Summary
여기 우리는 전기 생리학 및 Ca2 + 이미징에 적합 한천 - 임베디드 망막 조각의 준비를 위해 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 하나 하나 presynaptic 신경 터미널 직접 패치 - 클램프 녹음을 사용하여 망막 microcircuits의 리본 형태의 시냅스를 공부하실 수 있습니다.
Abstract
시각적 자극은 척추 망막 전문 뉴런에 의해 빛의 강도 및 주파수 변화 넓은 동적 범위에서 감지하고 전달하고 있습니다. 망막 뉴런, photoreceptors 및 바이폴라 전지의 두 클래스는 오랜 기간 동안 지속과 높은 처리량 신경 전달 물질 자료를 활성화 리본 타입의 활성 영역을 사용하여이 작업을 수행할. 빛의 자극에 depolarize 및 혼합로드 및 원뿔 photoreceptor 입력을받을 금붕어 망막에서 타입의 혼합 바이폴라 셀 (MB) 터미널, 그들의 큰 크기로 인해 모두 리본 타입의 시냅스 (~ 10-12의 연구에 적합 μm의 직경)와 amacrine 세포 dendrites 자신의 여러 측면과 상호 시냅스 연결합니다. 패치 - 클램프 기법과 금붕어 망막 조각에서 MB 바이폴라 전지 터미널에 직접 액세스 presynaptic 칼슘 2의 측정을 허용 + 전류, 멤브레인 용량 변경, GABA에 의해 중재 상호 시냅스 피드백 억제 <서브> A 및 GABA C 수용체가 터미널에 표시됩니다. exocytosis의 Presynaptic 막 커패시턴스 측정 하나는 흥분성의 신경 전달 물질 방출 14,15의 단기 소성을 공부하실 수 있습니다. 또한, amacrine 세포의 억제 신경 전달 물질 방출의 단기 및 장기 소성도 MB 터미널 21에 도착 상호 피드백 억제의 기록 조사 수 있습니다. 시간 (예 : ~ 10들)의 짧은 기간 동안 amacrine 세포에서 GABAergic 상호 피드백 억제는 GABA 소포 풀 고갈 11을 통해 이점 - 펄스 우울증을 겪습. 망막의 내부 plexiform 계층에서 망막 microcircuits의 시냅스 역학 따라서 직접적으로 공부하실 수 있습니다.
두뇌 - 슬라이스 기술은 40 년 이상 전에 발표했지만 여전히 매우 모두 하나의 세포 소마 단일 dendrite 또는 축삭에서 뉴런의 전기적 특성의 조사에 유용하고, m가되었습니다icrocircuit 시냅스 레벨 19. 깔끔히 챔버에 직접 접착 너무 작은 조직은 종종 첫번째 한천에 포함된 (또는 필터 종이에 위치) 그리고 20, 23, 18, 9 슬라이스하고 있습니다. 이 비디오에서는, 우리는 금붕어 망막을 사용하여 미리 포함 한천 기술을 사용합니다. 금붕어 망막 우리의 조각에있는 거대한 바이폴라 셀 단말기의 일부가 깔끔히 절차를 수행하는 동안 (축삭 절단) axotomized 있습니다. 이것은 axotomized 터미널에서 녹화가 소마 - 돌기 구획에서 신호를 배제하기 때문에 우리, 하나 presynaptic 신경 터미널 입력을 분리 할 수 있습니다. 또한, 하나도 깔끔히 절차를 수행하는 동안 컷되지 않은 axons에 연결된 터미널에서 기록하여, 손상 MB 바이폴라 세포에서 녹화할 수 있습니다. 전반적으로,이 실험 프로토콜의 사용이 망막 신경 생리학, microcircuit 기능 분석 및 리본 시냅스에서 시냅스 전달 연구에 도움이됩니다.
Protocol
1. 외부 및 내부 솔루션
- 10X 재고 솔루션에서 깔끔히 솔루션 (낮은 칼슘)를 준비하고 MgCl 2, CaCl 2, D - 포도당을 매일 추가합니다. 119 NaCl, 2.5 KCl, 3.2 MgCl 2, CaCl 0.25 12 ~ D - 글루코오스, 0.2 L - 아스코르비 산, 12 HEPES : 최종 1X 솔루션은 (MM)을 구성되어 있습니다. 7.4 (NaOH와 함께)로 산도를 설정하고, 260 mOsm (H 2 O 및 10X 재고 솔루션을 사용)에 osmolarity를 조정합니다.
- 3퍼센트 낮은 겔화 - 온도 한천을 무게 (아가로 오스 유형 VII - A, A0701, 시그마, Rieke, 2001) 및 솔루션을 깔끔히과 함께 섞는다. 1-2 분 전자렌지에 한천이 포함된 솔루션을 열, 또는 완전히 녹이고까지, 그리고 급속한 응고 (겔 전이 온도 방지하기 위해 물 - 목욕 (30-33 ° C)에서 한천을 품어 : 26 ± 2 ° C).
- 10X 재고 솔루션에서 녹음 솔루션 (정상 칼슘)를 준비하고 MgCl 2, CaCl 2, D - 포도당을 매일 추가합니다. 최종 1X 솔루션 consis의 TS (MM)를 : 100 NaCl, 2.5 KCl, 1 MgCl 2, 25 NaHCO 3 0.2 L - 아스코르비 산, 2.5 CaCl 2, 12 D - 글루코오스. 95%의 솔루션을 버블링 후 5-10분에 대한 O 5분의 2 %의 CO 2 (carbogen)는 7.4 (NaOH와 함께)로 산도를 설정하고, 260 mOsm (H 2 O 및 10X 재고 솔루션을 사용)에 osmolarity를 조정합니다.
- 내부 피펫 솔루션 Aliquots (1 ML 각)는 사전에 준비하고 냉동실 (-20 ° C)에 저장됩니다. 두 개의 내부 피펫 솔루션은 일반적으로 바이폴라 전지 칼슘 전류를 (MM)를 분리하는 데 사용됩니다 :
- 40 CsCl, 60 CS - 글루 콘 산, 10 tetraethylammonium (차) - CL, 28 HEPES, 3 MG - ATP, 1 나 - GTP, 2 EGTA. 7.2 (CsOH와 함께)로 산도를 조정하고 osmolarity는 250 mOsm로 설정합니다. 이 높은 염화물 내부 솔루션은 일반적으로 -60 뮤직 비디오의 바이폴라 전지 막 쉬고있는 가능성에서 낮은 직렬 저항 레코딩 (더 나은 전압 클램프 조건)와 큰 억제 postsynaptic 전류 (IPSCs)를 제공합니다.
- 95 CS - 글루 콘 산 10 차 - CL, 25 HEPES, 3 MG - ATP, 0.5 나 - GTP, 그리고 0.5 EGTA. 7.2 (CsOH와 함께)로 산도를 조정하고, mOsm 22 250 osmolarity를 설정합니다. 이 낮은 EGTA 내부 솔루션은 일반적으로 높은 막 커패시턴스 변화 단계 펄스를 depolarizing하여 elicited에 이르게하므로 소포 풀 고갈과 단기 우울증의 연구를 수 있습니다.
2. 패치 - 클램프 피펫 전극
- 준비 두꺼운 벽으로 둘러싸인 (1.5 mm 외경) borosilicate 유리 (1B150F - 4, 세계 정밀 계측기, 사라소타, FL) 및 수직 풀러 (Narishige, PP830, 도쿄, 일본)를 사용하여 패치 pipettes를 가져옵니다. 녹음 솔루션 열기 - 팁 패치 피펫 resistances은 피펫은 내부 피펫 솔루션 # 1으로 가득 때 7-8 MΩ 있습니다.
- 문장 끝의 치과 왁스로 피펫 홀더 (Cavex, 웨스트 체스터, PA)에 도달 축의 레벨로 균일하게 패치 - 피펫. 이것은 피펫 커패시턴스 및 전기 노이즈를 최소화하고 가능하게보다 정확하고 낮은 소음 커패시턴스 측정. 낮은 피펫 커패시턴스는 또한 EPC - 9 (또는 EPC - 10) 패치 클램프 증폭기의 전자 (빠른 정전 용량) C - 빠른 보상을하는 데 도움이됩니다.
3. 한천 - 임베디드 망막 조각의 준비
- 어두운 적응 30 분 어두운 방에서 덮여 양동이와 장소, 금붕어 (Carassius auratus 8~16센티미터)를 선택합니다. 마취 후, 신속하게 잘린 및 척수와 뇌간의 이중 pithing하여 진정 금붕어를 안락사. 다음 곡선 - 팁 가위과 곡선 - 팁 핀셋으로 눈을 제거합니다. 이러한 절차는 오레곤 건강 과학 대학에서 기관 동물 케어 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
- 스프링 가위 (15003-08, 파인 과학 도구, 가위 팁을 펑쳐링로 잘라 시작)를 눈 앞에있는 주변 균일하게 절단하여 각 눈을 Hemisect하고, 냉장 슬라이스 솔루션 (낮은 칼슘)의 eyecups를 놓습니다. 경우 necessary, 핀셋 (렌즈는 보통 눈 앞에와 분리합니다)와 함께 렌즈를 제거합니다. 전체 360 ° 주위를 천천히 진행, 멀리 세안 컵에서 망막 껍질에 45 ° 직각 팁 벌금 포셉 한 켤레 (11251-35, 파인 과학 도구)를 사용하여 첨부 안료 상피와 망막을 제거합니다. 세베르 또는 벌금 포셉 또는 스프링 가위 중과 시신경을 절단. 수정 파스퇴르 피펫 또는 전송 피펫 (대형 팁)에서 적용 직각 좋은 팁 포셉 및 흡입의 조합과 함께 부드럽게 망막을 제거합니다. 망막에 연결된 안료 상피의 나머지를 제거하는 직각 좋은 팁 집게를 사용하십시오. 청소하고 건강한 망막의 표면은 어둡고 부드러운 붉은 색 나타납니다. 모든 어두운 안료 상피 세포의 완전한 제거를위한 1 시간 (8, 1992)의 망막을 어두운 적응.
- 객실 15-30 분, (H6254, 시그마 3) hyaluronidase, ~ 0.03 % (~ 0.36 밀리그램 / ML 1X에서 슬라이스 솔루션 wt / 권)와 격리 망막을 치료유리체 유머를 제거하는 온도 (20-23 ° C). 이 부화하는 동안, 당신은 얼음처럼 차가운 슬라이스 솔루션을 준비하실 수 있습니다.
- 에 부착된 면도날의 작은 세그먼트 (Personna, 양날, 70 % 에탄올과 H 2 O와 청소)와 곡선 가장자리를 제거하여 망막의 사각형 조각 (~ 2x2 mm, 망막의 전체 두께를 포함)를 절단 1 ML 플라스틱 주사기의 몸, 그리고 한천 솔루션 ((1.2)에 준비)으로 가득한 작은 컨테이너에 망막 기사를 전송합니다. 그것이 액체 배지에 위치로 망막 주위 솔루션의 양을 최소화하기 위해보십시오. 한천 20, 18, 9 응고하는 차가운 슬라이스 솔루션 ((3.3)에서 준비)에 직접 빠져. 우리는 작은 손으로 컨테이너를 사용합니다. 간단히, 작은, 원통형 튜브는 (Fisherbrand, 폴리에틸렌 샘플 튜브 2.5 ML, 03-338 - 1B) 양쪽에서 잘라 Parafilm (PM - 996, Pechiney 플라스틱 포장) 패치와 함께 봉인된 상태 였어요.
- 1로 고체 한천 블록을 잘라망막의 사각형 조각을 포함하는 x1x1 cm 큐브.
- 슬라이스 챔버와 깔끔히 접시의 표면에 접착제를 위해 블록을 전송합니다. 슬라이스 챔버는 냉동실 (-20 ° C)에서 미리 냉각이다. 얼음처럼 차가운 슬라이스 솔루션 Vibratome 슬라 이서 (VT1000S 또는 VT 1200S, Leica)를 사용하여 200-250 μm의 두께로 슬라이스 블록을 잘라요. 5 to10 조각의 총에 대한 5~6시간에 대한 실용적있는, 구할 수 있습니다.
- 녹화 실로 조각 중 하나를 전송합니다. 슬라이스 위에 U 자형의 백금 프레임 19 접착 나일론 스레드의 그리드를 삽입하고, 95% O 5분의 2 % CO 2 (carbogen와 함께 부풀어 오른 녹음 솔루션 (분당 1-2 ML의 비율) 지속 perfuse ).
문제 해결 :
한천 블록에 포함된 망막 조각이 깔끔히 동안 분리 또는 한천 나오는 경우, 하나는 20 μm의 단위로 최대 300 μm의 200 μm의에서 슬라이스 두께를 증가시킬 수. 또한 그것이 롤백 "Kimwipe"종이 팁과 추가 솔루션을 빨아하여 액체 배지에 전송하고 위치로 망막 주위 솔루션의 양을 최소화하려고합니다. 이 문제를 피하기 위해 또 다른 방법은 처음 한천에 배치 망막 부분의 크기를 줄이는 것입니다. 유리체 유머 완전히 망막 조각에 연결에서 한천을 금지하기 때문에, 그것은 신선한 hyaluronidase를 만들거나 보육 시간 (단계 (3.3)) 조정해야 할 수도 있습니다.
4. 망막 슬라이스의 양극성 세포 시냅스 단말기의 식별
- 직립 현미경 (예 : BX51WI, 올림푸스)에서 망막 슬라이스를 놓습니다. 우리는 60x 물에 침지 목표 (NA 0.90, 올림푸스)와 CCD 카메라 (XC - 75, 소니)를 통해 적외선 미분 간섭 대비 (IR - DIC) 광학과 망막 슬라이스를 볼 수 있습니다. CCD 카메라의 출력은 아날로그 소니 13 "blac에 시각화하기 전에 명암 향상을위한 카메라 컨트롤러 (C2400, 하마 마츠)로 전송됩니다K과 흰색 모니터링합니다. 현미경은 XY 번역 무대에 탑재되며, 녹음 챔버는 고정된 무대 14 일 배치됩니다.
- 그들의 크기, 모양 및 조각 (그림 1)에 위치하여 확인할 수 있습니다 하나 온전하고 axotomized (축삭 절단) 바이폴라 전지 터미널을 찾아보십시오. Axotomized 및 손상 터미널은 또한 capacitative 과도 전류 감쇠 시간의 시험 (단일 지수 대 두 지수가 쇠퇴하여, 각각) 및 CA 2 구분할 수 + 전류 (그림 2, 12, 14, 15). 금붕어 망막의 내부 plexiform 계층에서, MB 단말기는 sublamina B의 가장 근위 계층 (신경절 세포 레이어에 인접한 ON - 타입 레이어)에 있습니다. MB 터미널은 그들의 무딘 표면과 평면 외관과 함께, 쉽게 신경절 및 위상 - 밝고 구면 나타나는 갑작스런 amacrine somas에서 구별하실 수 있습니다. 또한, MB 터미널의 가장자리는 높은 덮여있다시냅스 연락처 밀도 및 신경절 및 amacrine 세포 (그림 1A - C)의 부드럽고 깨끗한 표면에 비해 거칠고 불규칙 나타납니다. 그대로 단말기가 자주 망막의 내부 핵 계층 (그림 1A, B) 방향으로 가리키는 슬쩍 엔드와, 타원형 및 뻗어 표시하면서 Axotomized MB 터미널, 원형 및 원형 근처 (그림 1C)을 나타납니다.
- 손상되거나 건강에 해로운 터미널 자주 부어 모양과 표면에 여러 개의 작은 입상 구조를 표시합니다. 그것은이 터미널에 GΩ 인감을 얻을 수도 있지만 그들은 곧 침입 이후에 파열 가능성이 있습니다. 건강에 해로운 터미널의 다른 증상은 속이 빈 모양, 대비 및 / 또는 주변 슬라이스, 그리고 때로는 조각의 표면에 위치에 동일한 밝기를 포함합니다. (교수실 또한 단면의 표면 근처에 : 이것은 슬라이스 깊은 건강한 터미널 (자세한 그대로 시냅스 회로 활용)에서 모두 기록 할 수 있습니다antage : 외부 솔루션 perfused 마약에 빨리 접근, 인감 쉽게).
5. Electrophysiological 녹음 및 CA 2 + 영상
- 0.2 μm의 필터 팁 (Nalgene)와 주사기를 사용하여 피펫의 뒤쪽에서 수준 1~2cm 내부 솔루션으로 유리 패치 피펫을 작성하십시오. 팁에서 공기 방울을 제거한 후, 홀더에 피펫을 확보 긍정적인 압력 (1.2-1.6 PSI)을 적용하고 micromanipulator를 사용하여 대상 터미널 (MPC - 200, 셔터 악기)쪽으로 그것을 이동합니다. 슬라이스를 통해 아래 팁을 움직이는 동안 슬라이스가 끝과 함께 가져온되지 않도록 측면 전면 방향으로 피펫을 이동합니다.
- 멤브레인 표면을 청소 터미널 주변의 피펫 팁을 이동합니다. 보조개을 (들여쓰기) 만들고, 긍정적인 압력을 릴리스 터미널의 가장자리에 아래 팁을 누르십시오. GΩ 밀봉 바로 구성하지 않는 경우, 약간의 부정적인 압력을 적용합니다. GΩ 밀봉 후, EPC - 9 패치 클램프 증폭기의 세포에서 녹화 모드로 전환하고 -60 또는 -70 뮤직 비디오에 개최 가능성을 변경합니다. C - 고속 (고속 용량) 보정을 적용, 전체 세포 녹화 설정을 수립 입으로 적용 날카로운, 부드러운 흡입으로 멤브레인를 50-10 GΩ 사이의 안정화 인감 때까지 기다린 다음 파열. 전체 셀 구성이 올바르게 설치되어있다면, 시리즈 저항 MΩ 14-30 사이 여야합니다. 입력 저항은 axotomized 터미널 14 그대로 터미널과 1-3 GΩ에 대한 MΩ 200-500 것입니다.
- 온전하고 axotomized 바이폴라 전지 터미널 구별하기 위해 (그림 2A와 2C) 용량성 전류 과도를 관찰. 온전하고 axotomized MB 단말기는 각각 기준 막 9-16 PF의 용량과 3-8 PF을 보유하고 있습니다.
- -70에서 axotomized MB 터미널 0 MV에 200 MS 기간 전압 클램프 단계를 적용합니다. 이 수대형 (~ 200-600 PA), 안으로 칼슘 2 절연 + 전압 - 의존 L - 타입 칼슘 2의 개방에 의해 활성화 전류 + 채널 (그림 2B)의 직접 측정. 병렬로, 하나는 시냅스 vesicles의 exocytosis로 인한 커패시턴스 점프, 그리고 칼슘이의 급속한, 산도 - 중재 억제 + 현재 exocytosis 15 다음과 GABAergic 상호 피드백 억제 (; 22 그림 3C)을 모니터링 할 수 있습니다. 한 패치가 손상 MB 바이폴라 전지 단자면 결과는 그림 2C와 2D 표시됩니다. 아무도보고 알 수있는 칼슘도 2 + 전류 때문에 MB 바이폴라 세포 1의 dendrites의 갭 접합 커플링로 인해 큰 "누출"전류 관찰하고 있습니다.
- 막 커패시턴스 변화는 시간이 해결 막 커패시턴스 측정 6 "사인 DC +"방법을 사용하여 -70 뮤직 비디오의 개최 가능성에서 0 뮤직 비디오로 단계 탈분극에 의해 evoked 수 있습니다. 막 커패시턴스 점프는 플라즈마 막과 시냅스 vesicles의 융합을 나타냅니다. 2 kHz에서 sinusoidal 전압 클램프 명령 (30 MV 피크 - 투 - 피크)가 -70 뮤직 비디오의 개최 가능성에 추가되었습니다. 녹음 전류의 EPC - 9 패치 - 클램프 증폭기 소프트웨어 에뮬레이션하여 두 직교 위상 각도에서 분석되었다 잠금 기능 증폭기 (HEKA, Lambrecht, 독일). 그림 2D, 고주파 (2 kHz에서) sinusoidal 자극 경계 기준 커패시턴스 CM이있는 터미널 엔딩과 축삭 ~ 6.8 PF로 분석되는 멤브레인 커패시턴스의 손상 터미널. 세포 기관과 양극성 세포의 dendrites의 막은 따라서 고주파 전압 클램프 sinewave 13에 의해 필터링됩니다.
- (;) O - 6806, Invitrogen 예 오레곤 그린 488 BAPTA - 1 (100-200 μm의)와 프로토콜을에서 반복 칼슘 2 + 영상 실험은 철저히 칼슘 2 +에 민감한 형광 염색과 내부 패치 피펫 솔루션을 혼합 50.1-5.5. 이것은 하나는 형광 이미징과 electrophysiological 녹음을 결합 수 있습니다. 예를 들어, 이미지 칼슘 2 + 과도 -70에서 MB 터미널 (그림 3A, B)의 작은 telodendria의 appendages 0 뮤직 비디오에 200 MS 단계와 연관된를 할 수 있습니다. 우리는 회전하는 디스크 레이저 공촛점 현미경 시스템 (CSU - X1, Yokogawa) 우리의 직립 올림푸스 현미경을 통합했습니다. 공촛점 현미경은 488 NM 및 음향 광학 조정할 수있는 필터에 의해 변조된 아르 561 나노미터 레이저 라인을 사용합니다. 데이터 Slidebook 소프트웨어를 (; 지능형 영상 악기 3i)를 사용 찾았습니다. 금붕어 망막 뉴런을 사용하는 칼슘 이미징 기술에 대한 자세한 내용은 24, 17, 3을 참조하십시오.
문제 해결 :
하나는 자주 전체 셀 구성을 설정하는 데 실패하는 경우에도 안정적인 GΩ의 인감 형성 이후, 그것은 터미널에게 소중히 나를 사용하는 부정적인 압력을 줄이기 위해 도움이 될 수 있습니다mbrane. 또한 전체 셀 구성의 설립을위한 최적의 흡입 압력이 막 곡률 (소마> 터미널)의 함수로 다릅니다되는 경우 수 있습니다. , 단독으로 또는 조합에 부정적인 압력의 날카로운 펄스와 전체 세포 구성을 입력 그것은 해치 프로토콜 (100 μs : : 400 뮤직 비디오, 교육 진폭)를 사용하는 것도 가능합니다. 우리는 12 MΩ 초과 목욕 저항과 피펫 팁을 사용할 때 침입에 특히 유용하게 사용될 수있는 해치 프로토콜을 발견했다.
6. 대표 결과
그림 1. 금붕어 망막 조각에서 MB 바이폴라 셀 단말기의 식별. (AC) IR - DIC MB 바이폴라 셀 단말기의 이미지. 우리는 IR - DIC 이미지 가능성 axotomized (축삭 절단)과 그대로 단말기를 식별할 수 있습니다. C와 같이 axotomized 터미널, 원형 및 원형 나타납니다손상 터미널 타원형 나타날 가능성이 있지만, 같은 A와 B에 표시됩니다. 이 분류는 과도 용량 측정 (그림 2 참조)하거나 염료 작성 방법 (- F D)에서 확인하실 수 있습니다. 빨간색 화살표는 A와 B에 그대로 단말에 대한 축삭과 축삭 터미널 사이의 교차점의 위치를 지적했다. 빨간색 점선은 MB 바이폴라 셀 단말기의 윤곽을 지적했다. (DF). 손상 축삭 (D), 부분적으로 절단 축삭 (E), 또는 완전히 제거 축삭 (F)와 MB 바이폴라 셀 단말기의 형광 이미지. 알렉사 555 (A20501MP, Invitrogen) 형광 색소는 사전 녹화로 내부 솔루션으로 채워졌다. 즉시 패치 - 클램프 녹음 후, 망막 슬라이스는 인산 버퍼 솔루션 4 % (wt / 권) paraformaldehyde (P6148, 시그마) (70,013, GIBCO)로 이전하고 30 incubated되었습니다분. 슬라이스는 변색 방지 에이전트 (Biomeda 법인)과 수성 장착 매체 Superfrost 슬라이드 (피셔 과학)에 탑재되었습니다. 알렉사 555 포함 MB 바이폴라 전지 단말기는 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 (LSM 710, 칼 자이스 혈구)에 40x 물 침지 목표를 사용하여 555 nm의 레이저 라인 (적색)와 조회되었습니다. 축삭 터미널 (파란색 화살표)에서 튀어나온 작은 telodendria의 appendages의 존재를합니다. 스케일 바는 10 μm의를 (- F) 나타냅니다. INL : 내부 핵 계층, IPL : 내부 plexiform 층, GCL : 신경절 세포 계층.
그림 2. axotomized하고 그대로 MB 바이폴라 셀 단말기의 전기적 특성. -70 MV로 -60 MV의 유지 가능성에서 전압 클램프 단계 hyperpolarization에 의해 활성화 (A, C) 과도 전류 응답. -10 MV 전압 클램프 단계로 짧은 전류 응답이 발생할 수 있습니다 : 1) 단일 빠른 지수 현재 axotomized 터미널을 나타내는 -70 MV (높은 입력 저항과 부패, 패널) 또는 2) -70 MV (지표에서 낮은 입력 저항과 이중 지수 감쇠 손상 터미널, 패널 C는;) 12, 14, 15도 참조하십시오. (B, D) 칼슘 2 + 전류와 막 커패시턴스 점프는 -70에서 0 뮤직 비디오로 단계 탈분극에 의해 evoked했다. 시간 해결 막 커패시턴스 측정 -70 뮤직 비디오 6 쉬고 개최 가능성에 겹쳐 2 kHz에서 sinewave 자극을 사용합니다. 붉은 추적은 커패시턴스 데이터 포인트의 평균 가치입니다. 그림 2B와 2D의 커패시턴스 점프는 모두 약 200 FF와 동일하다는 점을 염두에 두십시오.
그림 3. 카 2 직접 측정 + 영상 신호, exocytosis, 그리고 M에서 억제 의견B 바이폴라 전지 단자. (A) 칼슘 2 일시적인 상승은 MB 단말기의 telodendria에 + 농도는 200 MS (화살표)를 -70에서 0 MV하는 전압 클램프 단계 탈분극에 의해 활성화되었다. 오레곤 그린 488 BAPTA - 1 (100 μm의), 칼슘 2 + 지표 염료는 패치 피펫에 포함되었습니다. MB telodendria (빨간색 점선으로 표시 관심 지역)의 (B) 대응 형광 이미지. 신경 전달 물질 릴리스 (exocytosis)의 (C) 단기 시냅스 우울증. 0 MV (200 MS 간 펄스 간격 상단 추적) 20 석사 depolarizations 한 켤레에 의해 evoked 칼슘 2 + 전류 (중간 추적)와 막 커패시턴스 (하단 추적). 화살표는 칼슘 2 exocytosed 양자 효과 + 현재와도 인접 세포 amacrine 15 21 GABAergic 상호 피드백 억제. 나타냅니다 그 칼슘 2 양성자 - 중재 억제가 + 현재와 또한 놀았어 참고Aergic 상호 피드백 억제는 또한 시냅스 vesicles의 exocytosis에 의한 커패시턴스 점프가 최초 depolarizing 응답에 존재한다.
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Discussion
우리의 프로토콜에서 중요하고 어려운 단계는 한천 용액 (3.4 프로토콜)에 망막의 작품의 전송이다. 그것은 조심스럽게 망막 조각에서 유리체 유머와 잔여 슬라이스 솔루션을 제거하고 왜곡이나 굴곡없이 전송하는 것이 필요합니다. 이것을 달성하기 위해, 우리는 제보가 망막을 위치에 직각 팁 포셉 (11251-35, 파인 과학 도구)와 함께, 90 ° 각도를 형성하기 위해 구부리고 작은 주걱을 (21-401 - 25B, Fisherbrand)을 사용 슬라이스 솔루션의 전송 과정에서 조각. 망막 슬라이스와 주걱에 잔류 슬라이스 솔루션은 접혀 또는 압연 Kimwipes (킴벌리 클락)의 모서리와 표면의주의 dabbing하여 제거할 수 있습니다.
가로 망막 조각을 준비하는 또 다른 일반적인 방법은 필터 종이 기반 프로토콜 23입니다. 간단히, 전체 망막의 반전 부분은 Millipore 필터 디스크의 사각형 조각 (신경절 세포가 누워에 첨부되어 있습니다필터 종이에 대한 어, photoreceptor 층이 기계를 위로 향하게) 및 수동 세로 "엄지"와 250 μm의 두께로 슬라이스 컷 (예 : Narishige ST - 20). 우리는 필터 종이 기반 프로토콜의 장점은 건강 photoreceptors과 그대로 MB 터미널에 axotomized의 증가 비율을 포함 것을 발견했습니다. 우리는 따라서 망막 조각에 포함된 단일 MB 터미널에서 가벼운 evoked 반응을 이끌어내는이 필터 종이 메서드를 사용합니다.
필터 종이 기반 프로토콜을 통해 우리 한천 기반 프로토콜의 장점은 1) 생산 망막 슬라이스도, 평면이라고하고, 어떤 내면의 핵 계층이나 망막 plexiform 계층의 패치 수 망막 레이어 사이에 명확한 분리로 상대적으로 피해가 원하는이며, 2) immunohistochemistry 다음 electrophysiological 녹음이 때문에 슬라이스의 손상 및 평면 기하학 이상 (1) 항목에서 언급된 요인보다 쉽게 수행됩니다 셀. 가벼운 응답을 녹음 프로토콜한천 기반 준비 망막 뉴런의 일부는 이전에 다음 ID로 주피터 2로 출판 되었음. 한천 및 필터 종이 기술의 조합을 사용 수평 망막 슬라이스 준비도 이전 주피터 5로 출판 되었음. 우리는 서로 다른 기술을 비교하는 자체와 함께이 비디오를 시청하는 것이 좋습니다.
척추 망막 조각에 리본 타입의 presynaptic 터미널에 직접 접근은 우리가 리본 타입의 활성 영역에서 시냅스 전송을 조사 수 있습니다. 그것은 또한 우리가 직접 망막 microcircuits의 신경 생리를 연구 할 수 있습니다. 이 기술은 억제 amacrine 세포를 포함하고 신경절 세포 1, 16, 10 탔지 postsynaptic 파트너와 함께, 사전 및 사후 신경 신호의 이점 녹음에 특히 유용합니다. 쥐 달팽이 내부 세포와 수입 성의 dendrites 사이에 리본 타입의 시냅스에서 이점 녹음이 가능하며 7 설명했습니다. 칼슘 imagiMB 바이폴라 셀 단말기의 NG가 심하게 dissociated 세포 8과 망막 조각 17,뿐만 아니라 금붕어 amacrine 세포 3로 수행되었습니다. 최근 연구 생체내 및 유전자 변형 zebrafish의 망막 4 체외 optogenetic 접근에 대한 큰 개선을 보여주었다. 미래의 방향은 가능성이 우리가 행동 연구 궁극적으로 선도, 체외의 슬라이스 녹음 및 생체내 이미징의 사이의 격차를 다리 수 electrophysiological 방법, 함께, 이러한 유전자 변형 기술을 포함합니다.
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Disclosures
우리는 공개 경쟁 관심이 없습니다.
Acknowledgments
우리가 실험실에서 프로토콜을 사용하여 시작할 때 우리는 한천 - 임베디드 망막 슬라이스 준비 그의 종류 설명 박사 프레드 Rieke 감사합니다. 우리는 또한 도식 개요 및 Drs의 그림에 대한 로리 Vaskalis 주셔서 감사합니다. 텍스트 및 비디오에 도움이 덧글에 대한 Veeramuthu Balakrishnan과 Soyoun 조. 이 작품은 네이 - NIH RO1 교부금에 의해 지원되었고, 또한 부분적으로 한국 정부에 의해 자금을 한국 학술 진흥 재단 그랜트에 의해 지원되었다 [KRF - 2008-357 - E00032].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low gelling-temperature agar | Sigma-Aldrich | A0701 | Agarose type VII-A |
| Patch pipette | World Precision Instruments, Inc. | 1B150F-4 | Thick-walled (1.5 mm outer diameter) borosilicate glass |
| Vertical puller | Narishige International | PP830 | |
| Dental wax | Cavex | ||
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| 45° angled fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Razor blade | Personna Medical Care | Double-edged, cleaned with 70% ethanol and H2O | |
| Cylindrical tube | Fisher Scientific | 03-338-1B | Polyethylene sample vials 2.5 ml |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H6254 | |
| Vibratome slicer | Leica Microsystems | VT1000S or VT1200S | |
| Upright microscope | Olympus Corporation | BX51WI | |
| 60x water-immersion objective | Olympus Corporation | LUMPlanFl | NA 0.90 |
| CCD camera | Sony Corporation | XC-75 | |
| Camera controller | Hamamatsu Corp. | C2400 | |
| Monitor | Sony Corporation | 13” black and white monitor | |
| Syringe filter | Nalge Nunc international | 0.2 μm | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument Co. | MPC-200 | |
| Lock-in amplifier | HEKA Instruments | EPC-9/10 amplifiers have software emulation | |
| Spinning disk laser confocal microscope | Yokogawa | CSU-X1 | Live cell imaging after patch clamp whole cell recording |
| Slidebook software | Intelligent Imaging Instruments (3i) | Imaging data acquisition and analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Phosphate buffer solution | GIBCO, by Life Technologies | 70013 | |
| Superfrost slide | Fisher Scientific | Slide glass | |
| Anti-fading agents | Biomeda corp. | ||
| Confocal laser-scanning microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 710 | Imaging of fixed tissue |
| Spatula | Fisher Scientific | 21-401-25B | |
| Manuel vertical slicer | Narishige International | ST-20 | |
| Oregon Green 488 BAPTA-1 | Invitrogen | O-6806 | Ca2+ sensitive fluorescent dye |
| Alexa Fluor 555 Hydrazide | Invitrogen | A-20501MP | Fluorescent dye |
References
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