Video-rate Scanning konfokalmikroskopi och Microendoscopy

Summary

Den kompletta konstruktionen av en anpassad, i realtid konfokal skanning Imaging System beskrivs. Detta system, som lätt kan användas för video-rate mikroskopi och microendoscopy, möjliggör en rad avbildning geometrier och applikationer inte är tillgängliga med vanliga kommersiella konfokala system, till en bråkdel av kostnaden.

Abstract

Konfokalmikroskopi har blivit ett ovärderligt verktyg i biologi och biomedicinska områden, vilket möjliggör en snabb, hög känslighet och hög upplösning optisk sektionering av komplexa system. Konfokalmikroskopi rutinmässigt används till exempel för att studera specifika cellulära mål ^1, följa dynamiken i levande celler ^2-4, och visualisera tredimensionella utvecklingen av hela organismer ^5,6. Förlängningar av konfokala bildsystem, såsom konfokal microendoscopes, möjliggöra högupplösta avbildning in vivo ⁷ och för närvarande tillämpas till sjukdom avbildning och diagnos i kliniska situationer ^8,9.

Konfokalmikroskopi ger tredimensionella upplösning genom att skapa sk "optiska sektioner" med enkel geometrisk optik. I en vanlig brett fält mikroskop är fluorescens genereras från ett prov som tagits av en objektiv och förmedlas direkt till en detektor. Medan accepteramöjlighet för avbildning tunna prover, blir tjocka prover suddig genom fluorescens genererad över och under målet fokalplanet. Däremot gör konfokalmikroskopi virtuella, optisk sektionering av prover, avvisa out-of-fokus lätt att bygga med hög upplösning tredimensionella representationer av prover.

Konfokala mikroskop uppnå detta konststycke med hjälp av en konfokala bländare för att upptäcka strålgången. Den fluorescens som samlas in från ett urval av målet förmedlas tillbaka genom skanning speglar och genom den primära dikroiskt spegel, en spegel noggrant utvalda för att spegla kortare våglängder såsom laser excitation stråle medan passerar längre, Stokes återuppspelat fluorescens utsläpp. Denna långa våglängd fluorescens signalen skickas sedan till ett par linser på vardera sidan av ett hål som är placerade på ett plan precis konjugat med fokalplan objektiv. Fotoner som samlats in från den centrala volymen av objektet är parallelltav objektiv och är fokuserade av konfokala linserna genom hål. Fluorescens genererat över eller under fokalplanet kommer därför inte ställas in på rätt sätt, och kommer inte att passera genom konfokala hål ^1, skapa en optisk avsnitt där bara ljuset från mikroskopet fokus är synlig. (Fig. 1). Således Pinhole fungerar effektivt som en virtuell bländare i fokalplanet, begränsa de upptäckta utsläpp till endast en begränsad geografisk plats.

Moderna kommersiella konfokala mikroskop erbjuda användarna helt automatiserad drift, vilket gör tidigare komplexa röntgenfynd relativt enkelt och tillgängligt. Trots flexibiliteten och kraften i dessa system är kommersiella konfokala mikroskop inte väl lämpade för alla konfokala bildhantering uppgifter, till exempel många in vivo imaging program. Utan förmågan att skapa anpassade bildsystem för att möta deras behov, kan viktiga experiment kvar av reaktionerh till många forskare.

I denna artikel ger vi en steg-för-steg metod för hela byggandet av en anpassad, video-rate konfokala bildsystem från grundläggande komponenter. Upprätt mikroskop kommer att byggas med hjälp av en resonant galvanometric spegel för att ge snabb scanning axeln, medan en vanlig hastighet resonant galvanometric spegel kommer att skanna den långsamma axeln. För att skapa en exakt skannat balk i objektiv fokus kommer dessa speglar placeras vid den så kallade telecentrisk plan med fyra relä linser. Konfokala detektion ska ske med hjälp av en standard, off-the-shelf fotomultiplikatorn rör (PMT) och bilderna kommer att fångas och visas med en Matrox framegrabber kort och den medföljande programvaran.

Protocol

Valet av laser våglängd, dikroiskt spegel och optiska filter bör bestämmas utifrån specifika färgämnen som används i försöket. Till exempel är konfokal avbildning av ett prov som färgats med Alexa Fluor 488 bäst uppnås med hjälp av en 488 nm laser, en 500 nm lång-pass dikroiskt spegel, och en 30 nm bandbredd bandpass spegel centrerade vid 515 nm. Däremot skulle konfokal avbildning av det röda färgämnet Alexa Fluor 647 kräver en annan uppsättning komponenter. Mikroskopet i detta protokoll byggdes för att visualisera något färgämne som absorberar starkt vid 400 nm och avger mer än 450 nm. Därför valde vi en 406 laser nm excitation och en 425 nm lång-pass dikroiskt att reflektera laserstrålen. Upphetsad fluoroforer kan selektivt föreställa sig genom att välja lämpliga utsläppsnormer filter. Det är viktigt att använda rätt optisk monteringsdetaljer hela protokollet där anges, felaktig eller provisoriska hårdvara kommer inte att hålla anpassning också och kan vara en säkerhetsrisk.

<p class = "jove_title"> 1. Ställa in resonant galvanometric spegeln och optik relä

Ett viktigt begrepp för att bygga någon form av konfokal scanning system är telecentricity. I ett telecentriska optiskt system, är linser avstånd från varandra med summan av deras brännvidder, så att förstoringen av systemet helt enkelt definieras av förhållandet mellan brännvidder ^1. Detta möjliggör byggandet av ett optiskt relä system där förstoringar, och därmed egenskaper systemet är enkelt definieras genom val av linser. Ett annat viktigt begrepp innebär så kallade "stationär" optiska plan, även kallad "Aperture plan". En bländare planet är en position längs den optiska sökväg där ljusstrålen inte genomgår någon form av rörelse i sidled. I detta mikroskop design, det finns tre viktiga bländare plan: första och andra skanning speglar, och back-öppning objektiv. För att uppnå optimal balk scanning vid fokalplan målet måste strålen in i ryggen öppning objektiv vara stillastående, svepande endast i vinkel. För att skapa detta stillastående, vinkel-svepte planet måste vi placera den första och andra skanning speglar på konjugat telecentrisk plan till målet back-bländare. Objektiv placeras mellan speglarna och objektiv tjäna till relä vinkeln-skannade balk mellan dessa stationära plan (Fig. 2). Skanningen speglar är monterade på två skanning galvos, var och en är ansvarig för att skanna en given riktning av imaging plan (X och Y). För att få önskad hastighet linjen skanna för video-kurs avbildning, är en hög frekvens resonant galvo krävs för att skanna x-axeln (även känd som "snabba" axel). Dessa galvos använder en känslig, closed-loop feedback-kretsar för att skapa en sinusformad skanning mönster och kan arbeta vid mycket höga frekvenser, vi valt ett 8 kHz galvo till detta bygga.

1. Ställ infibern kollimator i den optiska montera och grovt styra strålen med hjälp av justerskruvarna så att den färdas i en rak linje både horisontellt och vertikalt. Nu tar en iris och placera den framför fibern kollimator, justera Iris höjd så att balken passerar snyggt genom iris centrum. Därefter flyttar iris bort från kollimator längs strålens väg och observera om strålen fortfarande färdas genom iris centrum. Om inte, justera strålen position på iris med de två justerskruvarna.
2. Placera den monterade dikroiskt spegel i strålgången med laserstrålen placerad ungefär i mitten av spegeln. Innan fastspänning spegeln till bordet, rotera spegeln innehavaren att reflektera balken vid ungefär 90 grader och ungefär justera reflektion så att den reflekterade laserstrålen är höjd inte ändras.
3. Placera en monterad resonant galvanometric spegel in i laserstrålen väg, med bile för att se till att laserstrålen är placerad på exakt horisontella mitten av spegelytan. I detta protokoll var den resonanta galvo spegeln expoxied direkt till en spegel montera. Rotera spegeln montera att reflektera laserstrålen mot en 90-graders vinkel. Ungefär justera reflexer i spegeln för att bibehålla samma laserstrålen lodrät höjd.
4. I syfte att styra någon stråle av ljus i en viss riktning, måste man per definition definiera två punkter i rymden där strålen kommer att resa. Detta är vanligtvis uppnås genom att placera två iris längs den önskade horisontella och vertikala vägen och manipulera laserstrålen att passera genom mitten av varje iris. Fyra grader av frihet är skyldiga att ställa in ljuskäglan, två horisontella och vertikala frihetsgrader för varje iris. Det vanligaste och enklaste sättet att uppnå dessa frihetsgrader är att använda två speglar för att styra, eller "gå", en laserstråle.
   Ta två iris, och satt sin höjd somi steg 1,1, med hjälp av laserstrålen reflekteras från resonant galvo spegeln som referens. Nu, med hjälp av skruvhålen på den optiska bakbord som en guide för ögat, klämma de två iris i en rak linje.
5. Justera dikroiskt spegeln och resonant galvo spegel att styra laserstrålen genom centrum av de två iris. Använd den första spegeln i sökvägen (det dikroiskt spegeln) att centrera balken på första iris, sedan använda den andra spegeln i sökvägen (den resonanta galvo spegeln) att centrera strålen på den andra iris. Iterativt justera dessa två speglar tills balken är i linje både med iris, se hela att laserstrålen reflekteras från resonant galvo spegeln fortfarande reflekteras från den ungefärliga spegeln centrum. Om strålen har avvikit, Monteringen fiber kollimator och upprepa iterativa stegen ovan.
6. Med balken centrerad på både iris, kommer vi att placera nu två relä linser som kommer bilden vår första stationära, telecentrisk planene (dvs den resonanta galvo spegeln) på vår andra stationära, telecentrisk planet (dvs den standard hastighet galvo spegel). För detta mikroskop, den valda linserna i första reläet har samma brännvidd, "f", så avståndet mellan två speglar i våra telecentrisk systemet är helt enkelt 4f. För att säkerställa att linserna är exakt centrerad i strålgången, använd trick objektivet anpassningen. Placera den första linsen i strålens väg och titta på laserstrålen plats på iris nästa i strålgången efter linsen. Därefter, justera linsen höjden vertikalt så att de vertikala centrum av strålen är på iris centrum. Slutligen, justera den horisontella balken position till centrum strålen på iris. Utför samma procedur för den andra linsen.

2. Ställa in den andra skanning spegeln och vrida mikroskop

1. För att hitta den exakta positionen för det andra telecentrisk planet, koppla upp den resonanta galvo tilldess apparaten och slå på den. Använd en vit visitkort för att spåra skanning stråle genom två linser. Du hittar telecentrisk plan på den ungefärliga avstånd 4f från resonant galvo, där laserstrålen kommer att visas helt stilla. Markera detta läge på bakbord.
2. Placera standard scanning galvo spegeln på denna exakta telecentrisk plan plats och justera spegeln höjd och läge så att balken vid telecentrisk planet slår den exakta mitten av skanning spegeln. Det är viktigt att driva upp hårdvaran spegeln kontroll och sätta en spänning på 0 volt på scanning spegeln ingång så att spegeln lägger sig till sitt neutralläge under denna process. Noggrant justera spegeln vinkel för att rikta strålen vertikalt och försiktigt dra åt spegeln på plats.
3. Eftersom vi bygger en upprätt mikroskop, kommer vi att fästa nu den andra bakbord i 90 graders vinkel med 90 graders monteringsfästen. Se till att stänga avlasern och skanning elektronik, koppla bort fiber och koppla bort scanning speglar under denna process. För att göra resten av anpassningen lättare, när parentes är skruvade på plats, försiktigt rotera hela mikroskopet så att den nya bakbord nu ligger platt. Använd en klämma att fästa bakbord till den arbetande ytan. Nu resten av tidigare vertikala inställningar kan enkelt utföras på plana bakbord.

3. Ställa in sökningen, slang och objektiv

Nästa vi kommer att tillsätta den andra uppsättningen av relä linser, formellt kallad "skanningslinsen" och "tube lins". Det är viktigt att välja rätt kombination av linser för att uppnå rätt förstoringen vid målet fokus och optimera den slutliga bilden upplösning. Först, för att uppnå den maximala numeriska bländaröppningen (NA) av ett visst objektiv måste laserstrålen slående baksidan av målet fyllatillbaka bländare helt, först då kommer objektivet att kunna skapa de snävaste fokus. Objektiv har en räckvidd på ryggen bländare storlekar, valde ett förhållande lins förstoring till något mycket i ryggen öppning utvalda målet. Andra, för att uppnå rätt förstoringen måste objektiv att matchas med röret objektivets brännvidd som den var utformad. Tyvärr har olika mikroskop mål tillverkare valt att använda olika rör-objektiv brännvidder, så det är viktigt att bygga ett mikroskop med rätt röret objektiv för det specifika anställda objektiv. Dessutom har vissa tillverkare, såsom Zeiss, designa sin tub linser för att kompensera för de särskilda kromatisk aberration av sin avstämda mål, så att du använder en felaktig mål-tube lins paret faktiskt kommer att införa nya avvikelser som annars inte skulle vara närvarande. Vi föredrar vanligtvis Olympus mål, som alla kromatisk kompensation sker i the mål i sig, vilket gör att målet / rör lins para ihop lättare. Även om mikroskopet kommer fortfarande att fungera om målet och rör lins inte matchar kommer den faktiska mikroskopet förstoringen sannolikt inte överensstämmer med förstoringen listas på objektiv. För denna särskilda mikroskop bygga, var den optimala tillbaka bländarstorleken bestämt sig för att vara 4 mm, vilket kräver en 01:04 förstoringsgraden mellan skanningslinsen och rör linsen. För denna sed mikroskop bygga, kommer vi att använda en skanningslinsen längd på 75 mm och en tub lins längd av 300 mm.

1. Eftersom det totala avståndet mellan den andra skanna spegeln och objektiv fokus är stort, detta segment av mikroskop build första layout speglarna som behövs för att styra strålen till objektiv. Placera den första stora, 2 "(50 mm) diameter spegel nära kanten på bakbord och rotera spegeln montera att reflektera laserstrålen ungefär 90 grader. Ungefär justera reflexer i spegeln för att bibehålla samma vertikala beam höjd. Placera den andra 2 "speglar på motsatta kanten av breadboard på en inriktning som styr balken nedåt i 90 graders vinkel. Använd justerskruvar för att säkerställa strålens höjd inte ändras. Ställ in två iris, som i steg 1,4 och justera två speglar enligt anvisningarna i steg 1,5 för att centrera strålen på iris.
2. Med iris fortfarande på plats, placera skanningslinsen i strålens väg och justera dess horisontella och vertikala position för att centrera laserpunkt på första iris. På ett avstånd av 75 mm + 300 mm från linsen (mellan de två speglar), placera försiktigt den stora 2 "slang lins och justera dess horisontella och vertikala position till centrum balken på första iris. I syfte att upprätthålla anpassning i framtiden, är det bra att lämna dessa iris på plats, för denna applikation, kan ett visitkort med en lämplig storlek hålet limmas till en monter och införas i strålgången.
3. Med alla speglar och linsernu på plats, börja skanna resonant galvo spegeln och standardavvikelsen skanning spegeln. I detta bygga, kommer standarden skanning spegeln slutändan vara synkroniseras till avsökningshastighet av resonanta spegeln genom en specialbyggd styrkrets som det som beskrivs i figur 3, vilket ger överlägsen vertikal och horisontell synkronisering. Men för anpassning ändamål och många tillämpningar Imaging kan spegeln enkelt skannas med en sågtand mönster från en funktion generator. Använda ett visitkort letar laserstrålen i ett läge 300 mm efter röret linsen. Även om strålen är scanning på andra håll i mikroskop i både vertikal och horisontell riktning, bör strålen vara helt stilla i närheten av denna plats. Det är här baksidan bländaren på objektivet kommer att placeras. Om den horisontella och vertikala stillastående plan inte sammanfaller på samma plan längs strålens väg, försiktigt unclamp och översätta röret objektivet längs optisk väg för att säkerställa attbåda planen överlappar varandra så nära som möjligt. Re-center de vertikala och horisontella position röret objektivet och kläm fast den ordentligt på plats.
4. Placera objektiv i strålens väg och se till att placera objektivet tillbaka bländare så nära den stationära planet som möjligt. Det verkliga syftet tillbaka bländaren kan faktiskt inte alltid ligger på den fysiska baksidan öppnandet av målet på grund av varierande val tillverkare design. Det är därför alltid bäst att kolla med tillverkaren för att bestämma den verkliga positionen tillbaka bländare.
5. Ställ in provet scenen, se till att översättningen fästet som kommer att möjliggöra z-axel rörelse kan röra sig över hela sitt utbud utan att köra in i mål objektivfattningen.

4. Ställa in och anpassa konfokala hål och detektor

1. Koppla bort all strömförsörjning och fiberoptik, och rotera mikroskop monteringen så att det återigen vilar på bakbord hålla ResoNant skanning spegel. Spänn fast bakbord säkert på plats, sedan åter ansluta fiber till kollimator, och åter ansluta både galvos och styrkablar. Liksom tidigare överför 0 volt på styrspänningen kör standard scanning galvo.
2. På provet scenen, placera ett visitkort eller en liten volym av en ljus färg i målet fokus, inklämt mellan två täckglas. Valet av färg beror på lasern och utvalda dikroiskt, i detta fall kommer vi att använda fluorescens utsläpp från ett vitt visitkort att anpassa konfokala detektionssystem. Kvantprickar kan också vara användbart för anpassning ändamål, eftersom de är ljusa och inte photobleach. Andra tänkbara alternativ är fluorescerande pärlor och / eller tygprover utsatt för färg / tvätt vitmedel, som båda fluorescerar starkt. Slå på laserkälla och ta provet i mikroskop fokus med översättningen scenen. En gång i fokus bör fluorescens genererad från provet vara synlig bakom than dikroiskt spegel, som beskrivs i nästa steg. Maximera lasern makten att göra fluorescens så ljust som möjligt.
3. Använda ett visitkort, spåra fluorescens utsläpp från provet genom objektiv och tillbaka genom scanning systemet till dikroiskt spegeln. Den dikroiskt Spegeln kommer att överföra fluorescens utsläpp samtidigt som det laserstrålen, hitta denna fluorescens signal på andra sidan av dikroiskt spegeln. Nu, placera en spegel bakom dikroiskt spegeln och använda den för att spegla utsläpp på en 90-graders vinkel. Ta en iris, vilket gjordes i steg 1,1 och använda det tillsammans med spegeln att styra fluorescens strålen så rakt och parallellt med bakbord som möjligt. Detta steg kan vara bäst genomföras i svagt ljus.
4. Ställ in konfokala hål enhet som beskrivs i figur 2. Vi har funnit att den rumsliga filtret buren hopsatta från ThorLabs är idealisk för denna uppgift. Det är viktigt att välja en lämplig pinhole storlek för att säkerställa att konfokala systemet når sin optimala upplösningen utan att offra alltför mycket signal. För denna sed mikroskop, var ett hål på 100 ìm valt. Placera den rumsliga filter i linje med fluorescens strålens väg, var noga med att mitt första fokus objektivfästet på fluorescens utsläpp strålen. Efter montering en kort brännvidd i enheten (ett mikroskop mål kan också användas), skjut Z-översättning montera tills ett tydligt fokus kan observeras på hål ytan. Se till att hela enheten är orienterad längs den exakta rak linje som fastställts av fluorescens strålen. Clamp enheten till bakbord.
   Utsläppen från de flesta prover är svag i förhållande till omgivande ljus nivåer i ens mörka rum. Det är därför viktigt att tillräckliga skärmning / lätt förbryllande användas längs utsläpp vägen för att skydda från ströljus föroreningar. Dessutom mycket ljus nivåer kommer överbelastning och skada många PMTs, särskilt de med nr CNUVARANDE skydd. Läsarna därför starkt uppmanas att använda objektivet rör för att omsluta den väg utsläpp stråle, en avskärmad system, som det visat här, kan drift i rummet ljus med liten eller ingen ströljus föroreningar.
5. Nu, med justeringen vreden på översättningen scenen, systematiskt flytta konfokala hål för att hitta den punkt där fluorescenssignalen genom hål är maximerat. Denna position är lättast identifieras genom iterativ justering av de två axlarna för att utföra en 2D-sökning över hål montera ytan. När signalen maximera positionen hittas, placera kollimerande linsen på buren montera efter hål. Hitta fluorescens utsläpp som går igenom konfokala enheten med hjälp av ett visitkort och skjut kollimerande linsen längs inlägg tills utsända fluorescensen signalen så parallellt som möjligt. När strålen är parallellt, se till att placera lämpligt filter i strålgången i en lins badkare.
6. Ställ in fotomultiplikatorn röret (PMT) montering. Placera en 50 mm brännvidd i fluorescens utsläpp strålens väg och hitta sin brännpunkt med ett visitkort. Markera detta läge på bakbord. Nu ska du stänga av lasern helt - detta är viktigt, eftersom herrelösa eller Odämpade laserljus kan orsaka permanenta skador de flesta PMTs. Placera PMT så att dess aktiva området ligger så nära den markerade brännpunkt som möjligt. Anslut PMT församlingen till att fokusera objektivet med justerbar lins rör, och försiktigt svepa mörk tejp runt alla exponerade balk vägar efter hål.
7. Sätt på lasern, men se till att hålla sin makt extremt låga så att fluorescens utsläpp är knappt synlig. Slå på PMT, noggrant läsa sin spänning på ett oscilloskop som styrspänning ökar. En PMT genererar signalen genom en serie av elektron multiplicera steg, om photocurrent är för hög för det infallande ljuset nivå kan röretirreversibelt skadade. PMTs med strömbegränsande kretsar därför rekommenderas starkt, speciellt för användare som inte har arbetat med sådana detektorer innan.
   Öka PMT styrspänningen tills en spik-liknande avläsning och / eller en DC-offset kan ses på oscilloskopet skärmen, för de flesta PMTs kommer denna signal vara negativ i förhållande till marken. Bekräfta att denna signal verkligen beror på fluorescens genom att stänga av lasern strömmen att iaktta en signalförlust.
8. Slutligen iterativt anpassa hål för maximal signal på oscilloskopet genom att först manipulera fokusera linsen z-position, och sedan justera YZ översättningen scenen.
9. Videon ränta mikroskop hårdvaran är klar! Nu ansluter speglarna, anpassade styrelser kontroll, och datorn som diagrammed i Fig. 3. Som ovan, rekommenderas att använda bildhanteringssystem att först visualisera en känd storlek standard för att hitta den optimala lösningen av mikroskop och beräkna pixel-Till-upplösning konstant för de Imaging System. Det finns många stora standarder som kan användas, exempelvis vita visitkort med välkända brev storlekar, fluorescens eller reflekterande luft mål kraft, och fluorescerande mikrosfärer.

5. Förbereda systemet för konfokal skanning microendoscopy

I detta bygger vi använda en enhetlig bild fiber, som består av en bunt av många tusen fibrer gjutkärnor; ett sådant arrangemang ger en bild som kan överföras via fiber och lätt rekonstrueras och / eller utökade i andra änden (Fig. 4). Sammanhängande fibrer bunt som används i byggandet av detta endoskop är polerad i båda ändarna, vilket gör det en så kallad "kontakt-mode" microendoscope. En i-fokus bilden kommer därför bara bildas när microendoscope spetsen förs i nära kontakt med ett objekt. I denna pseudo-konfokala arrangemang fokuserar mikroskop är scanning åtgärder lasern på ett fIber kärnan i taget, medan den konfokala hål säkerställer att inga out-of-fokus ljus från omgivande fibrer tillåts passera till detektorn. För olika bildprogram kan en uppsättning linser läggas på den distala spetsen för att möjliggöra framåtvänd, långväga fluorescens avbildning. Microoptic linser, samt gradient brytningsindex (GRIN) linser kan enkelt anpassas för denna användning, och kan fästas på distala fiberspetsen använda optisk kvalitet lim.

1. För att ställa in Imaging System för microendoscopy, försiktigt bort provet scenen och ersätta den med en fiber hålla skede (Figur 5). Doppa ena änden av fibern bunt i en svag lösning av färgämnet så att fluorescens utsläpp genereras jämnt över alla fibrer kärnor. Slå på scanning systemet och justera fiber innehavaren att få den andra änden av fibern paket (den proximala änden, eller slut närmast mikroskop optik) i fokus. Först använder Omräkningsjustering scrEWS att centrera fiber i det skannade området. Nu, titta på fluorescensen utsläpp bilden från proximala fiberspetsen vid skanning. När hela microendoscope ytan är i fokalplan mål kommer fluorescens utsläpp i alla fibrer kärnor vara så enhetlig som möjligt. Använd vinkeljustering vreden för att justera fiber ansiktet för att göra alla fiber kärnor jämnt ljus. Under denna justering blir det sannolikt nödvändigt att åter justera översättningen läge att åter centrera fiber i det skannade området. Iterera igenom dessa justeringar tills hela fiberspetsen är korrekt i fokus.
2. Innan du använder microendoscope försiktigt rengöra den distala spetsen använder papper rengöring av lätt fuktad med HPLC-klassificerad metanol. Liksom tidigare använder en känd storlek standard för att mäta och beräkna upplösningen av microendoscope Imaging System.

6. Representativa resultat:

Figur 6 visar ett exempel på en färdig UPRight konfokal scanning mikroskop konfigurerad för microendoscopy. Lasern och utsläpp balkar har upprättats som vägledning för ögat. En fiber montera håller bilden fibern på plats under microendoscopy drift. Denna fiber fäste kan lätt ersättas med en xy eller xyz översättning scenen för att användas som en upprätt mikroskop plattform. ThorLabs delar PT3 (XYZ översättning) eller två staplade PT1 stadier (XY översättning) fungerar bra för denna ansökan, tillsammans med en höger-tecknet som ThorLabs del AP90.

En video-rate framegrabber kortet används för att generera bilder från den inkommande signalen. Figur 7 visar ett representativt testbild tas ett gement "m" tryckt på en vit visitkort via video-rate mikroskop scanning system. Blekt Vitboken innehåller fluoroforer som exciteras av UV och blått ljus, vilket resulterar i den ljusa bakgrunden bakom mörka bokstaven "M". Ett utsläpp filter centrerad vid 515 nm valdes för att samla in denna fluorescerande utsläpp. A mInor förvrängning av bilden kan observeras, speciellt nära sidokanter bildramen. Denna snedvridning resultat från sinusformade scanning mönster 8 kHz gavlo spegeln, och kommer att diskuteras i detalj nedan.

Figur 1. Diagram visar funktionsprincip en konfokalmikroskop. Strålar som kommer från målet fokus förmedlas tillbaka genom systemet och fokuserad genom konfokala hål (röd). Rays ursprung antingen ovanför (blå) eller under (grön) målet fokus inte ur den parallellt målet, och därför inte effektivt överförs via konfokala hål.

Figur 2. Diagram som visar allt ljus stigar genom balk scanning system. Skanningen speglar sitter på plan telecentrisk med STAtionära, objektiv tillbaka bländare plan. Par linser mellan den stationära plan agera för att vidarebefordra skannade balkar. De två första reläet linser har samma brännvidd, bildar en 1:1 teleskop. Den andra par linser, känd formellt som skanningslinsen och rör objektivet, behöver inte vara lika i brännvidd, och ofta fungerar som en stråle expanderande teleskop för att säkerställa målet back-bländare är för fullt. Ljus som avges från provet färdas tillbaka genom scanning systemet och leds genom dikroiskt spegeln. En kort lins fokuserar utsläpp ljus genom konfokala hål, som sedan parallellt med en lins. En sista lins fokuserar konfokala-filtrerad utsläpp på en fotomultiplikatorn rör. Klicka här för en fullstor version av denna bild.

Figur 3. (A) Översikt diagram över skanning elektronik setup. Mikroskopet övergripande referenssignalen och tidbas är "Sync" TTL-utgång av den snabba axeln resonant galvo spegel, vilket genererar en TTL-puls vid slutet av varje skannad linje (dvs när galvo har genomfört en genomsökning cykel). Detta ger H-synk signal till framegrabber kort. Den galvo har synk utgången är också ansluten till V-sync styrkort, som stegvis ökar dess utspänning som svar på varje H-synkpuls att generera sågtand vågform som driver den långsamma skanning axeln. När alla rader har skannats genererar V-sync ombord återställer sågtand vågform och en TTL-puls som fungerar som framegrabber V-sync signal. Den slutliga bidrag till framegrabber kortet är den analoga signalen från fotomultiplikatorn röret (Observera att många PMTs genererar negativa utspänningen, vara säker på att designa din krets ettd Välj din hårdvara därefter). Videon ränta bilder genereras och visas i Matrox framegrabber programvara. (B) Exempel styrkretsen. I denna design, är spänningen på varje H-Sync puls "lagt" / integrerade på OP AMP integratör för att generera sågtand vågform rampen, pulser samtidigt räknas vid TTL disken scenen. När önskat antal rader har uppnåtts (dvs när rasterscan är klar), genererar räknaren en aktiv låg "utföra" puls, som driver Schmitt trigger för att generera ett återställa puls för integratör. Detta återställer både räknaren och OP AMP integratör, iordningställande kretsen för nästa cykel. Lämplig komponent val gör denna krets allmänt tillämpas på en mängd olika raster storlekar. Detta är bara ett genomförande, många andra implementationer är möjliga och kan vara att föredra under vissa omständigheter. Dessutom är denna krets avsedd att användas med Matrox framegrabber kortS som upptäcka och korrigera bilden fas automatiskt. Om kretsen ska användas tillsammans med andra framegrabbers kan faskorrektur kretsar eller programvara krävs. Klicka här för en fullstor version av denna bild.

Figur 4. Bildöverföring genom en konsekvent fiber bunt. I denna schematiska, glasen på båda sidor av paketet är på plats för att skala både bilden projiceras på fibern bunt ingång samt utöka bilden på fibern bunt utgång.

Figur 5. Exempel på en fiber bunt monterad i en 5-axlig fäste. En liten 1 "diameter aluminiumblock var uttråkad så att bilden fibern bunt skulle kunna införas. Fibern var epoxied inne i aluminium blocket på both toppen och botten av blocket för stabilitet.

Figur 6. Bilden av det ifyllda mikroskopi systemet med bifogade microendoscope. För att bättre visualisera ljuset vägar, är excitation strålens väg dras i blått, medan utsläppen strålgången efter dikroiskt spegeln dras som en röd linje.

Figur 7. Exempel på bild som genereras av video-kurs konfokal scanning mikroskopi system. En mörk bokstaven "M" visas på den ljusa fluorescens bakgrund av en vit visitkort.

Discussion

Denna video-rate bildsystem använder sig av en resonant galvanometric spegel som arbetar vid ca 8 kHz. Resonant speglar kan vara ganska högljudd när den körs på full effekt, och deras höga toner kan vara besvärande eller rentav farliga på tillräckligt exponeringstider. Även om inte visat här, rekommenderas för att skydda resonanta galvanometric spegel inuti en genomskinlig fall att avsevärt minska systemets volym och / eller för att bära lämplig höra skyddsutrustning, såsom öronproppar.

Den resonant galvanometric spegel skannar i en sinusformad mönster. Men framegrabber kort läsas i signalen antar en helt linjär Svephastighet i både horisontell och vertikal riktning. Eftersom en sinusformad sveper bromsar in vid kanterna av sökningen kan bildkomprimering artefakter observeras längs den snabba (horisontellt) bild axeln. Ett sätt att minimera detta problem är att medvetet driva resonant galvo utbud spegel skanning betydligt större änrelä linsens diameter. Genom att göra detta, kommer endast den nästan linjärt centrala svep av sinusformade skanna mönstret korsa provet, vilket minimerar bild snedvridningar. Ett annat tillvägagångssätt skulle vara att bearbeta insamlade bilderna till linjärisera den snabba axeln. Detta kan göras genom att avbilda en känd fluorescerande mönster (t.ex. galler) och använder kända mönster dimensioner för att skapa en bearbetning skript som unwarps de insamlade bilderna.

Denna speciella scanning systemet var utformat för att in vivo imaging, som ofta kräver en upprätt orienterad video-rate mikroskop. För cellulär imaging experiment, är omvänt mikroskop mer normalt används. Designen som presenteras här kan lätt ändras för att bygga en sådan inverterat mikroskop, allt som krävs är en rotation av de sista 2 "diameter spegel. Istället för att orientera spegeln för att styra scanning stråle nedåt, kan spegeln rikta strålen uppåt. Placering i objektivet ent på samma avstånd från spegeln tillsammans med ett urval skede skulle möjliggöra för avbildning i en inverterad geometri. Om Imaging System byggs enbart för microendoscopic avbildning, finns det ingen anledning att "vika" mikroskop designen vertikalt alls. Istället kan hela scanning system byggas på en enda övergripande bakbord med objektiv orienterade parallellt med den optiska bordet.

Observera att mikroskopet i detta bygga använder en fast hål konfiguration, medan detta ger för den största bygga enkelhet och anpassning, användare som önskar ett mer mångsidigt system kan överväga att införliva en variabel hål, som kan hittas i de flesta kommersiella konfokala mikroskop. Genom att låta användaren att justera storleken på hål för att kompensera för prover av olika utsläpp intensitet, ger detta för användaren att optimera avvägningen mellan signalstyrka och upplösning för ett givet prov.

LmOICE av bild fiber valts för mikroskop är viktigt. Vi rekommenderar Sumitomo samstämmig bild fibrer på grund av deras nära fiberkärna avstånd och låg relativ autofluorescens. Bild fibrer tillverkas av Fujikura har visat sig ha stora mängder autofluorescens ^10, som kan överväldiga svag fluorescens signaler från ett prov och begränsa den yttersta känslighet microendoscope. Sumitomo tillverkade fibrer, exempelvis 8-30N som används i denna specifika konfiguration, har mycket lägre autofluorescens nivåer än deras Fujikura motsvarigheter. Medan leeched fiberknippen kan anses attraktivt för microendoscopy ställer deras utformning typiskt individuella fiber kärnor för långt ifrån varandra, vilket innebär att fibern kärnor glest urval objekt, utelämna viktiga delar av potentiellt intresse.

Slutligen bör det noteras att medan mikroskop som beskrivs här kommer att vara användbart i en mängd olika in vitro och in vivo Applications och kan skapas för en bråkdel av kostnaden för en fullfjädrad kommersiella systemet, har det inte funktioner som genomlysning upptäckt, ett okular för visning, eller en strålens väg för icke-konfokala widefield epifluorescence. Även om det är möjligt att konstruera ett system med dessa funktioner från början, får läsare som önskar ett sådant system vill ändra ett befintligt kommersiella systemet för att möta deras behov snarare än att inleda ett helt nytt bygga.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
515 nm Band Pass Filter	Chroma Technology Corp.	HQ515/50M	46 FWHM
Achromatic Doublet Lens 25.4mm Dia. x 50mm FL, MgF2 Coating	Edmund Scientific	NT49-766
Achromatic Doublet Lens 25.4mm Dia. x 76.2mm FL, MgF2 Coating	Edmund Scientific	NT49-768
Achromatic Doublet Lens 25.4mm Dia. x 88.9mm FL, MgF2 Coating	Edmund Scientific	NT49-769
Achromatic Doublet Lens 50mm Dia. x 300mm FL, MgF2 Coating	Edmund Scientific	NT45-179
8 kHz R High Frequency Optical Scanner	Electro-Optical Products Corporation (EOPC)	SC-30	8 kHz
AGC Driver	Electro-Optical Products Corporation (EOPC)	ACG:8K
H7422-PA Photosensor Module	Hamamatsu Corp.	H7422-PA	Current limiting recommended
M9012 Power Supply	Hamamatsu Corp.	M9012	For use with H7422-PA
HC PL APO CS Objective	Leica Microsystems	11506284	10x/0.40
Solios eA/XA Framegrabber Card	Matrox	Solios eA/XA	MIL software required; –M interconnects recommended
12V Power Supply	Meanwell	LPV-100-12	+12V, 8.5A
5x Microscope Objective Lens	Newport Corp.	M-5X	0.10 NA, 25.4 mm Focal Length
Coherent Image Fiber	Sumitomo Bakelite Co., Ltd.	8-30N
1/4"-20 Cap Screw and Hardware Kit	Thorlabs Inc.	HW-KIT2
100 μm Mounted Pinhole	Thorlabs Inc.	P100S	Ideal for building spatial filters
30 mm Cage Cube Clamp	Thorlabs Inc.	B6C
30 mm Cage System Cube, 4-Way	Thorlabs Inc.	C4W
406 nm, 5 mW, B Pin Code, SM Fiber Pigtailed Laser Diode, FC/PC	Thorlabs Inc.	LPS-406-FC	Product obsolete; replaced by LP405-SF10
5-Minute Epoxy, 1 Ounce	Thorlabs Inc.	G14250
6 Axis Kinematic Optic Mount	Thorlabs Inc.	K6X
8-32 Cap Screw and Hardware Kit	Thorlabs Inc.	HW-KIT1
8-32 Setscrew and Hardware Kit	Thorlabs Inc.	HW-KIT3
Adapter with External RMS Threads and Internal SM1 Threads	Thorlabs Inc.	SM1A4
Adj. FC/PC and FC/APC Collimator, f = 2.0 mm, ARC: 400-600 nm	Thorlabs Inc.	CFC-2X-A	f = 2.0 mm
Adjustable Fiber Collimator Adapter, SM1 Threaded	Thorlabs Inc.	AD9.5F
Aluminum Breadboard, 12" x 18" x 1/2"	Thorlabs Inc.	MB1218	1/4"-20 Threaded
Benchtop Laser Diode/TEC Controller	Thorlabs Inc.	ITC4001	1 A/96 W
DMLP 425 nm Long-Pass Dichroic Mirror	Thorlabs Inc.	DMLP425
Kinematic Mount for 1" Optics	Thorlabs Inc.	KM100
LD/TEC Mount for ThorLabs Fiber-Pigtailed Laser Diodes	Thorlabs Inc.	LM9LP
Lens Mount for 18 mm Optics	Thorlabs Inc.	LMR18	One retaining ring included
Lens Mounts for 2" Optics	Thorlabs Inc.	LMR2S	With internal and external threading; retainer ring included
Mini Series Cage Assembly Rod, 6" Long, 4 mm, Qty. 1	Thorlabs Inc.	SR6
1.0" Pedestal Pillar Post, 8-32 Taps, 1" Long	Thorlabs Inc.	RS1P8E
1" Pillar Post Extension, Length=0.5	Thorlabs Inc.	RS05
1" Pillar Post Extension, Length=0.75"	Thorlabs Inc.	RS075
1" Protected Silver Mirror, 3.2 mm Thick	Thorlabs Inc.	ME1-P01
1" SM1 Rotating Adjustable Focusing Element, L = 1"	Thorlabs Inc.	SM1V10
2" Protected Silver Mirror, 3.2 mm Thick	Thorlabs Inc.	ME2-P01
P100S - 100 μm Mounted Pinhole	Thorlabs Inc.	P100S
Polaris Low Drift 1" Kinematic Mirror Mount	Thorlabs Inc.	POLARIS-K1	Low drift
SM1 Lens Tube, L = 1"	Thorlabs Inc.	SM1L-10	One retaining ring included
SM1 Threaded 30 mm Cage Plate, 0.35" Thick	Thorlabs Inc.	CP02
SM1 to M25 Optical Component Threading Adaptor	Thorlabs Inc.	SM1A24	External SM1 Threads and Internal M25.5x0.5 Threads
Small Beam Diameter Galvo System	Thorlabs Inc.	GVSM001
Small Clamping Fork	Thorlabs Inc.	CF125	1/25" counterbored slot, universal
Spatial Filter System	Thorlabs Inc.	KT310	Pinhole sold separately
TE-Cooled Mount for 5.6 & 9 mm Lasers	Thorlabs Inc.	TCLDM9
Vertical Bracket for Breadboards	Thorlabs Inc.	VB01	Each
Plan-Apochromat	Carl Zeiss, Inc.	1101-957	20x/0.75 NA