32 Taps, 1" Long | Thorlabs Inc. | RS1P8E | |
| 1" Pillar Post Extension, Length=0.5 | Thorlabs Inc. | RS05 | |
| 1" Pillar Post Extension, Length=0.75" | Thorlabs Inc. | RS075 | |
| 1" Protected Silver Mirror, 3.2 mm Thick | Thorlabs Inc. | ME1-P01 | |
| 1" SM1 Rotating Adjustable Focusing Element, L = 1" | Thorlabs Inc. | SM1V10 | |
| 2" Protected Silver Mirror, 3.2 mm Thick | Thorlabs Inc. | ME2-P01 | |
| P100S - 100 μm Mounted Pinhole | Thorlabs Inc. | P100S | |
| Polaris Low Drift 1" Kinematic Mirror Mount | Thorlabs Inc. | POLARIS-K1 | Low drift |
| SM1 Lens Tube, L = 1" | Thorlabs Inc. | SM1L-10 | One retaining ring included |
| SM1 Threaded 30 mm Cage Plate, 0.35" Thick | Thorlabs Inc. | CP02 | |
| SM1 to M25 Optical Component Threading Adaptor | Thorlabs Inc. | SM1A24 | External SM1 Threads and Internal M25.5x0.5 Threads |
| Small Beam Diameter Galvo System | Thorlabs Inc. | GVSM001 | |
| Small Clamping Fork | Thorlabs Inc. | CF125 | 1/25" counterbored slot, universal |
| Spatial Filter System | Thorlabs Inc. | KT310 | Pinhole sold separately |
| TE-Cooled Mount for 5.6 & 9 mm Lasers | Thorlabs Inc. | TCLDM9 | |
| Vertical Bracket for Breadboards | Thorlabs Inc. | VB01 | Each |
| Plan-Apochromat | Carl Zeiss, Inc. | 1101-957 | 20x/0.75 NA |
References
- Pawley, J. B. Handbook of biological confocal microscopy. , Springer Verlag. 985-985 (2006).
- Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A.
- Klonis, N., Rug, M., Harper, I., Wickham, M., Cowman, A., Tilley, L. Fluorescence photobleaching analysis for the study of cellular dynamics. European Biophysics Journal. 31, 36-51 (2002).
- Stephens, D. J. Light Microscopy Techniques for Live Cell Imaging. Science. 300, 82-86 (2003).
- McMahon, A., Supatto, W., Fraser, S. E., Stathopoulos, A. Dynamic Analyses of Drosophila Gastrulation Provide Insights into Collective Cell Migration. Science. 322, 1546-1550 (2008).
- Wallingford, J. B. Dishevelled controls cell polarity during Xenopus gastrulation. Nature. 405, 81-85 (2000).
- Laemmel, E. Fibered Confocal Fluorescence Microscopy (Cell-viZio) Facilitates Extended Imaging in the Field of Microcirculation. Journal of Vascular Research. 41, 400-411 (2004).
- Moussata, D.
- Dunbar, K., Canto, M.
- Udovich, J. A. Spectral background and transmission characteristics of fiber optic imaging bundles. Applied optics. 47, 4560-4568 (2008).
