Spheroid Assay zur TGF-β-induzierte Invasion Measure

Summary

Ein Test zur quantitativen Messung Transforming Growth Factor (TGF)-β-induzierte Invasion im 3-dimensionalen Kollagen-Gelen beschrieben. Dieser Assay nutzt die MCF10A Reihe von Zelllinien, die verschiedenen Stadien der Entwicklung von Brustkrebs darstellen. Diese Methode kann angenommen, um mit anderen Zelllinien verwendet werden und könnte verwendet werden, um andere potenzielle Aktivatoren oder Inhibitoren der Invasion zu untersuchen sein.

Abstract

TGF-β hat entgegengesetzte Rollen bei Brustkrebs Progression, indem sie als Tumorsuppressor in der Anfangsphase, aber anregend Invasion und Metastasierung zu einem späteren Zeitpunkt ^1,2. Darüber hinaus ist TGF-β häufig bei Brustkrebs überexprimiert und seine Expression korreliert mit einer schlechten Prognose und Metastasierung ^3,4. Die Mechanismen, durch die TGF-β induziert Invasion nicht gut verstanden sind.

TGF-β entlockt seiner zellulären Reaktionen via TGF-β Typ II (TβRII) und Typ I (TβRI)-Rezeptoren. Bei TGF-β-induzierte heteromeren Komplexbildung, phosphoryliert TβRII die TβRI. Die aktivierte TβRI initiiert seine intrazelluläre kanonischen Signalweges durch Phosphorylierung Rezeptor Smads (R-Smads), dh Smad2 und Smad3. Diese aktivierten R-Smads Form heteromeren Komplexe mit Smad4, die im Zellkern ansammeln und regulieren die Transkription von Zielgenen ^5. Zusätzlich zu den zuvor described Smad Signalweg, Rezeptor-Aktivierung führt zur Aktivierung von mehreren anderen nicht-Smad Signalwege, zB Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) Signalwege ^6.

Zur Untersuchung der Rolle der TGF-β in verschiedenen Stadien des Brustkrebses, benutzten wir die MCF10A Zellsystem. Dieses System besteht aus spontan immortalisierte MCF10A1 (M1) Brustepithelzellen ^7, verwandelte die H-RAS M1-derivative MCF10AneoT (M2), die Präkanzerosen produziert in Mäusen ⁸ und die M2-Derivat MCF10CA1a (M4), die von gegründete M2 Xenotransplantate und Formen hochgradige Karzinome mit der Fähigkeit, die Lunge ⁹ metastasieren. Diese MCF10A Serie bietet die Möglichkeit, die Reaktionen der Zellen mit verschiedenen Graden der Bösartigkeit, die nicht durch einen anderen genetischen Hintergrund sind voreingenommen zu studieren.

Für die Analyse der TGF-β-induzierte Invasion, generierten wir homotypische MCF10A Sphäroid Zellkulturen embedded in einer 3D-Kollagen-Matrix in vitro (Abb. 1). Solche Modelle ähneln menschlichen Tumoren in vivo durch die Errichtung eines Gradienten von Sauerstoff und Nährstoffen, was aktive und invasive Zellen auf der Außenseite und Ruhe oder auch abgestorbene Zellen in das Innere des Sphäroids ^10. Spheroid basierte Assays haben auch gezeigt, dass bessere rekapitulieren drug resistance als Monolayer-Kulturen ^11. Diese MCF10 3D-Modell-System erlaubt es uns, die Auswirkungen von TGF-β-Signalisierung auf der invasiven Eigenschaften von Brust-Zellen zu untersuchen in verschiedenen Stadien der Bösartigkeit.

Protocol

1. Vorbereitung der Methocel-Lösung (500 mL)

1. Autoclave 6 g Methylcellulose in einer 500 ml Flasche mit einem Magnetrührer.
2. Lösen Sie die Methylcellulose in 250 ml vorgewärmter DMEM/F12 ohne Serum (60 ° C) für 20 min.
3. Add 250 ml DMEM/F12 (RT) mit 10% Pferdeserum. Mix über Nacht (4 ° C).
4. Deaktivieren Sie die Lösung durch Zentrifugation (5000g, 2h, 4 ° C).
5. Nehmen Sie die klare hochviskose Lösung in ein neues Röhrchen (etwa 90-95% der Stammlösung).
6. Lagerung bei 4 ° C bis zur Verwendung.

2. Spheroid Kultur

1. Bereiten Sie eine 20% Methocel-Lösung (10 ml Methocel und 40 ml Wachstumsmedium).
2. Wash Zellen zweimal mit PBS, fügen 0,1% Trypsin und inkubieren Zellen bei 37 ° C
3. Die Zellen in Wachstumsmedium und zählen die Zellen.
4. Eine Suspension von 10 000 Zellen pro ml in 20% Methocel.
5. Fügen Sie die Zellsuspension auf die 96-Well-Rundboden sUSSETZUNG Platten (100 ul pro Well).
6. Am nächsten Tag, überprüfen Sie das Sphäroid Bildung in der Suspension Platten. Sphäroide werden bereit sein für den Einsatz nach 1-3 Tagen.

3. Herstellung von Kollagen

1. Bereiten Sie auf dem Eis eine Lösung von 8 ml Kollagen, 1 ml 10x PBS, 1 ml 0,1 N NaOH und 3 Tropfen 0,1 N HCl. Prüfen Sie, ob pH beträgt 7,4 von Spotting einige der Lösung auf pH-Indikator-Streifen. Der pH-Wert, wenn außerhalb des Bereichs.
2. Add 50 ul neutralisiert Kollagenlösung in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte
3. Bei 37 ° C, bis die Kollagen verfestigt (90 min).
4. Bereiten Methocel-Kollagen-Ligand-Lösungen auf Eis: für jeden Liganden Pipette 1 Teil von Kollagen-Lösung. Add 20 ng pro ml Kollagen TGF-β. Nach dem Verdünnen mit Methocel und Verbreitung über die verschiedenen Schichten wird die endgültige Konzentration von TGF-β 5 ng / ml Mix durch Vortexen werden. 1 Teil Methocel-Lösung. Mix durch Vortexen.

4. Spheroid einbettending

1. Legen Sie eine 200 ul Spitze, die etwa 5 mm von der Spitze abgeschnitten hat, auf einem 200 ul Pipette. Saugen Sie up one Sphäroid mit der Pipette und sorgfältig zu verzichten das Medium in einen leeren Teller. Sehen Sie, wenn das Sphäroid bleibt in der Spitze. Das Sphäroid sichtbar ist als weißer Punkt. Ohne die Freigabe der Kolben, saugen 100 ul Kollagen-Methocel Mischung und verzichtet das Sphäroid in das Kollagen-Gemisch in eine Kollagen-beschichtete 96-Well. Tun Sie dies für 12 Sphäroide für jede Bedingung.
2. Lassen Sie Kollagen festigen mindestens 30 Minuten bei 37 ° C
3. Luftblasen mit einer 200 ul Spitze.
4. Dann werden 50 ul Medium mit 1,6% Serum und Inhibitoren in DMSO gelöst. Für SB-431542 add 4 ul Stammlösung (10 mM) zu 1 ml Medium. Nach der Diffusion wird die endgültige Konzentration des Inhibitors 10 uM werden. TGF-β und Inhibitoren bleibt der Verlauf des Experiments. Machen Sie Fotos von der Sphäroide unter dem Mikroskop mit 40-facher Vergrößerung.
5. Nach 48h der Stimulation mit TGF-β und / oder Inhibitoren, machen Sie Fotos von der Sphäroide unter dem Mikroskop mit 40-facher Vergrößerung.
6. Man misst die Fläche des eindringenden Sphäroide nach 2 Tagen und subtrahieren den Startplatz. Die Vermessung der Fläche eines Sphäroid: Öffnen Sie das Bild aus dem Sphäroid in Adobe Photoshop Extended (Abbildung 2a) und wählen Sie die Schnellauswahl-Werkzeug (Abb. 2B). Der Mauszeiger verwandelt sich in einen Kreis mit einem "Plus"-Zeichen (+) (Abbildung 2C). Während des Ziehens den Cursor über das Sphäroid, wird Photoshop erkennt die Grenzen der Sphäroid. (-)-Zeichen in der Symbolleiste Wenn ein Bereich außerhalb der Sphäroid ausgewählt ist, kann diese Region von der Auswahl durch Drücken der Alt-Taste oder über die negative Selektion Werkzeug, das durch eine angegeben ist ausgeschlossen. Der Cursor verwandelt sich in einen Kreis mit einem "minus" (-)-Zeichen und durch Ziehen der Maus über die falsch gewählten Bereich, wird dieser Bereich von der Auswahl (Abbildung 2d) entfernt. Wenn nötig, mehrere Regionen können durch Drücken der Sh gewählt werdenift-Taste. Um Arbeit genauer kann die Größe des Mauszeigers, indem Sie die Bürste Durchmesser in der Symbolleiste (Abbildung 2E) eingestellt werden. Wenn die ganze Sphäroid ausgewählt ist, wird die Fläche der Auswahl über ANALYSE-Maßnahme in der Menüleiste oder durch Drücken von Strg + Shift + M (Abbildung 2f) berechnet. Die Messwerterfassung Fenster erscheint und zeigt den Dateinamen und den Bereich der Auswahl in Pixel, sowie andere Daten (Abb. 2G). Wenn Mehrfachauswahl gemessen werden, zeigt die erste Zeile die Summe aller Bereiche. Die Messungen der einzelnen Einstellungen sind in den Zeilen dargestellt. Die Daten aller Messungen können in eine Textdatei exportiert werden und in Excel geöffnet.

5. Repräsentative Ergebnisse:

Ein Beispiel für das Sphäroid-Assay mit MCF10A1 (M1) normal Brustepithelzellen verwandelte H-RAS MCF10AneoT (M2)-Zellen und M2-derived MCF10CA1a (M4) ist in Abbildung 3 angegeben. M1-Zellen zeigten nur schwache Invasion ohneStimulation, sondern fielen deutlich besser nach Stimulation durch TGF-β. Im Gegensatz dazu die RAS-transformierten M1-derivative M2 überfallen bereits effizient und ohne Zusatz von Stimuli, und das war weitere 4-5 fach auf TGF-β Behandlung erhöht. M4-Zellen zeigten den stärksten Einbruch, mit und ohne TGF-β hinaus.

Als nächstes untersuchten wir, ob wir mit TGF-β-induzierte Invasion in dieses Sphäroid-Modell mit Hilfe chemischer Inhibitoren stören. Zu diesem Zweck benutzten wir SB-431542, einem ATP-Analogon und selektiver Inhibitor der Kinase-Aktivität von TβRI sowie Activin Typ IB Rezeptor (ActRIB) und Aktivin-Rezeptor-ähnliche Kinase (ALK) 7 ^12. Wie erwartet, SB-431542 inhibiert TGF-β-induzierte Invasion von M1, M2 und M4-Zellen (Abb. 4), was darauf hinweist, dass TGF-β-induzierte Invasion TβRI-Kinase abhängig. Darüber hinaus die basale Invasion der Sphäroide wurde auch stark gehemmt, was darauf hindeutet, dass die basale Invasion ist auch dehängig von TGF-β.

Abbildung 1. Flussdiagramm der 3D-Sphäroid-Assay. Zunächst werden die Zellen unter nicht-adhärenten Bedingungen in u-förmigen Suspensionen ausplattiert. Cells aggregrate in multcellular Sphäroide und kann in eine Kollagen-Matrix eingebettet werden. In diese Kollagen-Matrix, sind sie in der Lage, anzugreifen.

Abbildung 2. Quantifizierung der Bereich der Sphäroide mit Hilfe von Adobe Photoshop Extended. (A) Das Bild des Sphäroids ist in Adobe Photoshop Extendend (B) Auswahl des Schnellauswahl-Werkzeug (C) Ziehen Sie den Mauszeiger über das Sphäroid in den Bereich der Sphäroid (D) Entfernung eines wongly enthalten Gebiet mit der Option eröffnet negativen Schnellauswahl-Werkzeug (E) Die Einstellung der Pinselgröße des Schnellauswahl-Werkzeug, um genauer den Bereich auswählen (F) Auswahl derMessung Befehl zur Aufzeichnung (G) Beispiel für ein Messprotokoll.

Abbildung 3. TGF-β-induzierte Invasion von Sphäroiden spontan verewigt MCF10A1 (M1) (A), RAS-transformierten MCF10AneoT (M2 (B) und seine Metastasen derivative MCF10CA1a (M4) (C). M1, M2 und M4 Sphäroide embedded in Kollagen wurden mit 5ng/ml von TGF-β für 48h behandelt wie angegeben. AC Vertreter aufgenommenen Bilder am Tag der Einbettung und zwei Tage später. D Relative Invasion wurde als Gebiet Unterschied am Tag 2 minus Tag 0 quantifiziert. Die Ergebnisse ausgedrückt werden als Mittelwert ± sd ab ¹³ angepasst.

Abbildung 4. Basal-und TGF-β-induzierte Sphäroid Invasion gehemmt by SB-431542. M1, M2 und M4 Sphäroide wurden in Kollagen eingebettet und mit TGF-β 5ng/ml und / oder 10 uM SB-431542, wie angegeben. Vertreter Bilder nach 2 Tagen (A) übernommen. Relative Invasion wurde als Gebiet Unterschied am Tag 2 minus Tag 0 (B) quantifiziert. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± sd von ¹³ Adapted ausgedrückt.

Discussion

Wir haben ein Sphäroid Modell, in dem MCF10A1 Zellen und ihre bösartigen Derivate in eine Kollagen-Matrix in einem TGF-β-abhängigen Weise zu erobern. Erstens sind Sphäroide in 96-Wells mit rundem Boden Aufhängeplatten in Gegenwart von Methylcellulose gebildet. Natürlich können auch U-förmigen Poly-HEMA beschichteten Platten für diesen Zweck verwendet werden. Methylcellulose ist absolut in dieser Schritt erforderlich, da die Zellen in Abwesenheit von Methylcellulose sterben. TGF-β ist direkt an die Kollagen-Methocel zugegeben, da fanden wir, dass die Zellen weniger gut reagierte auf die TGF-β, wenn dieser Faktor auf das Medium op Spitze des Kollagen wurde hinzugefügt. Allerdings ist es ratsam, chemische Inhibitoren in DMSO nicht direkt aufgelöst in die Collagen fügen, da die DMSO fällt in der eiskalten Kollagen-Methocel Mischung. Daher fügen wir diese Verbindungen in das Medium auf der Oberseite des Kollagens.

Anschließend werden die Zellen in einer Kollagen-3-dimens embeddedional Umfeld, damit sie in die Kollagenmatrix zu erobern. Beim Vergleich der invasiven Eigenschaften der verschiedenen MCF10A1 Zelllinien fanden wir, dass die basale Invasion sowie TGF-β-induzierte Invasion erhöhte sich von der relativ gutartigen M1-Zellen, zu höheren Ebenen in der RAS-transformierten M2-Derivat, auf ein noch höheres Niveau in der metastasiertem M4-Variante. So die invasiven Eigenschaften mit der relativen Zustand der Aggressivität dieser drei Zelllinien ^7,8,14 korreliert.

Die Einbettung der Sphäroid in das Kollagen ist ein wichtiger Schritt in dem Test. Der Nachweis der Sphäroid in der Pipettenspitze schwierig sein könnte, bei der Testdurchführung für die ersten paar Male. Man kann dies durch das Sammeln der Sphäroide in einem Rohr zu vermeiden, drehen sie auf, das Entfernen Überstand und resuspendieren die Sphäroide in Kollagen-Methocel Mischung. Dies erfordert mehr Sphäroide als Eingang als etwa 50% der Sphäroide in diesem Prozess verloren geht. Darüber hinaus mehrereSphäroide können am Ende in einem gut und vielleicht zu nahe beieinander liegen, zu analysieren. Darüber hinaus ist es bevorzugt, nicht mehr als ein Sphäroid pro Vertiefung haben die Möglichkeit, dass Sphäroide können sich gegenseitig stören (zB durch Sekretion Wachstumsfaktoren) zu vermeiden. Deshalb ist die Resuspension Schritt ist ein kritischer Schritt mit dieser Methode.

Eine Einschränkung dieses Tests ist, dass wir eine 3-dimensionale Assay in einem 2-dimensionalen Ebene zu analysieren. Wie in den Abbildungen 3 und 4 zu sehen ist, die meisten Zellen in der Regel in der gleichen Ebene zu erobern. Allerdings Sphäroide, die sehr nahe an der Kante der Lage sind gut eindringen generell mehr in die Tiefe und sind aus diesem Grund von der Analyse ausgeschlossen. Natürlich wäre es möglich sein, die Analyse in 3D ausführen, um ein genaueres Ergebnis zu erhalten. Aber dies erfordert anspruchsvolle Hard-und Software und der Nutzen der Berechnung Volumen statt der Verwendung der Fläche darf nicht größer als die Schwierigkeiten. Vor allem, da wir festgestellt, dass die Variation in Größe abder 3-dimensionalen Sphäroide als in 2D gemessen wird, ist in der Regel nur 5-10%.

Ein weiterer Nachteil dieser Methode ist, dass die Abbildung eine zeitaufwendige Schritt ist, da die Sphäroide in verschiedenen Höhen, die die automatisierte Bildgebung behindert befinden. Auch die Analyse Schritt ist zeitaufwendig und erfordert Bilder mit gutem Kontrast von Sphäroid zu Matrix in Ordnung zu nutzen Photoshops Fähigkeit, erkennen automatisch die Grenze des Sphäroids. Im Falle der Kontrast zu gering ist, kann man sich leicht anpassen Helligkeit und Kontrast mit der Tonwertkorrektur und Gradationskurven-Befehle in Photoshop. Eine weitere Möglichkeit, den Kontrast zu erhöhen wäre, die Nutzung eine wichtige Fluoreszenzfarbstoff werden.

Als eine alternative Möglichkeit der Quantifizierung, eines der Bereich um das Sphäroid ziehen konnte manuell mit Bild J. einen Vorschuss von Image J ist, dass es Freeware (http://rsbweb.nih.gov/ij/) ist. Allerdings fanden wir die manuelle Erstellung der unregelmäßigen Form der Invasion Sphäroide in Image Jein zeitaufwändiger Schritt zur Schnellauswahl-Werkzeug von Photoshop verglichen.

Das Protokoll kann angepasst Invasion von anderen Zelllinien untersucht werden, vorausgesetzt, dass die Zellen in der Lage, spheroids.Furthermore, die optimale Konzentration von TGF-β zur Invasion der Zelllinie induzieren könnte anders sein zu bilden. In allen unseren Zelllinien induziert TGF-β Invasion bei 5 ng / ml, wobei M4 eine bessere Leistung bei der Verwendung von 2 ng / ml.

Darüber hinaus kann dieser Test angepasst invasive Antworten auf andere Wachstumsfaktoren, wie Epithel-Wachstumsfaktor (EGF) oder Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF) zu messen.

In unseren Tests der Basal-und TGF-β-induzierte Invasion war stark gehemmt durch die Behandlung mit SB-431542, einem Inhibitor der Typ-I-Rezeptor für TGF-β. Dies ist ein proof of principle, dass chemische Inhibitoren in diesem Assay verwendet werden kann. Andere chemische Inhibitoren, wie MMP-Hemmern, wurden ebenfalls erfolgreich bei Konzentrationen verwendetgen vom Hersteller für Monolayer-Zellkultur empfohlen.

Nach Beherrschung dieser Techniken kann man testen die Wirkung von chemischen Inhibitoren, Knockdown oder Überexpression von Genen auf die Invasion. Weiterhin wird durch Aufstockung des Tests zu einer 24-Well-Format, kann man isolieren Sie die RNA mit einer Phenol-Chloroform-basierte Methode (z. B. Trizol ® oder Tripure) durch eine Silica-Säule basiert clean-up an. Diese RNA kann für quantitative real-time PCR verwendet werden.

Unsere Sphäroid Invasion Assay ähnelt der in vivo-Prozess stärker als 2D-Invasion Modelle, da die Zellen in Sphäroide in verschiedenen metabolischen Zuständen sind und interagieren in natürlicher Weise mit ihrer Umgebung ^10. Wir haben Propidiumiodid und Fluorescein Diacetat Färbung durchgeführt werden, um für die toten und lebenden Zellen nach der Invasion Assay überprüft und festgestellt, dass ähnlich wie bei der in vivo Situation, die Zellen in der Mitte tote und nekrotische sind, während die Zellen bei tEr äußeren Rand sind metabolisch aktiv.

Wir verwendeten Kollagen Typ I anstatt Matrigel, da mehrere Berichte haben gezeigt, dass die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix bei Brustkrebs häufig verändert wird, was in fibrotischen steif Brennpunkten mit einem hohen Kollagen I Inhalt. Es hat sich gezeigt, dass eine erhöhte Kollagen I Inhalt Brustkrebs die Bildung und die Invasion ¹⁵ fördert und ist mit einer größeren Häufigkeit von Metastasen ¹⁶ zugeordnet. Viele Tumorzellen haben also durch eine Kollagen-Invasion Ich reiche Umgebung in Ordnung zu metastasieren.

Mehrere 3D-Modelle haben in den vergangenen Jahrzehnten entwickelt worden. Die Zellen können entweder vollständig innerhalb sein in eine Matrix eingebettet oder auf der Spitze eines Matrix oder einem polymeren Gerüst ^17,18. In einem 3D-Modell von Bissell und Mitarbeiter entwickelten, wurden die Zellen in einem wiederhergestellten Basalmembran (RBM)-Matrix entwickelt. Dieses Modell bietet einen schnellen Test, um zwischen normalen und malignen unterscheidenMamma Epithel, sondern konzentriert sich auf Zellmorphologie ^19,20. Morphogenese und Organisation der verschiedenen MCF10A Zelllinien invers mit malignen ^21,22 korreliert. In anderen 3D-Modelle vielzelligen Sphäroide zeigte die gleiche Resistenz gegen zytotoxische Medikamente als ihre Eltern Zelllinie in vivo, während Zellen in Monolayer nicht so ^{11 zu} tun. Auch 3D-Kulturen MCF10A Zelllinien wurden verwendet, um Sensibilität für Kinase-Inhibitoren ²³ zu bewerten. Unsere Sphäroid-Modell ergänzt diese Assays durch gezielte Nutzung von Invasion.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methyl cellulose	Sigma-Aldrich	M0512
PureCol	Advanced Biomatrix	5005-B
pH indicator strips	Merck & Co., Inc.	9533
96-well suspension plates	Greiner Bio-One	650 185
96-well adhesion TC plates	Greiner Bio-One	655 180