Summary
פרופיל יחיד ביטוי התא מאפשר את הגן מפורט ביטוי בניתוח של תאים בודדים. אנו מתארים שיטות הבידוד של cardiomyocytes, והכנת lysates וכתוצאה מכך עבור microarray או transcriptome qPCR כולו או מטרות ספציפיות.
Abstract
אמנם מחקרים רבים בחנו את ביטוי הגן משתנה מן homogenates של רקמת לב, זה מונע לומד את הסטיות האקראיות הטמון בין תאים בתוך רקמה. בידוד של אוכלוסיות cardiomyocyte טהור דרך זלוף collagenase של לבבות עכבר מקלה על הדור של microarrays תא בודד עבור כל ביטוי גנים transcriptome, או qPCR של מטרות ספציפיות באמצעות מערכים nanofluidic. אנו מתארים כאן הליך לבחון את אחד הגנים התא ביטוי פרופילים של cardiomyocytes מבודד בלב. פרדיגמה זו מאפשרת הערכה של מדדים של עניין אשר אינם תלויים מתכוון (עבור השונות למשל בין תאים בתוך הרקמה), אשר אינה אפשרית בעת שימוש רגיל workflows רקמות שלמות לצורך הערכה של ביטוי גנים (איור 1). השגנו הגברה חזקה של transcriptome מיקרוגרם אחד של תא מניב cDNA גדילי כפול המאפשרת את השימוש microarrays על individual תאים. בהליך אנו מתארים את השימוש במערכים NimbleGen אשר נבחרו על מנת להקל את השימוש ואת היכולת להתאים אישית את העיצוב שלהם. לחלופין, transcriptase הפוכה - הגברה היעד תגובה ספציפית (RT-STA), מאפשר qPCR של מאות יעדים על ידי nanofluidic PCR. השימוש באחת הגישות הללו, אפשר לבחון את השתנות ביטוי בין תאים, כמו גם בחינת פרופילי הביטוי של סוגי תאים נדירים מתוך נייר. בסך הכל, תא בודד הגן גישה מאפשרת ביטוי עבור הדור של נתונים שעלולים לזהות פרופילים ביטוי ייחודית כי הם בממוצע בדרך כלל כאשר בוחנים את הביטוי של מיליוני תאים homogenates אופייני שנוצר מרקמות כולו.
Protocol
1. שלב 1 - בידוד Cardiomyocyte
- הכן את החיץ העיכול כדלקמן:
10 x הצפת עיכול (שנעשו אולטרה טהורים H 2 O)סופי קונצרט כלשהו. g / L g/500 מ"ל פתרון גרם 10x / L NaCl 130 מ"מ 7.597 3.3 75.97 KCl 5 מ"מ 0.4 0.2 4.0 Pyruvic חומצה 3 nM 0.33 0.165 3.30 HEPES 25 מ"מ 5.96 2.85 59.6 MgCl 2 0.5 מ"מ 0.101 0.05 1.01 נה 2ת.ד. 4monobasic 0.33 mM 0.04 0.02 0.40 דקסטרוז 22 מ"מ 3.96 1.98 39.6
pH 7.4 חיץ עם NaOH - באמצעות הצפת עיכול 10x, להפוך את ארבעת הפתרונות לב כל זה יהיה perfused (שנעשו אולטרה טהורים H 2 O):
מאגר עיכול (לעשות שלושה aliquots של פתרונות זה)
- 50 מ"ל - הצפת עיכול 1x המכיל:
- 75 μL - פתרון EGTA (100 מ"מ EGTA)
מאגר עיכול B (ביצוע אחד כזה)
- 25 מ"ל - הצפת עיכול 1x המכיל:
- 1.25 μL - פתרון CaCl 2 (1 M)
- 1 מ"ג - פרוטאז
- 25 מ"ג - collagenase (can להשתמש גם 75% מסכום זה = 18.75 מ"ג) **
אוסף מאגר (בצע אחד מאלה)
- 2.5 מ"ל - הצפת עיכול 1x המכיל:
- 1.25 μL - פתרון CaCl 2 (1 M)
- 0.5 מ"ג - פרוטאז
- 15 מ"ג - collagenase (75% = 11.25 מ"ג) **
- 125 מ"ג - BSA
לשטוף הצפת נטרול (בצע אחד מאלה)
- 25 מ"ל - הצפת עיכול 1x המכיל:
- 6.25 μL - פתרון CaCl 2 (1 M)
- 250 מ"ג BSA
** בהתאם המקור אצווה של collagenase, את פעילות האנזים עשוי להשתנות. זה עשוי להיות נחוץ כדי לייעל את כמות אנזים הוסיף למאגר הזה כדי למנוע יתר מערכת העיכול.
- הגדרת מערכת הבידוד כמתואר קודם לכן דetail 1,2 עם שלוש כוסות 15 מ"ל של הצפת עיכול על הקרח, אחד 50 מ"ל שפופרת של הצפת עיכול ואת עיכול 25 מ"ל הצפת B מוכן זלוף (Buffer עיכול צריך להיות סמוקות דרך הקו, לפחות של 5 מ"ל להפעיל באמצעות המערכת), הצפת אוסף חימם באמבט מים כדי להעלות את הטמפרטורה עד 37 מעלות צלזיוס, ואת הצפת לשטוף נטרול ב RT.
- מלאו את הצינורית זלוף ואת צלחת לנתיחה שם לב ינוקה וקשר על קצה זלוף עם א 'עיכול קר הצפת בחופשיות קשר כלשהו תפר (4-O ל-O 6 גודל) סביב החלק העליון של צינורית. זה יהיה מאוחר יותר לשמש כדי להחזיק את העורקים ולמנוע את הלב החליקו את הצינורית.
- הרגוע סופניים את העכבר בעזרת זריקה של חומר הרדמה סוכן ה-IP (0.25 מ"ל נתרן פתרון Pentobarbital) ולהבטיח את העכבר הוא מודע ואינו מגיב לגירוי כאב. גזור לפתוח את חלל החזה בזהירות לאורך שולי החזה על ידי חיתוך הסרעפת(איור 2). גזור superiorly מעלה משקפים את בית החזה הקדמי (חתכים אלה מיועדים B ו-A, בהתאמה, איור 2) קריטי -. העכבר עדיין יש נשימה לפני אלה חתכים.
- באמצעות חתך פיפטה פלסטיק בגודל, בעדינות למצוץ את הלב לתוך פיפטה. חותכים את הלב מתוך חלל החזה נזהר להשאיר מספיק של אבי העורקים על הלב לזהות בבירור את הסניף אבי העורקים (איור 3). פיפטה משמשת מאז שהיא גורמת נזק מינימלי הלב.
- זרוק את הלב לתוך כוס אחת הצפת קרים עיכול ולשטוף את הדם. אחרי 15 - 45 מקום בלב שניות לתוך הכוס השנייה של הצפת עיכול קר קרח בקצרה לשטוף שוב. מעבירים את הלב לתוך צלחת פטרי מלא גם עם א 'עיכול קר הצפת
- הצג את הלב בצלחת של הצפת עיכול תחת היקף לנתיחה ובזהירות לבודד את אבי העורקים ואת ענפיו. בזהירות לקצץ נחות רק כדי branc האחרונהשעות (איור 4).
- התאם את קצה צינורית לתוך אבי העורקים ו ולקשור במקום עם 4-O כדי תפר 6-O באמצעות ההתקנה שלב תחת מיקרוסקופ לנתיחה. ודא כי הצינורית לא לשבת נמוך מדי בתוך אבי העורקים ונשאר מעל העורקים הכליליים (איור 4).
- עם הצפת עיכול זורם דרך ההתקנה זלוף, מקום קצה זלוף על ההתקנה, ולהתחיל perfuse את הלב עד שרוב הדם נשטף מהלב נוזל עוזב בלב ברורה. קריטי - את הטמפרטורה של הנוזל זלוף חייב להיות קרוב ככל האפשר ל 37 ° C כשזה מגיע מתוך הקטטר. אם הפתרון הוא חם מדי או קר מדי אז זלוף יהרוג את הרקמה. הזמן עד זלוף של הלב הוא גם קריטי. חלון הזמן חייב להיות פחות מ 50-10 דקות מהסרת הלב עד זלוף מתחיל. הלב יש להסיר בהרדמה, לא CO 2 affixation או פריקה צוואר הרחם.
- ברגע הדם הוא היההד מהלב, לעבור B הצפת עיכול מ א הצפת עיכול ודא B הצפת עיכול עכשיו זורם דרך הלב. הפתרון יתחיל יש גוון צהוב. המתן 2-3 דקות עד הלב מראה סימנים של איבוד צורתו מתחיל להיראות מעוגלות אשר מהווה אינדיקציה לכך העיכול פועלת. שריר הלב אמור להופיע קלים כמו התמורה זלוף.
- חותכים את החדרים במספריים ומקום לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל המכיל 15 מ"ל של הצפת אוסף ב 37 ° C. בעדינות לחתוך את החדר לחתיכות קטנות תוך שימת הרקמה לתוך מאגר האוסף. מערבבים בעדינות בעזרת פיפטה פלסטיק לפרק את התא תאים הידבקויות ולעשות תערובת cardiomyocyte תא בודד.
- כאשר רוב הרקמה הוא מומס, (פחות מ 1 דק ') לאפשר את חתיכות רקמה גדול לשקוע לקרקעית. הסר ולשמור את supernatant אל צינור חרוטי 15 מ"ל. בואו הכבידה למשוך גלולה מן supernatant במשך 10 דקות עד 20 (15דקות מועדפת) בטמפרטורת החדר.
- הסר להתעלמות supernatant. לשטוף גלולה ידי הוספת 5 מ"ל של הצפת לשטוף נטרול של גלולה לערבב בעדינות את התאים resuspend אותם. בשלב זה התאים מיד מוכן להיבחר לניתוח תא בודד (המשך לשלב 2).
2. שלב 2 - בידוד של תאים בודדים
- הכן micromanipulator באמצעות להבה צינור זכוכית נימי אשר ישמשו כדי לתפעל תאים. Micromanipulator הוא פשוט צינור נימי דק מאוד אשר מחוברת אז חתיכה ארוכה של צינורות גמישים אשר יכולים לנוע או להרים תאים כאשר יניקה מוחל.
- י מיד הבחירה של תאים בודדים תחת מיקרוסקופ (ניקון TS100 אקליפס, 20x) באמצעות micromanipulator אשר נוצר עם טפטפת משך מנעל האוויר כדי למנוע מן החומר שהועבר המדגם תא דגימות בודדת. ודא כי האוכלוסייה תא בריא(70% קיימא) ולא פגום מתהליך הבידוד.
- לדלל את התאים מטה בצלחת פטרי קטנה, כך שהם עשויים להיבחר בנפרד. כאשר תאים לקטוף להיות בטוח כדי ללכוד תאים בנפח קטן (פחות מ 2 μL). בחר רק בתאים בריאים בעלי מורפולוגיה ייחודית cardiomyocyte נורמלי (איור 5).
- המקום תאים בודדים לתוך החלק התחתון של צינורות בודדים PCR ולהקפיא אותם מיד על קרח יבש. תאים אלו מאוחסנים אז -80 ° C עד שהם לשמש לצורך ניתוח ביטוי גנים.
3. שלב 3A - תא יחיד qPCR ביטוי הגן
כדי לבצע qPCR על תאים בודדים להעסיק פרוטוקול מותאם מאחד שפותחה עבור הביטוי תא בודד הגן על ידי חברת Fluidigm עבור Biomark שלהם מערכים nanofluidic qPCR (Fluidigm - פיתוח מתקדם פרוטוקול מס '30) 3,4.
- הכנת שעתוק הפוך - הגברה יעד ספציפי (RT-STA). כדי להיותג'ין, resuspend כל זוגות פריימר (השתמשנו עד 125 זוגות פריימר בהצלחה) עבור הגנים של ריבית 100 מיקרומטר במאגר ה-DNA 1x ההשעיה (10 mM טריס, pH 8.0, 0.1 mM EDTA). מערבבים עוד יותר לדלל את זוגות פריימר קדימה לאחור עד 20 מיקרומטר עבור כל assay. לבסוף, לדלל את כל זוגות תחל תוך פתרון אחד עם ריכוז סופי של 200 ננומטר במשך assay כל זה יהיה מוגבר בתגובה RT-STA. כדי לעשות זאת, לקחת כל זוג פריימר ואת לדלל אותם 1:100. לדוגמה, אם יש לך 30 פריימר assay זוגות ב 20 מיקרומטר, תצטרך להוסיף 1 μL של כל זוג (30 בסך הכל μL), ולאחר מכן לפצות את שארית נפח עם 70 μL של חיץ ההשעיה DNA להגיע לגמר דילול נפח μL 100.
- עכשיו הפתרונות פריימר מוכנים, להרכיב את RT-STA מאסטר לערבב התגובה. הכינו מספיק לערבב המאסטר עבור כל אחד תאים בודדים אתה רוצה להגביר.
1. טבלת RT-STA מאסטר מיקסמגיב כרך ב μL (התגובה לכל) CellsDirect לערבב התגובה 2x 5.0 עילי III RT Plantinum תקי לערבב 0.2 RT-STA פריימר לערבב (200 nM כל assay) 2.5 Nuclease חינם H 2 O (או חיץ 1x ההשעיה DNA) 1.3 סך הכל 9.0 - מיד להסיר תאים קפואים צנטריפוגות ב RCF המרבי למשך 30 שניות כדי לוודא את התאים ממוקמים בחלק התחתון של הצינור. הוסף 9 μL תמהיל RT-STA אל הצינור והמשך התגובה ב thermocycler.
- 50 ° C - 15 דקות
- 95 ° C - 2 דקות
- 18 מחזורים של
- 95 ° C למשך 15 שניות
- 60מעלות צלזיוס למשך 4 דקות
- תחזיק ב 4 ° C
- הסר את הצינורות ממכונת PCR ולהוסיף 4 μL של ExoSAP-IT לתגובה. ExoSAP-IT הוא מגיב ניקוי PCR אשר תסיר primers עודף האנזים מן התגובה RT-STA. הפעל את הצינורות דרך התגובה הבאה מכונת ה-PCR.
- 37 ° C - 15 דקות
- 80 ° C - 15 דקות
- תחזיק ב 4 ° C
- כאשר הטיפול ExoSAP-IT תושלם; לדלל את 1:05 עם דגימות למאגר הדנ"א ההשעיה. הדגימות מוכנים עכשיו לניתוח qPCR. אנו משתמשים בחומר זה ביחד עם התבטאות גנים של Fluidigm מערכים qPCR (48.48, 96.96 או צלחות). אפשר גם להשתמש בגישה זו עם מכשור יותר qPCR המסורתי (96 או 384 גם בפורמטים היטב). עם זאת, מכשירים אלה בדרך כלל דורשים קלט מדגם הרבה יותר המגביל את מספר מבחני שניתן performed מתא בודד.
3. שלב 3B - הגברה transcriptome microarray שלמות של תאים בודדים
Extraction ו הגברה
- השתמש WTA2 סיגמא של ערכת (Cat # WTA2) כדי להגביר כפול cDNA תקועים משני כדורי ועל תאים בודדים. התאים היחידים "חילוץ" דרך הצעד הראשון של הפרוטוקול של סיגמה WTA2 בהתאם להוראות היצרן. במהלך שלב זה הראשון הדגירה עם חיץ סינתזה ספריה ב 37 מעלות למשך 5 דקות משבש את הממברנה של תאים בודדים "מחלץ" את המסר של הגברה.
- Amplify תאים בודדים בשני סבבים, באמצעות כיוונים מתיק WTA2 של Sigma-Aldrich. בצע את הצעד הכנה ספריה על פי פרוטוקול של היצרן, ולאחר מכן להוסיף 1 / 5 המדגם הספריה μL 70 של הגברה WTA2
מיקס מאסטר. להגביר את דגימות עבור 25 מחזורי שימוש בפרמטרים רכיבה על אופניים מומלצת. - לטהר את USI דגימותng Qiagen של QIAquick PCR ערכת טיהור (Cat # 28104) תהליך על Qiacube של Qiagen באמצעות "ניקוי QIAquick PCR תגובות הגברה רגילה V4" פרוטוקול.
- לרכז את דגימות מטוהרים אל μL 5, באמצעות ואקום מהירות, דרך לשים לסיבוב שני של הגברה במשך 17 מחזורים (WTA2 פרוטוקול הגברה ופרמטרים אופניים חוזרות ונשנות).
- לטהר דגימות באמצעות ערכת ה-PCR QIAquick טיהור ולבדוק איכות באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop ו BioAnalyzer של Agilent 7500 ערכת ה-DNA על פי פרוטוקול היצרנים.
סימון ביטוי NimbleGen מערכים ג'ין
- 2 לייבל מיקרוגרם של גדילי כפול cDNA ממדגם כל תא מוגבר באמצעות אחת של NimbleGen סימון צבע Kit (Cat # 05223555001) על פי פרוטוקול של היצרן.
- להכליא 5 מיקרוגרם של המדגם Cy3 שכותרתו Mus שריר 12x135k, NimbleGen מערכים Gene Expression (Cat # 05543797001) ACCording לפרוטוקול של היצרן. אחרי הכלאה של דגימות של מערכים, השקופיות אמור להיות כביסה, ייבוש לפני שהם ניתן הדמיה בסורק לייזר.
- הביטוי סריקה ג'ין מערכים באמצעות סורק לייזר. כאן, אנו משתמשים התקנים מולקולריים GenePix סורק 4200A עם ההגדרות של 100POW, ו 300-350PMT. ואז ליצור את הקבצים זוג עבור כל מערך באמצעות תוכנת NimbleScan של NimbleGen ולאחר מכן לנתח לביטוי transcriptome ממערך שלם בכל תא בודד (טבלה טיפוסית של תמלילי cardiomyocyte לידי ביטוי ביציבות נכלל כתוסף; S1 טבלה).
אם זלוף הלב עבד היטב לא צריך להיות אחוז גבוה של תאים אשר שומרים על לב בריא מורפולוגיה מלבני הטיפוסיים שלהן על הבידוד. אם זלוף לא להמשיך גם אז יהיו אחוז גדול של תאים מתים (ראה תמונות איור 5). אם התאים מוגבר כראוי באמצעות אחת השיטות WTA2 או RT-STAn את המוצרים הבאים בסוף צריך לעבור בדיקות בקרת איכות עבור איכות דגימות mRNA על ידי NanoDrop ו BioAnalyser (איור 6). עבור זרימת העבודה microarray, זו הושלמה לאחר הגברה WTA שם את ה-mRNA הוא נבדק על ידי שני NanoDrop ו Bioanalyzer. תוצאות חיוביות נציג לצורך ניתוח זה מוצגים באיור 6. WTA2 דגימות צריך להראות הגברה חזקה עם קריאת שני NanoDrop ספקטרופוטומטר, וכן את ההודעה electropherogram מן השבב Bioanalyzer (BA) (איור 6). טבלה של גנים אשר התגלו ביציבות באמצעות microarray של תאים בודדים כלולה כדוגמה לוח (S1). במשך התהליך qPCR, איכות הנתונים ניתן להעריך על ידי ביצוע צעד להמיס בסוף התגובה PCR על מנת להבטיח כי מערכות הגברה פריימר הם המוצר הרצוי (איור 7). אם נכונה, שלב זה אמור להמיס לייצר שיא אחת להמיס ספציפיים. כדי להמחיש את הנקודה הזו, משנה של nanofluidic qPCR נתונים מוצג Heatmap של שיא להמיס temperature (איור 8) 8. אפשר להעריך איכות של מוצר ה-PCR על ידי הטמפרטורה להמיס להבטחת העדר הלא ספציפית מוצרים 5. כל שורה של המפה זה מייצג דגימה אחת תא (S1-S40) נבדקו 43 מבחני qPCR נפרד (A1-A43). בנתון זה, ברור כי מבחני וחלקם משתנה מאוד, והם כנראה פחות אמין מאשר מבחני יציבה יותר עם סגוליות גבוהה יותר PCR.
באיור 1. סקירה כללית של בידוד בתא יחיד ניתוח ביטוי גנים. ההליך יהיה להדגים את הסרה כירורגית של לב את העכבר ואת הבידוד של cardiomyocytes בודדים. השיטות שנדונו בהליך זה כוללות את שיטות qPCR או ניתוח microarray לאחר הגברה transcriptome שלם (WTA). ההליך WTA מתחילה תמוגה (A) אז המחייב של פריימרים אוניברסליים של סיגמא (ב) על ה-mRNAהבריכה. הארכת אלה primers (C) שלב (ד) הגברה ליצור מיקרוגרם של חומר מוגבר. הגברה זו חוזרת על עצמה אז (E) לייצר מספיק חומר עבור ההליך microarray.
באיור 2. ייצוג המיקום של חתכים כדי להסיר את הלב מן העכבר. חותכים לאורך הקיר לרוחב של כלוב הצלעות (A), ואז לחתוך לאורך השוליים נחות של כלוב הצלעות (B). כלי חיתוך מעל ומתחת ללב ואפשר הסרה ועדיין משאיר מספיק של אבי העורקים אל cannulate את הלב. תמונות עיבוד MJ קוק 6.
באיור 3. דיאגרמה של בית החזה של העכבר. קווים מקווקווים מציינים את מיקומם של חתכים (א) עבור מוציא את הלב מתוך חלל החזה מבלי לפגוע ח יש לב רקמות. תמונות עיבוד MJ קוק 6.
איור 4. תמונה של קשת אבי העורקים ואת ענפיו. הקו האפור מציין את המיקום האידיאלי של איפה לקצץ את אבי העורקים (A). אבי העורקים הנותרים המצורפת הלב cannulated כך קצה של צינורית (ב) עובר לרמה המתאימה בתוך אבי העורקים (C). תמונות עיבוד פ גיילרד 7.
איור 5. בחירה של תאים בודדים לצורך ניתוח ביטוי גנים. כל פנל מראה cardiomyocytes הדמיה במיקרוסקופ אור מראה מורפולוגיה אופיינית cardiomyocytes. Cardiomyocytes בריאה מסומנים על ידי החצים הירוקים. תאים אשר מתים או גוססים מוצגים עם חצים אדומים. תאים אלה מתים אין להשתמש בניתוח.
iles/ftp_upload/3302/3302fig6.jpg "alt =" איור 6 "/>
איור 6. בקרת איכות התוצאות WTA עבור הגברה תא בודד. (א) מקדימה של readout ספקטרופוטומטר NanoDrop שמתאימה את תמלילי מוגבר מן התגובה WTA. (ב) readout מן שבב BioAnalyzer מראה את התוצאות של שלושה תאים מוגבר.
איור 7. עקומות qPCR הגברה (בתרשים משמאל) לבין שיא להמיס עקומות הטמפרטורה (תרשים מימין). (א) תוצאות הביטוי של assay איכות מוצגים עם שיא להמיס יחיד למרות עקומות הגברה שונות. (ב) ממיסים עקומות עבור קבוצה פריימר עניים, אשר פסגות להמיס משתנה מאוד אשר אינו אידיאלי לניתוח הביטוי.
איור 8. בקרת איכות תוצאות עבור התא בודד qPCR להגיביונים. מפה זו החום נוצר כדי להציג את הטמפרטורה להמיס כמו סולם צבעים. טמפרטורת ההתכה השיא assay כל qPCR (A1-A43) מוצגת במשך 40 תאים בודדים (S1-40). מבחני היו מקובצים על פי הטמפרטורה להמיס שלהם. על ידי מביט למטה את העמודה עבור assay כל זה ניתן לראות וריאציה להמיס בכל הדגימות. נתון זה מוכיח כי כמה מבחני qPCR הם מאוד ספציפיים וחלקם משתנה מאוד, ולכן אינם מתאימים לניתוח תא בודד.
S1 טבלה. שולחן משלימה נתונים microarray. הגנים הללו מופיעים על פי חוסנו שבו הם זוהה cardiomyocytes יחיד ברחבי במערך גדול. רשימה זו הגן מציין את הרגישות של זיהוי עבור מספר גנים אשר באים לידי ביטוי בדרך כלל cardiomyocytes יחיד.
Discussion
שיטה זו יש את האפשרות ליצור cardiomyocytes במשך מספר פונקציונלי, כמו גם ביטוי במחקרים הגן. בדיקה של תאים בודדים הוא אזור המתפתחת בניתוח ביטוי גנים. היתרון של בחינת רמות תעתיק ברמה של תא יחיד הוא שהיא מאפשרת בדיקה של האוכלוסייה תא טהור, דבר שאינו אפשרי מן ההכנות הרקמה כולה. בנוסף, ניתוח תא בודד מאפשרת בחינה של הסטיות האקראיות של רמות ה-mRNA בתאים בודדים להגדיר אוכלוסיות תאים אשר נחשבו בעבר להיות 8,9 הומוגנית. בנוסף לזיהוי גנים אשר סטוכסטיים פוטנציאל בביטוי הגנים שלהם 10,11,12, השיטה מאפשרת גם זיהוי של אוכלוסיות תאים נדירות שהוגדר על ידי ביטוי הגנים שלהם בפרופילים.
אמנם שיטה זו מספקת מספר שימושים פוטנציאליים מרגש בניתוח ביטוי גנים, יש סוםדואר אזהרות ושיקולים השימוש של תאים בודדים. המגבלה העיקרית לניתוח תא יחיד, הוא אוסף של תאים מספיק בניסוי כדי להשיג מובהקות סטטיסטית לגבי מדד של עניין, על השונות למשל. במקרים בהם את המספרים של תאים מבודדים מן הרקמה של עניין היא לא מגבלה, ניתן לבחון מאות תאים לכל קבוצה, תוך שימוש בגישות כגון רצף של הדור הבא, או מערכים nanofluidic. עם זאת, במקרים מסוימים, ייתכן שיש קושי בהשגת מספיק תאים מרקמות של עניין. זה יכול להיגרם בין השאר על ידי נהלים זמן ייחודי אינטנסיבית לאיסוף לסוג תא המטרה. עם זאת, תכנון קפדני הכנה לפני שתמשיך עם אוסף תא בודד עדיין עשויה לאפשר ניתוח קפדני תא בודד עם שגיאה טכנית מוגבלת. כאשר בוחנים את תוצאות אותו יש לקחת בחשבון, כי אף על הליך זה עבור תאים בידוד נעשה שימוש studie רביםs (כולל מיקרוסקופיה, electrophysiology וכו '), את הבידוד עצמו עלול השפעה ביטוי גנים. כמו כל שיטה אשר מתפעל דגימות ביולוגיות, התוצאות של הממצאים שלך צריך להיות תוקף בקפידה כדי להבטיח את הביטוי תא בודד הוא נציג של הרקמה עצמה הטיה לא טכנית. שיטות כמו הכלאה באתרו עשוי להיות שימושי כדי לאמת את התוצאות הללו ברקמות ללא פגע. לבסוף, חשוב להבטיח כי הנתונים המופקים נבדקים בקפידה על בקרת איכות. הנתונים שמוצג באיור 8 ממחישה כי מבחני qPCR עשוי להיות חזקים מאוד ספציפיות, כגון assay # 13 (A13) או רמה גבוהה של השתנות אשר יכול להוביל השונות טכניים כגון assay # 34 (A34).
Acknowledgments
המחברים רוצים להכיר סיוע טכני של ג Zambataro במהלך הסרטה של פרוטוקול זה. אנו בתודה להכיר את התמיכה של קרן גלן למחקר רפואי (SM), הקרן Hillblom, ואת מכוני הבריאות הלאומיים של מרכז פרס הלם נתן (P30AG025708) ו PO1AG025901. JMF נתמכה על ידי T32AG000266 הוענק למכון באק לחקר הזדקנות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71378 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60128 | |
| Pyruvic Acid | Sigma-Aldrich | P4562 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | 54457 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1020 | |
| NaH2PO4 monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | G6721 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | O3777 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | |
| Protease, Type XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Collagenase, Type I | Worthington Biochemical | C9891 | |
| 1x DNA Suspension Buffer (10 mM Tris, pH 8.0, 0.1 mM EDTA) | TEKnova, Inc. | PN T0221 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | B8667 | |
| Sodium Pentobarbital | Henry Schein | Contact supplier for ordering | *must be procured through a Veterinarian or lab animal professional |
| ExoSAP IT | Affymetrix | 78201 | |
| CellsDirect 2x Rxn Mix | Invitrogen | 11737-030 | |
| SuperScript III RT Platinum Taq Mix | Invitrogen | 10928-042 | |
| RT-STA Primer Mix | IDT | Custom | |
| Nuclease Free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| WTA2 | Sigma-Aldrich | WTA2-50rxn | |
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Qiacube | Qiagen | 9001292 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop | 2000c | |
| BioAnalyzer DNA 7500 kit | Agilent Technologies | 7500 kit | |
| One Color Labeling kit | Roche Group | 5223555001 | |
| Mus Musculus 12x135k array | Roche Group | 5543797001 | |
| GenePix 4200A Scanner | Molecular Devices | 4200A | |
| TransPlex Complete Whole Transcriptome Amplification Kit (WTA2 Kit) | Sigma-Aldrich | WTA2-50RXN |
References
- Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. Am. J. Physiol. 271 (3 Pt 2), H1250-H1255 (1996).
- Shioya, T. A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models. J. Physiol. Sci. 57 (6), 327-335 (2007).
- Guo, G., Huss, M., Tong, G. Q., Wang, C., Li Sun, L., Clarke, N. D., Robson, P. Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst. Dev. Cell. 18 (4), 675-685 (2010).
- Narsinh, K. H., Sun, N., Sanchez-Freire, V., Lee, A. S., Almeida, P., Hu, S., Jan, T., Wilson, K. D., Leong, D., Rosenberg, J., Yao, M., Robbins, R. C., Wu, J. C. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. J. Clin. Invest. 121 (3), 1217-1221 (2011).
- D'haene, B., Vandesompele, J., Hellemans, J. Accurate and objective copy number profiling using real-time quantitative PCR. Methods. 50 (4), 262-270 (2010).
- Cook, M. J. The Anatomy of the Laboratory Mouse. Informatics. , Academic Press. (1965).
- Gaillard, F.
- Ståhlberg, A., Andersson, D., Aurelius, J., Faiz, M., Pekna, M., Kubista, M., Pekny, M. Defining cell populations with single-cell gene expression profiling: correlations and identification of astrocyte subpopulations. Nucleic Acids Res. 39 (4), e24-e24 (2011).
- Zhong, J. F., Chen, Y., Marcus, J. S., Scherer, A., Quake, S. R., Taylor, C. R., Weiner, L. P. A microfluidic processor for gene expression profiling of single human embryonic stem cells. Lab Chip. 8 (1), 68-74 (2008).
- Bahar, R., Hartmann, C. H., Rodriguez, K. A., Denny, A. D., Busuttil, R. A., Dollé, M. E., Calder, R. B., Chisholm, G. B., Pollock, B. H., Klein, C. A., Vijg, J. Increased cell-to-cell variation in gene expression in ageing mouse heart. Nature. 441 (7096), 1011-1014 (2006).
- Raj, A., van Oudenaarden, A. Nature, nurture, or chance: stochastic gene expression and its consequences. Cell. 135 (2), 216-226 (2008).
- Elowitz, M., Levine, A., Siggia, E., Swain, P. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).
