Spheroid Assay å måle TGF-β-indusert Invasion

Summary

En analyse for å kvantitativt måle Transforming Growth Factor (TGF)-β-indusert invasjonen i 3-dimensjonal kollagen gels er beskrevet. Denne analysen tar fordel av MCF10A rekke cellelinjer, som representerer ulike stadier av brystkreft utvikling. Denne metoden kan tas i bruk for å brukes med andre cellelinjer og kan brukes til å undersøke andre potensielle aktivatorer eller hemmere av invasjonen.

Abstract

TGF-β har motstridende roller i brystkreft progresjon ved å fungere som en tumor suppressor i den innledende fasen, men stimulerende invasjon og metastasering ved senere stadium ^1,2. Videre er TGF-β ofte overexpressed i brystkreft og dens uttrykk korrelerer med dårlig prognose og metastasering ^3,4. Mekanismer som TGF-β induserer invasjonen ikke er godt forstått.

TGF-β utløser dens cellulære responser via TGF-β type II (TβRII) og type I (TβRI) reseptorer. Ved TGF-β-indusert heteromeric kompleks formasjon, phosphorylates TβRII den TβRI. De aktiverte TβRI innleder sitt intracellulære kanoniske signalveien ved phosphorylating reseptor Smads (R-Smads), dvs. Smad2 og Smad3. Disse aktiveres R-Smads skjema heteromeric komplekser med Smad4, som akkumuleres i kjernen og regulerer transkripsjon av målet gener ^5. I tillegg til de tidligere described Smad veien, reseptor aktivering resulterer i aktivering av flere andre ikke-Smad signalveier, for eksempel mitogen Aktivert protein kinase (MAPK) veier ^6.

For å studere betydningen av TGF-β i ulike stadier av brystkreft, har vi gjort bruk av MCF10A celle system. Dette systemet består av spontant udødeliggjort MCF10A1 (M1) bryst epitelceller ^7, forvandlet H-RAS M1-derivative MCF10AneoT (M2), som produserer premaligne lesjoner i mus ^8, og M2-derivative MCF10CA1a (M4), som ble etablert fra M2 xenografts og former høy klasse karsinomer med evne til å metastasere til lungene ^9. Denne MCF10A serien tilbyr muligheten til å studere svarene av celler med ulike graderinger av malignitet som ikke er forutinntatt av en annen genetisk bakgrunn.

For analyse av TGF-β-indusert invasjon, genererte vi homotypic MCF10A Spheroid cellekulturer embedded i et 3D kollagen matrise in vitro (fig 1). Slike modeller ligner menneskelige svulster in vivo ved å etablere en gradient av oksygen og næringsstoffer, noe som resulterer i aktiv og invasive celler på utsiden og stillestående eller nekrotiske celler i innsiden av Spheroid ^10. Spheroid baserte analyser har også vist seg å bedre rekapitulere legemiddelresistens enn monolayer kulturer ^11. Denne MCF10 3D-modell system tillatt oss å undersøke virkningen av TGF-β signalering på invasive egenskaper av brystkreft celler i ulike stadier av malignitet.

Protocol

1. Utarbeidelse av methocel løsning (500 ml)

1. Autoclave 6 g methylcellulose i en 500 ml flaske som inneholder en magnetrører.
2. Oppløs methylcellulose i 250 ml forvarmet DMEM/F12 uten serum (60 ° C) i 20 min.
3. Tilsett 250 ml DMEM/F12 (RT) inneholder 10% hest serum. Mix natten (4 ° C).
4. Fjern løsningen ved sentrifugering (5000g, 2t, 4 ° C).
5. Ta den klare svært viskøs løsning til en ny tube (ca. 90-95% av stamløsningen).
6. Oppbevares ved 4 ° C før bruk.

2. Spheroid kultur

1. Tilbered en 20% methocel løsning (10 ml methocel og 40 ml vekst medium).
2. Vask cellene to ganger med PBS, tilsett 0,1% trypsin og inkuber celler ved 37 ° C
3. Resuspender celler i vekst medium og telle cellene.
4. Utarbeide en suspensjon av 10 000 celler per ml i 20% methocel.
5. Legg til cellesuspensjonen til 96 godt rund bunn eruspension plater (100 mL per brønn).
6. Neste dag, sjekk Spheroid formasjonen i suspensjon plater. Spheroids vil være klare til bruk etter 1-3 dager.

3. Utarbeidelse av kollagen

1. Forbered på is en løsning på 8 ml kollagen, 1 ml 10x PBS, 1 ml 0,1 N NaOH og 3 dråper 0,1 N HCl. Sjekk om pH er 7.4 ved å fange opp noen av løsning på pH indikator strimler. Juster pH hvis utenfor rekkevidde.
2. Tilsett 50 mL av nøytralisert kollagen løsningen i brønner på en plate med 96 brønner
3. Inkuber ved 37 ° C inntil kollagen er størknet (90 min).
4. Forbered methocel-kollagen-ligand løsninger på is: for hver ligand pipette 1 del av kollagen løsning. Legg til 20 ng per ml av kollagen TGF-β. Etter fortynning med methocel og diffusjon over de ulike lagene, vil den endelige konsentrasjonen av TGF-β være 5 ng / ml Mix av virvling. Legg en del av methocel-løsning. Bland ved virvling.

Fire. Spheroid embedDing

1. Plasser en 200 mL tips som har ca 5 mm av spissen kuttet av, på en 200 mL pipette. Suge opp en Spheroid med pipetten og nøye dispensere mediet inn en tom plate. Watch hvis Spheroid forblir inne i spissen. Den Spheroid er synlig som en hvit prikk. Uten å slippe stempelet, suge opp 100 mL kollagen-methocel blandingen og tilsetter Spheroid i kollagen blandingen i en kollagen-belagt 96 godt. Gjør dette for 12 spheroids for hver tilstand.
2. La kollagen stivne i minst 30 minutter ved 37 ° C
3. Fjern luftbobler med en 200 mL spissen.
4. Tilsett 50 mL medium med 1,6% serum og hemmere oppløst i DMSO. For SB-431 542 Tilsett 4 mL av stamløsning (10 mm) til 1 ml medium. Etter diffusjon, vil den endelige konsentrasjonen av inhibitor være 10 mikrometer. TGF-β og hemmere vil stå løpet av eksperimentet. Ta bilder av spheroids under mikroskopet med 40X forstørrelse.
5. Etter 48h av stimulering med TGF-β og / eller hemmere, ta bilder av spheroids under mikroskopet med 40X forstørrelse.
6. Mål området av invaderende spheroids etter 2 dager og trekk fra startområdet. Måling arealet av en Spheroid: Åpne bildet fra Spheroid i Adobe Photoshop Extended (figur 2a) og velg Quick Selection verktøyet (figur 2B). Musepekeren endres til en sirkel med en "pluss" (+) tegnet (figur 2C). Mens du drar markøren over Spheroid, vil Photoshop gjenkjenne grenser Spheroid. Hvis et område utenfor Spheroid er valgt, kan denne regionen bli ekskludert fra utvalget ved å trykke på Alt-tasten eller ved å bruke negativ seleksjon verktøy som er angitt med en (-) tegn i verktøylinjen. Markøren endres til en sirkel med en "minus" (-) tegnet og ved å dra markøren over feilaktig valgte området, er dette området fjernet fra utvalget (figur 2D). Om nødvendig, flere regioner kan velges ved å trykke på ShIFT knappen. Å arbeide mer nøyaktig, kan størrelsen av musepekeren justeres ved å endre pensel diameter på verktøylinjen (figur 2E). Når hele Spheroid er valgt, er området av utvalget beregnes via ANALYSE-tiltak i menylinjen eller ved å trykke Ctrl + Shift + M (figur 2F). Målingen innspilling vinduet vises viser filnavnet og området av utvalget i piksler, samt andre data (figur 2G). Hvis flere valg er målt, viser den første linjen summen av alle områdene. Målingene av de enkelte valgene er presentert i linjene nedenfor. Dataene av alle målingene kan eksporteres til en tekstfil og åpnet i Excel.

5. Representative resultater:

Et eksempel på Spheroid analysen med MCF10A1 (M1) normale bryst epitelceller, forvandlet H-RAS MCF10AneoT (M2) celler og M2-avledet MCF10CA1a (M4) er gitt i Figur 3.. M1 cellene viste kun svak invasjon utenstimulering, men invaderte betydelig bedre ved stimulering av TGF-β. I kontrast til RAS-forvandlet M1-derivative M2 invadert allerede effektivt uten tillegg av stimuli, og dette ble ytterligere økt 4-5 ganger på TGF-β behandling. M4 celler viste den sterkeste invasjonen, både med og uten TGF-β tillegg.

Deretter undersøkte vi om vi kunne forstyrre TGF-β-indusert invasjonen i denne Spheroid modell med kjemiske hemmere. For dette formålet brukte vi SB-431 542, en ATP analoge og selektiv hemmer av kinase aktivitet TβRI, samt activin typen IB reseptor (ActRIB) og activin reseptor-like kinase (ALK) 7 ^12. Som forventet, SB-431 542 potently hemmet TGF-β-indusert invasjon av M1, M2 og M4 celler (fig 4), som indikerer at TGF-β-indusert invasjon er TβRI-kinase avhengig. I tillegg ble basal invasjonen av spheroids også sterkt hemmet, noe som tilsier at basal invasjonen er også dehengig på TGF-β.

Figur 1. Flow diagram av 3D Spheroid analysen. Først er celler belagt under ikke-heftende forhold i u-formet suspensjoner plater. Celler aggregrate inn multcellular spheroids og kan bygges inn i en kollagen matrise. Inn i denne kollagen matrisen, er de i stand til å invadere.

Figur 2. Kvantifisering av området til spheroids ved hjelp av Adobe Photoshop Extended. (A) Bildet av Spheroid åpnes i Adobe Photoshop Extendend (B) Valg av Quick Selection verktøyet (C) drar markøren over Spheroid å velge område av Spheroid (D) Fjerning av en wongly inkludert areal med negative Hurtigvalg-verktøyet (E) Justering av pensel størrelse Quick markeringsverktøyet til mer nøyaktig velge området (F) Valg avmåling kommandoen til posten (G) Eksempel på en måling posten.

Figur 3. TGF-β-indusert invasjon av spheroids av spontant udødeliggjort MCF10A1 (M1) (A), RAS-forvandlet MCF10AneoT (M2 (B) og dets metastatisk avledede MCF10CA1a (M4) (C). M1, M2 og M4 spheroids embedded inn collagen ble behandlet med 5ng/ml av TGF-β for 48t som angitt. AC Representative bilder tatt på den dagen innebygging og to dager senere. D Relativ invasjonen ble kvantifisert som areal forskjell på dag 2 minus dag 0. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD Tilpasset fra ^13.

Figur 4. Basal og TGF-β-indusert Spheroid invasjonen hemmes by SB-431542. M1, M2 og M4 spheroids var innebygd i kollagen og behandlet med 5ng/ml TGF-β og / eller 10 mm SB-431 542 som angitt. Representant bilder tatt etter 2 dager (A). Relativ invasjonen ble kvantifisert som areal forskjell på dag 2 minus dag 0 (B). Resultatene uttrykkes som gjennomsnitt ± SD Tilpasset fra ^13.

Discussion

Vi etablerte en Spheroid modell der MCF10A1 celler og dets ondartet derivater invadere inn en kollagen matrise i en TGF-β-avhengig måte. Først er spheroids dannet i 96-brønner rund bunn suspensjon plater i nærvær av methylcellulose. Selvfølgelig kan også U-formet poly-HEMA belagte plater brukes til dette formålet. Methylcellulose er absolutt nødvendig i dette trinnet, fordi cellene vil dø i fravær av methylcellulose. TGF-β er lagt direkte til kollagen-methocel blanding siden vi fant ut at cellene responderte dårligere til TGF-β når denne faktoren ble lagt til mediet op toppen av kollagen. Men det er tilrådelig å legge kjemiske inhibitorer oppløst i DMSO ikke direkte inn i collagen, siden DMSO utfellinger i icecold kollagen-methocel blanding. Derfor legger vi disse forbindelsene i medium på toppen av kollagen.

Deretter er celler innebygd i en kollagen 3-dimensional miljø for å tillate dem å invadere i kollagen matrisen. Når man sammenligner invasiv egenskapene til de ulike MCF10A1 cellelinjene vi fant ut at basal invasjon samt TGF-β-indusert invasjon økt fra forholdsvis godartet M1 celler, til høyere nivåer i RAS-forvandlet M2 derivat, til enda høyere nivåer i metastatisk M4 variant. Dermed blir invasive egenskaper korrelert med relativ tilstand av aggressivitet av disse tre cellelinjer ^7,8,14.

Innkapsling av Spheroid inn i collagen er et kritisk punkt i analysen. Påvisning av Spheroid i pipettespissen kan være vanskelig når du utfører analysen for de første gangene. Man kan unngå dette ved å samle spheroids i et rør, spinning dem ned, fjerne supernatant og resuspender de spheroids i kollagen-methocel blanding. Dette krever mer spheroids som input som rundt 50% av spheroids er tapt i denne prosessen. Videre, flerespheroids kan ende opp i en brønn, og kan ligge for nær hverandre for å analysere. I tillegg er det foretrukket å ikke har mer enn en Spheroid per godt for å unngå muligheten for at spheroids kan forstyrre hverandre (for eksempel ved å skille vekstfaktorer). Derfor resuspendering trinnet er et kritisk punkt ved hjelp av denne metoden.

En begrensning av denne analysen er at vi analyserer en 3 dimensjonal analyse i en 2 dimensjonal planet. Som kan sees i figurene 3 og 4, de fleste celler vanligvis invadere i samme plan. Men spheroids som ligger veldig nær kanten av brønnen invadere generelt mer i dybden og er derfor ekskludert fra analysen. Selvfølgelig ville det være mulig å utføre analysen i 3D, for å få et mer nøyaktig resultat. Men dette krever avansert maskinvare og programvare og fordelen av å beregne volum i stedet for å bruke området ikke kan oppveie de problemer. Spesielt siden vi fant at variasjonen i å starte størrelseav 3-dimensjonale spheroids målt i 2D, er vanligvis bare 5-10%.

En annen ulempe med denne metoden er at imaging er en tidkrevende skritt, siden spheroids ligger på ulike høyder, noe som vanskeliggjør automatisert bildebehandling. Også analysen trinnet er tidkrevende og krever bilder med god kontrast fra Spheroid til matrise for å gjøre bruk av Photoshops muligheten til å automatisk gjenkjenne grensen til Spheroid. I tilfelle kontrasten er for lav, kan man enkelt tilpasse lysstyrke og kontrast ved hjelp av nivåer og KURVENE kommandoer i Photoshop. En annen måte å øke kontrasten ville være å bruke en vital fluorescerende fargestoff.

Som en alternativ måte å kvantifisering, kunne man trekke området rundt Spheroid manuelt ved hjelp av Image J. Et forkant av Image J er at det er freeware (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Vi fant imidlertid den manuelle tegningen av den uregelmessige formen på invaderte spheroids i Image Jen tidkrevende skritt i forhold til Photoshop Quick Selection Tool.

Protokollen kan tilpasses å undersøke invasjon av andre cellelinjer, forutsatt at cellene er i stand til å danne spheroids.Furthermore, den optimale konsentrasjonen av TGF-β å indusere invasjon av cellelinje kan være forskjellig. I alle våre cellelinjer, induserer TGF-β invasjon ved 5 ng / ml, men M4 yter bedre når man bruker 2 ng / ml.

I tillegg kan denne analysen tilpasses til å måle invasive svar til andre vekstfaktorer som epitelial vekstfaktor (EGF) eller hepatocytter vekstfaktor (HGF).

I våre analyser av basal og TGF-β-indusert invasjonen ble sterkt hemmet av behandling med SB-431 542, en hemmer av type I reseptor for TGF-β. Dette er et bevis på prinsippet om at kjemikalie-hemmere kan brukes i denne analysen. Andre kjemiske hemmere, som MMP-hemmere, har også vært brukt med hell på konsentrasjosjoner anbefalt av produsenten for monolayer cellekultur.

Ved å mestre dette teknikker, kan man teste effekten av kjemiske inhibitorer, knockdown eller overekspresjon av gener på invasjon. Videre, ved å skalere opp analysen til en 24 godt format, kan man isolere RNA ved hjelp av en fenol-kloroform-basert metode (f.eks Trizol ® eller Tripure) etterfulgt av en silica-kolonne basert clean-up. Dette RNA kan brukes til kvantitativ real-time PCR.

Våre Spheroid invasjonen analysen ligner in vivo prosessen tettere enn 2D invasjonen modeller, fordi cellene i spheroids er i ulike metabolske tilstander og samhandle på mer naturlig måte med sine omgivelser ^10. Vi har utført propidium jodid og Fluorescein diacetat flekker å se etter døde og levende celler etter invasjonen analysen og observerte at tilsvarende for in vivo situasjonen, cellene i sentrum er døde og nekrotisk, mens cellene ved than ytterkanten er metabolsk aktiv.

Vi brukte type I kollagen heller da matrigel, fordi flere rapporter har vist at sammensetningen av ekstracellulær matrix i brystkreft er ofte endret, noe som resulterer i fibrotiske stiv foci med høyt kollagen jeg innhold. Det er vist at økt kollagen jeg innholdet fremmer brystkreft dannelse og invasjon ¹⁵ og er assosiert med større forekomst av metastasering ^{16 år.} Mange kreftceller har dermed å invadere gjennom en collagen jeg rikt miljø for å metastasere.

Flere 3D modeller har blitt utviklet over de siste tiårene. Celler kan enten være helt integrert i en matrise eller plassert på toppen av en matrise eller en polymere stillas ^17,18. I en 3D-modell utviklet av Bissell og co-arbeidere, ble cellene dyrket i et rekonstituert basalmembran (RBM) matrise. Denne modellen gir en rask analyse å skille mellom normale og malignemammary epitel, men fokuserer på cellemorfologi ^19,20. Morphogenesis og organisering av den distinkte MCF10A cellelinjene omvendt korrelert med malignitet ^21,22. I andre 3D-modeller flercellede spheroids viste samme motstand mot cytotoksiske legemidler som foreldrehjemmet cellelinje in vivo, mens cellene i monolayers unnlot å gjøre det ^11. Også 3D kulturer av MCF10A cellelinjer som har blitt brukt til å anslå sensitivitet til kinase hemmere ^23. Våre Spheroid modell utfyller disse analyser av spesifikt fokus på invasjon.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methyl cellulose	Sigma-Aldrich	M0512
PureCol	Advanced Biomatrix	5005-B
pH indicator strips	Merck & Co., Inc.	9533
96-well suspension plates	Greiner Bio-One	650 185
96-well adhesion TC plates	Greiner Bio-One	655 180