Summary
Özel, gerçek zamanlı bir konfokal tarama görüntüleme sistemi komple inşaat açıklanmıştır. Video hızı mikroskopi ve mikroendoskopi için kolayca kullanılabilen bu sistem, maliyetinin bir kısmını, standart ticari konfokal sistemlerini kullanarak erişilebilir değil görüntüleme geometrileri ve uygulamaları bir dizi sağlar.
Abstract
Mikroskopisi, hızlı, yüksek hassasiyet ve karmaşık sistemlerin yüksek çözünürlüklü optik kesitler sağlayarak, biyoloji ve biyomedikal bilimler paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Mikroskopisi, canlı hücreleri 2-4 spesifik hücresel hedefler 1, monitör dinamikleri rutin çalışma ve üç boyutlu tüm organizmalar 5,6 evrim görselleştirmek, örneğin kullanılır . Konfokal mikroendoskopların gibi konfokal görüntüleme sistemleri, Uzantıları, in vivo 7 yüksek çözünürlüklü görüntüleme için izin verir ve henüz klinik ortamlarda 8,9 hastalık görüntüleme ve teşhis uygulanmaktadır.
Mikroskopisi basit geometrik optik kullanarak sözde "optik bölümler" oluşturarak üç boyutlu çözünürlük sağlar. Standart bir geniş alan mikroskobu, floresan bir örneklem üzerinden üretilen bir objektif lens ile toplanır ve bir dedektör doğrudan iletti. Kabul ederkengörüntüleme ince örnekleri için mümkün, kalın örnekleri objektif odak düzlem üstünde ve altında üretilen floresan bulanık olur. Buna karşılık, konfokal mikroskopi reddederek, sanal örnek, optik kesit sağlar out-of-focus, örneklerin yüksek çözünürlüklü üç boyutlu temsilleri inşa ışık.
Konfokal mikroskoplar algılama ışın yolu bir konfokal diyafram kullanarak bu feat ulaşmak. Nesnel bir örnek alınan floresan tarama aynalar aracılığıyla ve geri birincil dikroik ayna, uzun, Stokes-kaymıştır floresans emisyon geçerken, lazer uyarma ışını gibi kısa dalga boylarında yansıtmak için dikkatlice seçilen bir ayna aracılığıyla iletti. Bu uzun dalga boyunda floresans sinyalinin ardından, objektif lens odak düzlemli ile tam olarak konjuge bir düzlemde konumlandırılmış bir iğne deliği iki tarafında lenslerin bir çift geçti. Nesne odak hacmi toplanan Fotonlar collimatedobjektif lens ve iğne deliğinden konfokal lensler odaklanmıştır. Bu nedenle odak düzlem üzerinde veya altında üretilen Floresans düzgün collimated olmayabilir, ve mikroskop odak sadece ışık görünür olduğu bir optik kesit yaratırken, konfokal iğne deliği 1 ile geçmek olmaz . (Şekil 1). Böylece iğne deliği etkili, sadece tek bir sınırlı mekansal konumu tespit edilen emisyon hapsetmesi odak düzlemli bir sanal diyafram gibi davranır.
Modern ticari konfokal mikroskoplar, nispeten basit ve erişilebilir eski karmaşık görüntüleme yöntemleri, kullanıcıların tam otomatik çalışma imkanı sunar. Bu sistemlerin esneklik ve güç olmasına rağmen, ticari konfokal mikroskoplar birçok in vivo görüntüleme uygulamaları gibi tüm konfokal görüntüleme görevleri için uygun değildir. Onların ihtiyaçlarını karşılamak için özelleştirilmiş görüntüleme sistemleri yaratma yeteneği olmadan, tepkiler, önemli deneyler dışında kalanpek çok bilim adamı saat.
Bu makalede, biz temel bileşenlerinden özel bir video-rate konfokal görüntüleme sistemi yapımı için adım adım bir yöntem sağlar. Dik mikroskop, standart bir hız rezonans galvanometric ayna yavaş eksen taraması, hızlı tarama ekseni sağlamak için bir rezonans galvanometric ayna kullanılarak inşa edilecek. Objektif lens odak kesin bir taranan ışını oluşturmak için, bu aynalar dört röle lensler kullanarak sözde telesentrik uçakları konumda olacaktır. Konfokal algılama standart, off-the-raf photomultiplier tüp (PMT) kullanılarak gerçekleştirilebilir ve yakalanan görüntülerin ve Matrox Framegrabber kartı kartı ile birlikte gelen yazılımı kullanarak görünecektir.
Protocol
Lazer dalga boyu, dikroik ayna ve optik filtreler seçim deneyde kullanılan özel boyalar dayalı olarak belirlenmelidir. Örneğin, Alexa Fluor 488 ile boyanmış örnek bir konfokal görüntüleme en iyi 488 nm lazer, 500 nm uzun geçiş dikroik ayna, 515 nm dalga boyunda merkezli bir 30 nm bant genişliği bandpass ayna kullanılarak gerçekleştirilir. Buna karşılık, kırmızı boya Alexa Fluor 647 konfokal görüntüleme bileşenlerin farklı bir dizi gerektirir. Bu protokol mikroskop, 400 nm dalga boyunda güçlü emer ve 450 nm ötesine yayan herhangi bir boya görselleştirmek için inşa edilmiştir. Bu nedenle, 406 nm eksitasyon lazer seçti ve 425 nm uzun geçiş dikroik lazer ışını yansıtacak. Uyarılmış fluorophores seçici uygun emisyon filtreleri seçerek hayal edilebilir. Protokol boyunca uygun optik montaj donanımı kullanmak önemlidir; yanlış veya derme çatma donanım yanı sıra hizalama tutamaz ve bir güvenlik tehlikesi olabilir.
<p class = "jove_title"> 1. Rezonans galvanometric ayna ve röle optik ayarlamaKonfokal tarama sistemi, her türlü binada önemli bir kavramdır telecentricity. Telesentrik bir optik sistem, mercekler sistemi büyütme sadece odak uzunlukları 1 oranı tarafından tanımlanmış olduğu gibi, odak uzunlukları, toplamı birbirinden aralıklı vardır. Bu büyütmeler ve böylece sistem özellikleri, lens seçimi ile kolayca tanımlanan bir optik röle sistemi inşaat sağlar. Bir diğer önemli kavram da "diyafram uçakları" olarak adlandırılan sözde "durağan" optik uçaklar, içerir. Bir diyafram düzlemine ışık demeti yanal hareket her türlü uğramaz optik yol boyunca bir konumdur. Birinci ve ikinci tarama aynalar ve objektif lens arka-diyafram: Bu mikroskop tasarımında üç önemli diyafram uçakları vardır. En iyi ışık SCA ulaşmak içinobjektif odak düzlemi nning, objektif lens arka diyafram giren ışın açısı sadece süpürme, sabit olmalıdır. Bu sabit, açı-süpürüldü düzlemi oluşturmak için, biz amacı, arka-diyafram konjuge ilk ve ikinci tarama aynalar, telesentrik uçaklar yerleştirmeniz gerekir. Aynalar ve objektif lens arasına yerleştirilir Lensler bu sabit uçakları (Şekil 2) arasındaki açı taranmış ışın röle hizmet vermektedir. Görüntüleme düzlemi (X ve Y) belirli bir yönde taramak için sorumlu, her biri iki, tarama galvos, tarama aynalar üzerine monte edilir. Video-rate görüntüleme için gerekli hat tarama hızı elde etmek için x-ekseni (aynı zamanda "hızlı" ekseni olarak da bilinir), yüksek frekanslı bir rezonans galvo tarama gereklidir. Bu galvos sinüzoidal bir tarama deseni oluşturmak için hassas, kapalı-döngü geri besleme devresi kullanan ve çok yüksek frekanslarda çalışan kapasitesine sahip olan bu yapı için 8 kHz galvo seçilir.
- Kurmakfiber optik montaj kolimatör ve kabaca yatay ve dikey düz bir çizgide hareket ayar vidası kullanarak ışını yönlendirmek. Şimdi, bir iris ve fiber kolimatör önünde ışın iris merkezi aracılığıyla temiz geçtiği iris dikey yüksekliği ayarlamak. Sonra, ışın yolu boyunca kolimatör uzak iris taşımak ve ışın hala iris merkezi dolaşır gözlemleyin. Aksi takdirde, iki ayar vidası kullanarak iris ışın konumunu ayarlamak.
- Ayna yaklaşık merkezine yerleştirilmiş lazer ışını ile ışın yolu monte dikroik ayna yerleştirin. Masaya ayna sıkma önce, yaklaşık 90 derece ışınını ve kabaca yansıyan lazer ışını dikey yüksekliği değişmez böylece yansıması ayarlamak için ayna sahibi döndürün.
- Araba alarak, içine monte edilmiş bir lazer ışını yolu rezonans galvanometric ayna yerleştirine lazer ışını, ayna yüzeyine tam yatay merkezine yerleştirilmiş olduğundan emin olmak için. Bu protokol, rezonans galvo ayna ayna monte doğrudan expoxied oldu. 90 derecelik bir açıyla lazer ışını yansıtacak şekilde ayna monte döndürün. Kabaca aynı lazer ışını dikey yüksekliği korumak için, aynada kapalı yansıması ayarlayın.
- Belirli bir yöne yönlendirmek için herhangi bir ışık ışını, bir tanım olarak ray Seyahat edeceğiniz uzayda iki nokta tanımlamanız gerekir. Bu genellikle iki süsen yerleştirerek istenilen yatay ve dikey yol boyunca ve her iris merkezinde geçmesine lazer ışını manipüle tarafından gerçekleştirilir. Dört serbestlik derecesi ışın ayarlamak için gerekli olan, her iris için özgürlük iki yatay ve dikey derece. Özgürlük bu derece elde etmek için en yaygın ve en basit yolu, iki yön için aynalar, ya da "yürümek," bir lazer ışını kullanmaktır.
Iki süsen alın ve dikey yüksekliği olarak ayarlamakAdım 1.1 'de, lazer ışını kullanarak bir referans olarak rezonans galvo ayna yardımıyla yansıtılır. Şimdi, göz için bir rehber olarak optik breadboard vida deliklerini kullanarak, düz bir hat üzerinde aşağı iki süsen kelepçe. - Dikroik ayna ve iki süsen merkezi aracılığıyla lazer ışını yönlendirmek için rezonans galvo ayna ayarlayın. Sonra ikinci iris ilk iris ışın demeti merkezi yolunda ikinci bir ayna kullanın (rezonans galvo ayna) merkezi yolunda ilk ayna (dikroik ayna) kullanın. Işın hem süsen ile aynı hizaya gelene kadar Iteratively rezonans galvo aynadan yansıyan lazer ışını hala yaklaşık ayna merkezine yansıdığı boyunca sağlanması, bu iki ayna ayarlamak. Işın sapan varsa, fiber kolimatör monte ayarlamak ve üzeri iteratif adımları tekrarlayın.
- Hem süsen merkezli ışını ile, şimdi görüntü bizim ilk kırtasiye, telesentrik planı iki röle lens yerleştirire (yani, rezonans galvo ayna) ikinci kırtasiye, telesentrik düzlem üzerine (yani, standart hızda galvo ayna). Bu özel mikroskop için, ilk röle seçilen lensler aynı odak uzaklığı, "f", bizim telesentrik sistemde iki ayna arasındaki mesafe sadece 4f. Lensler hassas ışın yolu merkezli olduğundan emin olmak için, objektif uyum hile kullanmak. Işın yolunda ilk lens ve objektif ışın yolu yanındaki iris lazer ışını spot bakmak. Daha sonra, dikey ışının dikey merkezine kadar iris merkezinde olduğunu lens yüksekliğini ayarlayın. Son olarak, iris yatay ışın demeti merkezi konumunu ayarlamak. Bu ikinci lens için aynı prosedürü taşıyın.
2. Ikinci tarama ayna ayarlama ve mikroskop dönen
- Ikinci telesentrik uçağı tam konumu bulmak için, rezonans galvo kancabirim tarama ve açın. Iki objektif ile tarama ışını takip etmek için beyaz bir kartvizit kullanın. Lazer ışını tamamen sabit görünecektir rezonans galvo, 4f yaklaşık mesafe telesentrik düzlemde bulacaksınız. Breadboard bu pozisyonunu işaretleyin.
- Tam olarak bu telesentrik uçak yerde standart tarama galvo ayna yerleştirin ve ayna yüksekliği ve telesentrik düzlemde ışın tarama ayna tam merkezinde grevler böyle konumunu ayarlamak. Bu güç ayna ayna, bu işlem sırasında nötral pozisyonda yerleşir, böylece kontrol ve donanım tarama ayna giriş 0 voltluk bir gerilim koymak için çok önemlidir. Dikkatle ışın dikey doğrudan ayna açısını ayarlamak ve pozisyonda ayna hafifçe sıkın.
- Biz dik bir mikroskop gibi, şimdi, 90 derece vidalanir 90 derecelik bir açıyla ikinci breadboard eklenecektir. Kapatmak için emin olunlazer ve tarama elektronik, fiber kesmek ve bu işlem sırasında tarama aynalar bağlantısını kesin. Parantez yerde civatalı kez, kolay uyum geri kalanı için, dikkatli bir şekilde yeni breadboard şimdi düz yatarken, böylece tüm mikroskop döndürün. Breadboard çalışma yüzeyi düzeltmek için bir kelepçe kullanın. Şimdi eski dikey kurulum kalan düz breadboard kolayca yürütülmektedir olabilir.
3. Tarama, tüp ve objektif lensleri ayarlama
Sonra, resmen, "tarama lens" ve "tüp objektif" olarak anılacaktır röle lensler, ikinci seti kuracaktır. Objektif odak noktasında doğru büyütme ulaşmak ve nihai görüntü çözünürlüğünü optimize etmek amacıyla lensler doğru kombinasyonu seçmek için önemlidir. Öncelikle, herhangi bir objektif lens maksimum sayısal açıklık (NA) elde etmek için, objektif geri çarpıcı bir lazer ışını doldurmanız gerekmektedirgeri diyafram tamamen objektif lens, sadece o dar odak oluşturmak mümkün olacaktır. Amaç lensler arka diyafram boyutta bir dizi var; bir lens büyütme oranı seçti, seçilen hedefi biraz arka diyafram aşırı doldurmayın. İkincisi, doğru büyütme elde etmek için, objektif lens tasarlanmış olduğu tüp lens odak uzaklığı ile uyumlu olmalıdır. Ne yazık ki, farklı mikroskop objektif üreticilerinden farklı tüp lens odak uzunluklarında kullanmayı seçmiş, bu nedenle, istihdam edilen özel objektif lens için doğru tüp lens ile bir mikroskop inşa etmek önemlidir. Ayrıca, böyle Zeiss gibi bazı üreticiler, uygunsuz bir amaç-tube lens çifti kullanarak, aksi takdirde mevcut olmazdı aslında yeni sapmaları tanıtacak, onların eşleşen hedefi belirli renk sapmalarını telafi etmek için tüp lensler dizayn. Th tüm kromatik tazminat yapılır gibi tipik olarak, Olympus hedefleri tercihe hedefi kendisi, daha kolay eşleştirme hedefi / tüp lens. Objektif ve tüp lens eşleşmiyorsa mikroskop hala çalışır olmasına rağmen, gerçek bir mikroskop büyütme ihtimalle objektif lens listelenen büyütme eşleşmiyor. Oluşturmak için bu özel mikroskop, optimal geri diyafram boyutu tarama lens ve tüp lens arasında 01:04 büyütme oranı gerektiren, 4 mm olarak belirlenmiştir. Bu özel mikroskop kurmak için, lens tarama uzunluğu 75 mm ve 300 mm tüp objektif uzunluğu kullanabilirsiniz.
- Ikinci tarama ayna ve objektif odak noktası arasındaki toplam mesafe büyük olduğu için, mikroskop bu segmentte inşa ilk düzeni objektife ışını yönlendirmek için gerekli olan aynalar. Ilk büyük, 2 "(50 mm) breadboard kenarına yakın çapı ayna yerleştirin ve yaklaşık 90 derece lazer ışını yansıtacak şekilde ayna monte döndürmek. Kabaca aynı dikey bea korumak için, aynada kapalı yansıması ayarlamakm yüksekliğinde. 90 derecelik bir açıyla aşağı doğru ışın yönlendirir bir oryantasyon breadboard zıt ucunda diğer 2 "ayna yerleştirin. Işın dikey yüksekliği değişmez sağlamak için ayar vidası kullanın. Adım 1.4 gibi iki süsen ayarlayın ve süsen ışın merkezi için 1,5 adımı yönettiği iki aynalar ayarlayabilirsiniz.
- Ilk iris lazer nokta hala yerinde gözbebekleriyle, ışın yolu tarama objektif ve merkezi, yatay ve dikey konumunu ayarlamak. Mesafe 75 mm + 300 mm lens (iki ayna arasındaki), geniş 2 "boru objektif dikkatlice yerleştirin ve ilk iris ışın merkezi, yatay ve dikey konumunu ayarlamak anda. Gelecekte uyum sağlamak amacıyla, bu yerde bu süsen terk etmek yararlı olur; bu uygulama için, bir kartvizit uygun büyüklükte bir delik ile bir stand yapıştırılmış olabilir ve ışın yolu takılı.
- Bütün aynalar ve mercekler ileşimdi bir yerde, rezonans galvo ayna ve standart tarama ayna tarama başlar. Bu yapı, standart tarama aynası sonunda rezonans Şekil 3'te açıklanan özel olarak geliştirilmiş bir kontrol devresi aracılığıyla ayna tarama hızı senkronize olacak, bu üstün dikey ve yatay senkronizasyon sağlar. Ancak, hizalama amaçlar ve birçok görüntüleme uygulamaları için, ayna bir fonksiyon jeneratörü bir testere dişi desen kullanarak kolayca taranan olabilir. Tüp lens sonra bir iş kartı kullanarak, lazer ışınını bir konumda 300 mm bulun. Işın, dikey ve yatay yönde hem de mikroskop başka tarama olmasına rağmen, ışın, bu mükemmel konuma en yakın sabit olmalıdır. Bu objektif lens arka diyafram nerede alınacaktır. Işın yolu boyunca aynı düzlem, yatay ve dikey sabit düzlemler uyuşmuyorsa, dikkatli bir şekilde olmasını sağlamak için optik yol boyunca çözülme ve tüp lens çevirmekhem de uçaklar mümkün olduğunca yakından örtüşmektedir. Ynt merkezi tüp lens pozisyonu ve dikey ve yatay pozisyonda güvenli bir şekilde kelepçe.
- Objektif lens geri diyafram, mümkün olduğu kadar sabit bir düzleme yakın olarak konumlandırmak için emin olun, ışın yolu objektif lens yerleştirin. Gerçek amacı geri diyafram aslında her zaman hedefi değişen üretici tasarım seçimler nedeniyle fiziksel arka açılışında yer olmayabilir. Bu her zaman en iyi, bu yüzden gerçek arka diyafram konumunu belirlemek için üretici ile onay.
- Z-eksenli hareket için izin verecek çeviri montaj objektif lens takma içine çalıştırmadan tam aralığı üzerinde taşıyabilirsiniz emin olun, örnek sahne ayarlayın.
4. Konfokal iğne deliği ve dedektör kurma ve hizalayarak
- Tüm güç kaynakları ve fiber optik ayırın ve tekrar rezonans tutan breadboard dayanmaktadır mikroskop montaj gibi döndürün.nant tarama ayna. Hem galvos ve kumanda kabloları yerde güvenli bir breadboard Kelepçe sonra kolimatör fiber yeniden bağlayın ve yeniden bağlayın. Daha önce olduğu gibi, kontrol gerilimi 0 volt standart tarama galvo sürüş.
- Örnek aşamada, iki lamelleri arasında sıkışmış bir kartvizit veya objektif odak parlak bir boya küçük hacimli bir yer. Boya seçimi seçilen lazer ve dikroik bağlıdır, bu durumda biz konfokal algılama sistemi hizalamak için beyaz bir kartvizit floresans emisyon kullanacağız. Kuantum nokta da parlak ve photobleach hizalama amaçlar için yararlı olabilir. Diğer alternatifler parlak floresan her ikisi de renk / çamaşırhane parlatıcı maruz floresan boncuk ve / veya kumaş örnekleri, içerir. Lazer kaynağı açın ve örnek çeviri aşamasında mikroskop kullanarak odak noktası haline getirmek. Bir kez odak, örnek üretilen floresan t arkasında görünür olmalıbir sonraki adımda anlatıldığı gibi o dikroik ayna. Mümkün olduğunca parlak floresan yapmak için lazer gücü en üst düzeye çıkarın.
- Dikroik ayna tarama sistemi ile objektif lens ve arka ile örnek bir iş kartı kullanarak, floresan emisyon iz. Dikroik ayna lazer ışını yansıtan floresan emisyon iletir; dikroik ayna, diğer tarafta bu floresan sinyal bulmak. Şimdi, dikroik ayna arkasında bir ayna yerleştirin ve 90 derecelik bir açıyla emisyon yansıtacak şekilde kullanabilirsiniz. Adım 1.1 'de olduğu gibi, bir iris alın ve mümkün olduğu kadar düz ve breadboard paralel olarak floresan ışını doğrudan ayna ile birlikte kullanabilirsiniz. Bu adım, en iyi loş ışıkta yapılmalıdır.
- Şekil 2'de açıklandığı gibi konfokal iğne deliği birim ayarlayın. Biz, ThorLabs mekansal filtre kafesi montaj montaj bu görev için ideal olduğunu bulduk. Uygun bir pinhol seçmek önemlidir.E boyutu konfokal sistemi çok fazla sinyali ödün vermeden, en uygun çözünürlüğü ulaştığı sağlamak. Bu özel mikroskop için, 100 mikron kalınlığında bir iğne deliği boyutu seçildi. Floresans emisyon kiriş üzerinde merkezi ilk odaklı lens montaj bakımı, floresan ışıma yolu ile uyumlu mekansal filtre ünitesi yerleştirin. Net bir odak, iğne deliği yüzeyinde görülebilir kadar kısa bir odak uzaklığı lens birimi (bir mikroskop amacı da kullanılabilir) monte ettikten sonra, z-çeviri montaj kaydırın. Floresan ışın tarafından belirlenen tam düz bir çizgi boyunca tüm birim odaklı olduğundan emin olun. Breadboard birim Kelepçe.
En örneklerinden emisyon karanlık odalarda bile ortam ışık seviyelerine göre zayıftır. Bu nedenle yeterli koruyucu / ışık baffling kaçak ışık kirlenmeye karşı korumak için emisyon yol boyunca kullanılır olması çok önemlidir. Ayrıca, yüksek ortam ışık seviyeleri, özellikle aşırı yük ve hasar birçok Proje Yönetim Ekipleri, hiçbir current koruma. Burada gösterilen bir gibi düzgün korumalı bir sistem, herhangi bir kaçak ışık kirliliğine karşı küçük oda ışığında operasyon yeteneğine sahiptir; Okuyucular bu nedenle güçlü bir emisyon ışın yolu çevrelemek için objektif tüpleri kullanmak için teşvik edilmektedir. - Şimdi, çeviri aşamasında ayar düğmeleri kullanarak, sistematik konfokal iğne deliği iğne deliğinden floresan sinyali maksimize noktasını bulmak için hareket. Bu pozisyon, en kolay iğne deliği montaj yüzeyi üzerinde bir 2D arama yapmak için iki eksen ayarı iteratif ile tanımlanır. Sinyali maksimize konumu tespit edildikten sonra, iğne deliği sonra kafes monte collimating objektif yerleştirin. Bir iş kartı kullanarak konfokal birim geçer floresans emisyon bulun ve yayılan floresan sinyali mümkün olduğunca collimated kadar Mesajları boyunca collimating objektif slayt. Işın collimated sonra, objektif bir küvet ışın yolu uygun bir filtre yerleştirmek için emin olune.
- Photomultiplier tüp (PMT) montaj ayarlayın. Floresans emisyon ışın yolu 50 mm odak uzaklığı lens yerleştirin ve bir iş kartı kullanarak odak noktası bulmak. Breadboard bu pozisyonunu işaretleyin. Şimdi, lazer tamamen kapatmak bu önemli, sokak veya zayıflatılmamış lazer ışığı en Proje Yönetim Ekipleri kalıcı olarak zarar verebilir. PMT aktif alan, mümkün olduğu kadar belirgin bir odak noktası yakın olarak yer alır, böylece yerleştirin. PMT montaj ayarlanabilir objektifi, tüpler kullanarak odaklama lens bağlayın ve iğne deliği dikkatle takip maruz kalan tüm ışın yolları etrafında koyu bir bant sarın.
- Lazer açın, ancak floresans emisyon zor görünür olduğu gibi son derece düşük güç tutmak için emin olun. Kontrol gerilimi arttıkça dikkatli bir osiloskop üzerindeki voltaj okuma, PMT açın. PMT elektron çarparak aşamalarında bir dizi sinyal üretir; giderimi ışık seviyesi çok yüksek ise, tüp olabilirBu nedenle akım sınırlama devresi ile geri dönüşümsüz hasar görmüş. Proje Yönetim Ekipleri yüksek, özellikle önce bu dedektörleri ile görev almamış kullanıcılar için tavsiye edilir.
Bir başak gibi okuma ve / veya DC ofset osiloskop ekranında görülebilir kadar PMT kontrol gerilimi artırmak; en Proje Yönetim Ekipleri, bu sinyalin toprağa olumsuz bağlı olacaktır. Bu sinyal aslında sinyal kaybı gözlemlemek için lazer gücü kapatarak floresans ortaya çıktığı onaylayın. - Son olarak, iteratif ilk odaklama lens z-pozisyon güçlendirilmesi ve ardından yz çeviri aşamasında ayarlayarak osiloskop maksimum sinyal için iğne deliği hizalamak.
- Video hızı mikroskop donanım tamamlandı! Şimdi Şekil 3 diyagramlanabilmiştir aynalar, özel denetim kurulları ve bilgisayar kanca. Yukarıdaki gibi, mikroskop, optimal çözüm bulmak için bilinen bir boyut standardı görselleştirmek ve piksel hesaplamak için görüntüleme sistemi kullanılması tavsiye edilirÇözünürlüklü görüntüleme sistemi için sabit. Gibi bilinen harf boyutları, floresan veya yansıtıcı hava kuvvetleri hedefleri ve floresan mikrosferleri beyaz kartvizit olarak kullanılabilecek birçok boyutu standartları vardır.
5. Konfokal tarama mikroendoskopi için sistem hazırlamak
Biz binlerce fiber çekirdek bir paket oluşan tutarlı bir görüntü, fiber, inşa, lif ve kolayca yeniden inşa ve / veya diğer ucunu (Şekil 4) genişletilmiş bir görüntü üzerinden iletilebilmesi için böyle bir düzenleme sağlar. Bu endoskop yapımında kullanılan tutarlı bir elyaf demeti, her iki uçta da sözde bir "temas-mode" mikroendoskop parlatılır. Mikroendoskop ucu bir nesne ile yakın temas içinde getirilen bir odak görüntü bu nedenle sadece oluşturulacak. Bu sözde-konfokal düzenleme, mikroskop tarama eylem bir f lazer odaklanıriber çekirdeği, bir defada konfokal iğne deliği çevresindeki lifleri hiçbir out-of-focus ışık detektörü geçmesine izin verildiğini sağlar. Lenslerin bir dizi farklı görüntüleme uygulamaları için, ileriye bakan, uzun mesafe floresans görüntüleme için izin distal ucunda eklenebilir. Microoptic lensler, yanı sıra degrade refraktif indeks (GRIN) lensler, bu kullanım için kolayca adapte edilebilir ve distal fiber optik kalitesi yapıştırıcılar kullanarak ucu yapıştırılmış olabilir.
- Mikroendoskopi için görüntüleme sistemi kurmak için, örnek aşamasında dikkatlice çıkarın ve bir fiber tutma aşamasında (Şekil 5) ile değiştirin. Fiber çekirdek tamamında bu floresans emisyon eşit yaratılmış bir ucunu, boya, zayıf bir çözüm lif demeti Dip. Tarama sistemi açın ve lif tutucu odak elyaf demeti (proksimal ucunda, ya da mikroskop optik yakın sonu) diğer ucunu getirmek için ayarlamak. Öncelikle, çeviri ayarı scrTaranan alanın merkezine ews lif. Şimdi, tarama sırasında proksimal fiber uçlu floresans emisyon görüntü bakmak. Mikroendoskop yüzey objektif odak düzlemine olduğunda, tüm lif çekirdek floresans emisyon mümkün olduğunca tekdüze olacaktır. Fiber yüz ayarlamak için tüm elyaf çekirdeği eşit parlak yapmak için açı ayar düğmeleri kullanın. Bu ayar sırasında, büyük olasılıkla çeviri pozisyonunu yeniden ayarlamak için taranan alanın yeniden merkezi fiber gerekli olacaktır. Bu ayarlamalar yineleme tüm fiber ucu odak düzgün kadar.
- Mikroendoskop kullanmadan önce, HPLC-grade metanol ile hafifçe ıslatılmış lens temizleme kağıdı kullanarak distal ucu nazikçe temizleyin. Daha önce olduğu gibi, mikroendoskop görüntüleme sistemi çözünürlüğünü ölçmek ve hesaplamak için bilinen bir boyut standardı kullanabilir.
6. Temsilcisi Sonuçlar:
Şekil 6 bitmiş upr bir örnek gösteriright konfokal tarama mikroskobu mikroendoskopi için yapılandırılmış. Lazer ve emisyon kirişler göze bir rehber olarak hazırlanmıştır. Bir fiber mount mikroendoskopi işlemi sırasında yerinde görüntü, fiber tutar. Bu fiber montaj, dik bir mikroskop platformu olarak kullanmak için bir xy veya xyz çeviri aşamasında kolaylıkla değiştirilebilir. ThorLabs parça PT3 (XYZ çeviri) veya iki ThorLabs parçası AP90 gibi bir sağ açılı ayraç ile birlikte, bu uygulama için iyi PT1 aşamaları (XY çeviri) iş yığılmış.
Video hızı Framegrabber kartı kart gelen sinyali görüntüleri oluşturmak için kullanılır. Şekil 7 video oranı mikroskop tarama sistemi kullanarak beyaz bir kartvizit üzerinde yazılı "m" daha düşük bir durum alınan bir temsilci test görüntüsünü gösterir. Ağartılmış beyaz kağıt karanlık "m" harfi arkasında parlak bir arka planda, UV ve mavi ışık heyecanlıyız fluorophores içerir. 515 nm merkezli bir emisyon filtresi, bu floresan emisyon toplamak için seçildi. A mözellikle, görüntü çerçevesinin yatay kenarlarına yakın görüntü inorganik bozulma görülebilir. Sinüzoidal, tarama, 8kHz gavlo ayna desen, ve bu çarpıklığın sonuçları aşağıda ayrıntılı olarak ele alınacaktır.
Şekil 1 konfokal mikroskop çalışma prensibi gösteren diyagram. Objektif odak kaynaklanan Rays sistem üzerinden geçirilmemiş ve konfokal iğne deliği (kırmızı) üzerinden duruldu. Konfokal iğne deliğinden ya da yukarıda (mavi) veya aşağıda (yeşil) objektif odak collimated hedefi ortaya yoktur ve bu nedenle kaynaklanan Rays verimli bir şekilde iletilmez.
Şekil 2 ışını tarama sistemi sayesinde tüm ışık yolları gösteren diyagram. Tarama aynalar sta telesentrik uçakları oturuptionary, objektif geri diyafram uçağı. Sabit uçaklar arasındaki lensler çiftleri röle taranan kirişler hareket. İlk iki röle lensler, 01:01 teleskop kurma, eşit odak uzunluklarında var. Resmen tarama lens ve tüp objektif olarak bilinen lenslerin ikinci çifti, odak uzunluğuna eşit olması gerekir ve sık sık arka diyafram kapasitesinin üzerinde hedefi sağlamak için bir ışın genişleyen teleskop olarak hizmet yok. Örnek yayılan Işık tarama sistemi üzerinden seyahatler ve dikroik ayna geçirilir. Kısa bir odak lens, sonra bir lens tarafından collimated konfokal iğne deliği aracılığıyla emisyon ışığı odaklanır. Son bir lens, bir photomultiplier boru üzerine konfokal filtrelenmiş emisyon odaklanır . Bu görüntünün tam boyutlu sürümünü görmek için buraya tıklayın .
Şekil 3. (a) Genel tarama elektronik kurulum diyagramı. Mikroskop genel referans sinyal ve zaman tabanı (yani galvo bir tarama döngüsü tamamladı) taranan her satırın sonunda bir TTL darbe üretir hızlı eksen rezonans galvo ayna, "eşitleme" TTL çıkışı. Bu Framegrabber kartı kart için H-sync sinyali sağlar. Galvo senkron çıkışı da aşamalı olarak yavaş tarama eksen sürücüleri testere dişi dalga üretmek için her bir H-sync darbe yanıt olarak çıkış gerilimi artırır V-sync kontrol paneli bağlı. Bir kez tüm hatlar tarandıktan, V-sync kurulu sıfırlar testere dişi dalga ve Framegrabber kartı V-sync sinyali olarak hizmet veren bir TTL darbe üretir. Framegrabber kartı kartı son giriş photomultiplier tüp (birçok Proje Yönetim Ekipleri negatif çıkış voltajı üretir unutmayın analog sinyal, bir devre tasarımı emin olund) buna göre donanım seçebilirsiniz. Matrox Framegrabber kartı yazılımı video hızı görüntüler oluşturulur ve görüntülenir. (B) Örnek kontrol devresi. Bu tasarımda, her H-Sync darbe gerilim ekledi: "" / testere dişi dalga rampa oluşturmak için, op-amp entegratörü az entegre, bakliyat, eş zamanlı olarak TTL sayacı aşamasında sayılır. İstenilen sayıda satır (yani, raster tarama işlemi tamamlandıktan) ulaşıldığında, sayaç, bir aktif-düşük nabız, Schmitt tetikleme sürücüler entegratörü için bir sıfırlama darbe oluşturmak için "yürütmek" üretir. Bu sıfırlar sayacı ve op-amp entegratörü, hem sonraki döngü için devre readying. Uygun bileşen seçimi bu devre çeşitli raster boyutta yaygın olarak uygulanabilir hale getirir. Bu sadece bir uygulama, çok sayıda diğer uygulamaları mümkündür ve bazı durumlarda tercih edilebilir. Ayrıca, bu devre Matrox Framegrabber kartı kartı ile kullanmak için tasarlanmıştır.algılar ve otomatik olarak görüntü faz doğru. Devrenin diğer framegrabbers ile birlikte kullanılmak üzere ise, faz düzeltme devresi ya da yazılım gerekli olabilir. Bu görüntünün tam boyutlu sürümünü görmek için buraya tıklayın.
Şekil 4 tutarlı bir elyaf demeti üzerinden görüntü aktarımı. Bu şematik, paket her iki tarafta lensler elyaf demeti girişi yanı sıra elyaf demeti çıktı görüntü genişletmek yansıtılıyor hem görüntü ölçekli yerde.
Şekil 5, 5-eksenli bir montaj monte bir elyaf demeti örneği. 1 "küçük çaplı alüminyum blok, böylece görüntü elyaf demeti takılmış olabilir sıkıldım. Fiber bot alüminyum bloğu içinde epoxiedistikrar için h bloğun üst ve alt.
Şekil 6. bağlı mikroendoskop mikroskopi sistemi Image. Dikroik ayna sonra emisyon ışın yolu, kırmızı bir çizgi olarak çizilir, ışık yolları daha iyi görselleştirmek için, ikaz ışın yolu, mavi çizilir.
Şekil 7 Örnek görüntü video oranı konfokal tarama mikroskobu sistemi tarafından oluşturulan. Karanlık bir alt harf "m", beyaz bir kartvizit parlak floresan arka plan üzerinde görünür.
Discussion
Bu video-rate görüntüleme sistemi, yaklaşık 8 kHz de bir rezonans galvanometric ayna işletim kullanımı yapar. Rezonans aynalar tam güçle çalıştırıldığında oldukça yüksek sesle, ve yüksek perde yeterli pozlama süreleri az rahatsız edici ve hatta tehlikeli olabilir. Burada gösterilen olmasa da, bu sistem birimi ve / veya kulak tıkacı gibi uygun işitme koruyucu giysiler giymek önemli ölçüde azaltmak için, şeffaf bir çantasının içinde yankılanan galvanometric ayna korumak için tavsiye edilir.
Rezonans galvanometric ayna sinüzoidal bir desen tarar. Ancak, Framegrabber kartı kartları, sinyal, yatay ve dikey yönde hem de tamamen doğrusal bir tarama hızı varsayarak okuyun. Sinüzoidal bir süpürme tarama kenarlarında yavaşlar, görüntü sıkıştırma eserler hızlı (yatay) görüntü ekseni boyunca görülebilir. Bu sorunu en aza indirmek için bir yolu bilerek rezonans galvo ayna tarama aralığı sürücü için önemli ölçüde daha büyükröle objektif çapı. Bunu yaparken, sadece sinüzoidal tarama desen neredeyse doğrusal merkezi süpürme görüntü distorsiyonları en aza indirmek, örnek hareket edecektir. Diğer bir yaklaşım, hızlı bir eksen linearize işlem sonrası toplanan görüntüler olacaktır. Bu bilinen bir floresan paterni (bir ızgara gibi) görüntüleme ile başarılı ve bilinen desen ölçüleri kullanılarak toplanan görüntüleri unwarps bir işlem komut dosyası oluşturmak için olabilir.
Bu özel tarama sistemi genellikle dik odaklı bir video hızı mikroskop gerektirir in vivo görüntüleme amacı ile dizayn edilmiştir. Hücresel görüntüleme deneyleri için, ters mikroskoplar genellikle kullanılır. Böyle bir inverted mikroskop kolayca oluşturmak için burada sunulan tasarım değişti; gerekli olduğunu, son 2 "çap ayna bir dönme. Ayna ayna aşağı tarama ışını doğrudan yönlendirme yerine, yukarıya doğru ışın yönlendirebilirsiniz. Objektif lens yerleştirilmesit, örnek bir aşaması ile birlikte ayna aynı mesafede ters bir geometri görüntüleme için izin verecek. Görüntüleme sistemi, sadece microendoscopic görüntüleme için inşa edilmekte ise, tüm dikey mikroskop tasarım "kat" için hiçbir sebep yoktur. Bunun yerine, tüm tarama sistemi ile tek bir objektif lens optik tabloya yönelik paralel yatay breadboard üzerinde inşa edilebilir.
En ticari konfokal mikroskoplar bulunabilir gibi bu daha çok yönlü bir sistem isteyen kullanıcılar, bir değişken iğne deliği içeren düşünebilirsiniz, büyük inşa sadelik ve uyum kolaylığı sağlarken; bu yapı mikroskop sabit bir iğne deliği yapılandırmasını kullanır. Kullanıcı emisyon yoğunluğu değişik örnekler için telafi etmek için iğne deliği boyutunu ayarlamak için izin vererek, bu kullanıcı belirli bir numune daha iyi sinyal gücü ve çözünürlük arasındaki tradeoff optimize edilmesine olanak tanır.
Chmikroskop için seçilen görüntü, fiber OICE önemlidir. Biz onların yakın fiber çekirdek aralığı ve düşük bağıl otofloresans nedeniyle Sumitomo tutarlı bir görüntü lifleri kullanmanızı öneririz. Fujikura tarafından üretilen liflerin bir örnek zayıf floresan sinyalleri bastıran ve mikroendoskop nihai hassasiyet sınırı otofloresans 10 yüksek miktarda olduğu tespit edilmiştir. Bu özel kurulum kullanılan 8-30N Sumitomo üretilen liflerin, kendi Fujikura muadillerine göre çok daha düşük otofloresans seviyeleri var. Leeched lif demetleri mikroendoskopi için çekici olarak kabul edilebilir olsa da, tasarım genellikle fiber çekirdek seyrek örnek nesneler, potansiyel ilgi önemli bölgelerinde dışarıda bırakarak, bunun anlamı, çok uzak bireysel lif çekirdek yerleştirir.
Son olarak, mikroskop burada açıklanan, in vitro ve in vivo Uyg çeşitli yararlı olacağını belirtmek gerekirEklentiler ve tam özellikli bir ticari sistem maliyetinin bir kısmı için oluşturulabilir, iletilen ışık algılama, izleme için bir mercek, ya da bir ışın yolu olmayan konfokal widefield Epifloresans gibi özelliklere sahip değildir. Sıfırdan bu özelliklere sahip bir sistem inşa etmek mümkün olsa da, böyle bir sistem elde etmek isteyen okuyucuların kendi ihtiyaçlarını karşılamak yerine tamamen yeni inşa başlatmak için mevcut bir ticari sistemi değiştirmek isteyebilirsiniz.
Disclosures
Bu video Bu video Üretimi Thorlabs, Inc tarafından sponsor oldu
Acknowledgments
Yazarlar ThorLabs bu projeye destek için teşekkür etmek istiyorum. AJN bir NSF Yüksek Lisans Bursu desteğini kabul etmek istemektedir.
Bu çalışma kısmen, NIH Müdürü Yenilikçisi Ödül Programı aracılığıyla, Ulusal Sağlık Enstitüleri, OD007096-01 DP2 hibe sayısı 1 tarafından finanse edildi. Yeni Yenilikçisi Ödülü Programı ile ilgili bilgiler. http://nihroadmap.nih.gov/newinnovator/ . Yazarlar, Harvard Elektronik laboratuar kullanımı için Tom Hayes teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 515 nm Band Pass Filter | Chroma Technology Corp. | HQ515/50M | 46 FWHM |
| Achromatic Doublet Lens 25.4mm Dia. x 50mm FL, MgF2 Coating | Edmund Scientific | NT49-766 | |
| Achromatic Doublet Lens 25.4mm Dia. x 76.2mm FL, MgF2 Coating | Edmund Scientific | NT49-768 | |
| Achromatic Doublet Lens 25.4mm Dia. x 88.9mm FL, MgF2 Coating | Edmund Scientific | NT49-769 | |
| Achromatic Doublet Lens 50mm Dia. x 300mm FL, MgF2 Coating | Edmund Scientific | NT45-179 | |
| 8 kHz R High Frequency Optical Scanner | Electro-Optical Products Corporation (EOPC) | SC-30 | 8 kHz |
| AGC Driver | Electro-Optical Products Corporation (EOPC) | ACG:8K | |
| H7422-PA Photosensor Module | Hamamatsu Corp. | H7422-PA | Current limiting recommended |
| M9012 Power Supply | Hamamatsu Corp. | M9012 | For use with H7422-PA |
| HC PL APO CS Objective | Leica Microsystems | 11506284 | 10x/0.40 |
| Solios eA/XA Framegrabber Card | Matrox | Solios eA/XA | MIL software required; –M interconnects recommended |
| 12V Power Supply | Meanwell | LPV-100-12 | +12V, 8.5A |
| 5x Microscope Objective Lens | Newport Corp. | M-5X | 0.10 NA, 25.4 mm Focal Length |
| Coherent Image Fiber | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | 8-30N | |
| 1/4"-20 Cap Screw and Hardware Kit | Thorlabs Inc. | HW-KIT2 | |
| 100 μm Mounted Pinhole | Thorlabs Inc. | P100S | Ideal for building spatial filters |
| 30 mm Cage Cube Clamp | Thorlabs Inc. | B6C | |
| 30 mm Cage System Cube, 4-Way | Thorlabs Inc. | C4W | |
| 406 nm, 5 mW, B Pin Code, SM Fiber Pigtailed Laser Diode, FC/PC | Thorlabs Inc. | LPS-406-FC | Product obsolete; replaced by LP405-SF10 |
| 5-Minute Epoxy, 1 Ounce | Thorlabs Inc. | G14250 | |
| 6 Axis Kinematic Optic Mount | Thorlabs Inc. | K6X | |
| 8-32 Cap Screw and Hardware Kit | Thorlabs Inc. | HW-KIT1 | |
| 8-32 Setscrew and Hardware Kit | Thorlabs Inc. | HW-KIT3 | |
| Adapter with External RMS Threads and Internal SM1 Threads | Thorlabs Inc. | SM1A4 | |
| Adj. FC/PC and FC/APC Collimator, f = 2.0 mm, ARC: 400-600 nm | Thorlabs Inc. | CFC-2X-A | f = 2.0 mm |
| Adjustable Fiber Collimator Adapter, SM1 Threaded | Thorlabs Inc. | AD9.5F | |
| Aluminum Breadboard, 12" x 18" x 1/2" | Thorlabs Inc. | MB1218 | 1/4"-20 Threaded |
| Benchtop Laser Diode/TEC Controller | Thorlabs Inc. | ITC4001 | 1 A/96 W |
| DMLP 425 nm Long-Pass Dichroic Mirror | Thorlabs Inc. | DMLP425 | |
| Kinematic Mount for 1" Optics | Thorlabs Inc. | KM100 | |
| LD/TEC Mount for ThorLabs Fiber-Pigtailed Laser Diodes | Thorlabs Inc. | LM9LP | |
| Lens Mount for 18 mm Optics | Thorlabs Inc. | LMR18 | One retaining ring included |
| Lens Mounts for 2" Optics | Thorlabs Inc. | LMR2S | With internal and external threading; retainer ring included |
| Mini Series Cage Assembly Rod, 6" Long, 4 mm, Qty. 1 | Thorlabs Inc. | SR6 | |
| 1.0" Pedestal Pillar Post, 8-32 Taps, 1" Long | Thorlabs Inc. | RS1P8E | |
| 1" Pillar Post Extension, Length=0.5 | Thorlabs Inc. | RS05 | |
| 1" Pillar Post Extension, Length=0.75" | Thorlabs Inc. | RS075 | |
| 1" Protected Silver Mirror, 3.2 mm Thick | Thorlabs Inc. | ME1-P01 | |
| 1" SM1 Rotating Adjustable Focusing Element, L = 1" | Thorlabs Inc. | SM1V10 | |
| 2" Protected Silver Mirror, 3.2 mm Thick | Thorlabs Inc. | ME2-P01 | |
| P100S - 100 μm Mounted Pinhole | Thorlabs Inc. | P100S | |
| Polaris Low Drift 1" Kinematic Mirror Mount | Thorlabs Inc. | POLARIS-K1 | Low drift |
| SM1 Lens Tube, L = 1" | Thorlabs Inc. | SM1L-10 | One retaining ring included |
| SM1 Threaded 30 mm Cage Plate, 0.35" Thick | Thorlabs Inc. | CP02 | |
| SM1 to M25 Optical Component Threading Adaptor | Thorlabs Inc. | SM1A24 | External SM1 Threads and Internal M25.5x0.5 Threads |
| Small Beam Diameter Galvo System | Thorlabs Inc. | GVSM001 | |
| Small Clamping Fork | Thorlabs Inc. | CF125 | 1/25" counterbored slot, universal |
| Spatial Filter System | Thorlabs Inc. | KT310 | Pinhole sold separately |
| TE-Cooled Mount for 5.6 & 9 mm Lasers | Thorlabs Inc. | TCLDM9 | |
| Vertical Bracket for Breadboards | Thorlabs Inc. | VB01 | Each |
| Plan-Apochromat | Carl Zeiss, Inc. | 1101-957 | 20x/0.75 NA |
References
- Pawley, J. B. Handbook of biological confocal microscopy. , Springer Verlag. 985-985 (2006).
- Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A.
- Klonis, N., Rug, M., Harper, I., Wickham, M., Cowman, A., Tilley, L. Fluorescence photobleaching analysis for the study of cellular dynamics. European Biophysics Journal. 31, 36-51 (2002).
- Stephens, D. J. Light Microscopy Techniques for Live Cell Imaging. Science. 300, 82-86 (2003).
- McMahon, A., Supatto, W., Fraser, S. E., Stathopoulos, A. Dynamic Analyses of Drosophila Gastrulation Provide Insights into Collective Cell Migration. Science. 322, 1546-1550 (2008).
- Wallingford, J. B. Dishevelled controls cell polarity during Xenopus gastrulation. Nature. 405, 81-85 (2000).
- Laemmel, E. Fibered Confocal Fluorescence Microscopy (Cell-viZio) Facilitates Extended Imaging in the Field of Microcirculation. Journal of Vascular Research. 41, 400-411 (2004).
- Moussata, D.
- Dunbar, K., Canto, M.
- Udovich, J. A. Spectral background and transmission characteristics of fiber optic imaging bundles. Applied optics. 47, 4560-4568 (2008).
