Summary
Sluipwesp (parasitaire) wespen vormen een belangrijke klasse van natuurlijke vijanden van veel insecten waaronder
Protocol
De gehele protocol voor het experiment is verdeeld in vier stappen (Fig. 9). (1) Het kweken van wespen op larven, (2) Het opzetten van infecties en het voorbereiden van dieren voor dissectie, (3) isoleren en tot vaststelling van gastheer / parasiet structuren, (4) Het analyseren van het immuunsysteem weefsels.
1. Het kweken van Wespen op Drosophila Larven
Onderhoud van wesp culturen vereist een zorgvuldige planning. Ten opzichte van groeiende vliegen, het is vrij arbeidsintensief. Wij handhaven onze wesp kolonies in het laboratorium op larven of poppen van de yw stam van Drosophila bij 24 ° C. Het kweken van wespen houdt het bijhouden van een continue bron van hosts op het juiste moment en het opruimen van de "besmette" flacons van vliegen die ontstaan voor de wespen doen. Wespen volgen de haplodiploid methode van geslachtsbepaling en het is daarom belangrijk dat de vrouwtjes zijn gedekt voordat ze infecteren de gastheren.
- Op dag 1, voeg een klein beetje van vers prevergeleken gist pasta (gemaakt door mengen van 1 ml water in ongeveer 1 g actieve droge gist in een verse voeding vlieg flacon Recept van het vlieg voedsel is niet kritisch. we groeien vliegen de corn-meal/sucrose/agar medium. Plaats 50-60 jonge (2-4 dagen oud) volwassen yw (of een ander wezen wild-type stam) vliegt om eieren te leggen gedurende 48 uur bij 24 ° C.
- Op dag 3, verwijder de vliegen van de flacons. Plaats een buzz stekker van de flacon met een druppel honing aan de binnenzijde van de buzz stekker. Honing wordt verdund 2:1 in gedestilleerd water.
- Met behulp van CO 2, verdoven van de wespen en sorteren 6-8 en 6-8 vrouwtjes mannetjes die zijn ongeveer 2-3 dagen oud. Voeg ze toe aan de flacon met 0-48 uur oude gastheren. Merk op dat wespen zijn gevoeliger voor CO 2 dan vliegen, en je kan hebben om hun blootstelling aan het gas te kalibreren. Drosophila onderzoekers niet een standaard Drosophila verdoving station ontwerp te gebruiken. Een goed uitgangspunt om wespen verdoven is het instellen van de CO 2-druktot ongeveer de helft van wat nodig is voor verlamming vliegen.
- Vervang de buzz stekker (met honing) op de flacon. Plaats voorzichtig de flacon op zijn kant tot aan de wespen wakker.
- Plaats deze flacons met larven en wespen in een 24 ° C incubator.
- Succesvolle infecties lichtjes vertragen verpopping. Hosts die hebben geleden onder wesp aanval, maar zijn in staat om zichzelf te verdedigen (of als ze niet besmet zijn), gaat u verder de ontwikkeling volgen van de normale werktijd en volwassen vliegen komen uit deze puparia ruim voor de wespen.
- Afhankelijk van de soorten sluipwespen en de temperatuur, wespen Eclose in 25-30 dagen.
- Verwijder de volwassen vliegen uit de flacons waar wespen zich ontwikkelen.
2. Het opzetten van Infecties en voorbereiden Besmette dieren voor Dissection
Voordat u begint, hebben een paar schoon glas of plastic petrischalen, een Pyrex ontleden schaal met 9 depressies, Kimwipes, gedestilleerd water (in een spuit fles), 70% ethanol (in een spuit fles), 1X PBS (in een spuit fles), microscoop dia's en een kleine, schone spatel handig.
- Voor het instellen van infecties, volgt u de stappen 1-5 hierboven. Afhankelijk van de proef, kan het nodig zijn gastheren die ongeveer gelijk ontwikkelingsstadium gebruiken. Hiervoor kan egglays van 2-6 uur worden gebruikt voor infectie.
- Om geïnfecteerde larven (voor dissecties van het immuunsysteem van weefsels of parasieten) te oogsten, verwijder de inhoud van de vlieg injectieflacons in een kleine glazen of plastic petrischaal.
- Met behulp van een stereomicroscoop en fijn pincet (pincet), zorgvuldig kiezen 6-10 larven, een voor een en ze in een depressie goed te plaatsen met 1X PBS eerst, dan de over te dragen in het water, 70% ethanol, water en 1X PBS, achtereenvolgens. Het doel van deze stappen is de dieren van de vlieg voedsel vrij grondig reinigen en steriliseren hun oppervlak. De spoelen in water verdunt de ethanol en de laatste spoeling in PBS verwijdert de ethanol. Voor Stap 3 hieronder, is het best niet te verlatendieren in PBS langer dan 10 minuten.
3. Isoleren en oplossen Host / parasiet Structuren
Achtergrond
De larvale lymfeklier is een klein hematopoietische orgel 7. Op het derde larvale instar de lymfeklier bevat een groot paar voorste lobben flank de dorsale vat (Fig. 3A, 6B-C, 7A-D). De voorste kwabben zijn verder verdeeld in gespecialiseerde gebieden met unieke eigenschappen van een cel 7. Voorlopers van drie celtypen, plasmatocytes, lamellocytes, en kristal cellen bevinden zich in de voorste kwabben. Pericardiale cellen te scheiden van de voorste lobben van de kleinere achterste lobben. De Drosophila lymfeklier is een model voor insecten en zoogdieren hematopoiese 8,9.
Vet lichaam is functioneel gelijk aan het zoogdier lever. De humorale reactie wordt geactiveerd in het vet lichaam volgende microbiële of wesp infectie 1,4,10. AlsHierdoor wordt een unieke combinatie van antimicrobiële peptiden genen die worden geactiveerd en de peptiden worden uitgescheiden in de hemolymfe 1. Het vet lichaam is ook de primaire weefsel voor glycogeen en triglyceride productie en opslag 11. De larvale dikke lichaam neemt grote hoeveelheden van het hemocoel en dus in tegenstelling tot de lymfeklier, is het gemakkelijk te lokaliseren. We zullen nu laten zien hoe je de lymfe klier en het vet lichaam uit derde larvenstadium larven ontleden.
Voordat u begint
Need fijn pincet (pincet) en ethanol-gereinigd microscoop dia's.
Larvale lymfeklier dissectie
- Met behulp van fijne tang, selecteert u een zwervend derde instar larve bewaard in 1X PBS.
- Plaats de larve op een microscoopglaasje.
- Behulp van een tang, het dier tot stand met de buikzijde.
- Met behulp van twee paar tang houden het dier aan weerszijden van het achterste einde (pijlen 1 Fig. 3A) en gently trek de nagelriem naar een kleine, oppervlakkige scheur in de cuticula te introduceren.
- De hemolymfe met hemocytes, darm, en vet lichaam zal beginnen te ontsnappen aan de lichaamsholte. De hemolymfe kan worden met een 10 pi "pipetteman" te vegen maken, indien nodig.
- Het plaatsen van zowel pincet aan de rechterkant van het dier onder de mond haken (pijlpunten 2, Fig. 3A), Trek de cuticula.
- Schuif beide een tang om de linkerkant van het dier onder de mond haken (pijlpunten 2, Fig. 3A) en voorzichtig maak een andere kleine traan.
- Terwijl de mond haken van het dier, trek de cuticula naar beneden naar de achterkant einde van het dier (alsof peeling het terug).
- Omdat de opperhuid wordt teruggetrokken, zullen de hersenen, vet lichaam, verbeelding schijven, speekselklieren, en proventriculus worden blootgesteld. De vrijstaande cuticula is nu aan het achterste einde, maar zal nog steeds de dorsale vat met de lymfeklier die eraan verbonden zijn. </ Li>
- Snijd de proventriculus en verplaats het weg van de lymfeklier gebied. De lymfeklier zal zijn onder de hersenen, ook al ben je niet in staat zijn om het te zien.
- Voorzichtig los te maken van de dikke lichaam, darmen, speekselklieren, en andere structuren die kunnen worden zittend op de klier. Wees voorzichtig dat u de lymfeklier los te maken van de ring klier en de dorsale schip gelegen achterste naar de hersenen. De lymfeklier zal worden gepositioneerd plat tegen de microscoopglaasje.
- Voorzichtig weg Verwijder alle extra weefsels van de lymfeklier totdat de gehele klier zich ontvouwt uit de voorste lobben van de laatste set van de pericardiale cellen.
Opmerking: Een goed ontleed lymfeklier zal een paar van de voorste lobben en twee sets van de achterste lobben langs de dorsale vat (Fig. 6B) hebben. De lobben kunnen gemakkelijk worden beschadigd of kunnen afvallen uit de dorsale vat. De monsters dienen derhalve te worden behandeld met grote zorg. De klier ook hals een neiging om verschrompelen of contract. Voorzichtig strekken van het orgel op zijn achterste einde maakt voor alle onderdelen en cellen om goed te worden gepresenteerd. Dit is vooral nodig om de immunokleuring protocollen.
Fay lichaam dissectie
- Op het ontleden fase van de Zeiss 1000 stereomicroscoop (elke stereo ontleden microscoop kan worden gebruikt), plaats een lichtbak die het mogelijk maakt invallend licht te worden doorgegeven via het monster. Plaats een Larve larve uit stap 2 op een microscoopglaasje in 200 ul PBS 1X. Afstand kantelen de lichtbron van het monster, zodat het organisme weergegeven transparant en dus eenvoudig om de interne organen te visualiseren.
- Met behulp van een tang, de positie van het dier, zodat het voorste einde is van je af.
- Met behulp van een tang, houdt u de cuticula van de larve aan de linkerkant van zijn mond haken (pijlpunt 1, Afb. 3B). Met behulp van de andere tang, Trek de nagelriem helemaal tot aan het achterste einde (arrowhead 2, afb. 3B). Niet weg te scheuren de cuticula van het lichaam op het achterste einde.
- Heel voorzichtig beginnen met het verwijderen van de darm naar een kant.
- Verwijder de hersenen, verbeelding schijven, en de ring klier met de lymfeklier die door de dorsale vat.
- Verwijder de speekselklieren, omdat er dikke lichaam vast te houden aan deze klieren.
- Verwijder voorzichtig de nagelriem en laat het vet het lichaam op de dia in 1X PBS.
Opmerking 1: de dikke lichaam slechts een cel laag en het is daarom belangrijk om alle cellen afgevlakt in hetzelfde vlak op het glaasje. Cellen zijn endopolyploid en gemakkelijk te visualiseren. Een goed ontleed dikke lichaam monster moet de handhaving van normale cel contacten en dienen over een minimale vetbolletjes rond de ontleed monster (afb. 6I, J).
Opmerking 2: Als wesp eieren blijven onaangetast door de gastheer immuunsysteem, ze zullen initiërene ontwikkeling vrijwel onmiddellijk. Vroege ontwikkelingsstadia van de parasiet (van de host-larve) zijn gemakkelijk bereikbaar vanaf de ontleed hemocoel (fig. 8). Parasite eieren of larven of zich te houden aan het vet lichaam of andere organen, of gewoon op de glazen schuif glijden tijdens de dissectie.
4. Het analyseren van Immune weefsels
- Drogen aan de lucht lymfeklieren gedurende 5-10 minuten en verwijder 1X PBS uit het vet lichaam slide voordat tot vaststelling, voor 5-10 minuten met 4% paraformaldehyde bereid in PBS. Elke dia kan meerdere ontleed lymfeklieren voor de kleuring. Verplaats dia's met de vaste monsters in een zelfgemaakte bevochtigde kamer voor volgende stappen. Deze kamer wordt bereid door twee stukken gevouwen vochtige papieren handdoekjes onderaan een lege plastic micropipet tip box. Een of meer dia van monsters kan worden geplaatst boven de verdeler gebruikt voor het houden van de uiteinden.
- Als zodanig is de analyse van het immuunsysteem weefsels plaats volgens standaard methoden diecombineren in vivo cel etikettering en de indirecte immunohistochemie 4.
5. Representatieve resultaten
- Wasp infectie activeert expressie van de Toll pad reporter Drosomycin-GFP (Fig. 6G, J). In dit experiment wordt het effect van wespen-besmetting op genexpressie gevisualiseerd in vivo in een GFP-reporter verbonden met de Drs promoter 12. In niet-geïnfecteerde controle dieren, wordt het GFP-expressie niet gedetecteerd. De GFP signaal duidelijk waargenomen in het cytoplasma en de kern van de cellen van het vet lichaam ontleed van dieren geïnfecteerd met L. victoriae. Om de beste resultaten, de verhouding van wespen te verkrijgen: hosts moet zijn 1:10. De infectie duurt minstens 2 uur. Bericht besmetting, de Drs-GFP signaal intensiveert en vele dikke lichaam cellen GFP-positieve, zelfs tot 72 uur 1,4.
- Wasp infectie leidt tot differentiatie van lamellocytes in de lymph klier (Fig. 6D). Lamellocytes omsingelen en te blokkeren wesp ontwikkeling (afb. 6H). Lymfeklieren worden ontleed om zo de cellulaire veranderingen teweeggebracht in de voorste kwabben na L. visualiseren victoriae infectie. Nieuw-gesplitste lamellocytes aanwezig zijn in de periferie van de ontleed lobben; lamellocytes zijn gemarkeerd met een GFP transgen dat wordt gedreven door de misvormde versterker (MSNF9-GFP). Alle cellen worden gevisualiseerd met behulp van filamenteuze actine rhodamine-gelabeld phalloidin. Merk op dat de integriteit van de voorste lobben wordt verstoord deze klieren de basaalmembraan die normaal rond de nok continu (Fig. 6C) nu discontinue (Fig. 6D). Uit dezelfde secties kan lamellocytes in de hemolymfe ook zichtbaar in uitstrijkjes (Fig. 6G), waarvan sommige worden geassocieerd met de capsule structuur gevormd parasiet ontwikkeling (Fig. 6H) te blokkeren.
- Spätzle eiwit wordt uitgedrukt in de meeste cellen van de larvale lymfeklier (Fig. 7C, D). Om SPZ op te sporen in de ontleed lymfeklieren, volgden we een standaard protocol voor het kleuren van cellen van de lymfeklier met polyklonaal anti-SPZ antilichamen 4. In vivo, SPZ niveaus stijging van de lymfeklier cellen na wesp infectie (panelen Fig vergelijken. 7C, E met 7G, I, en panelen 7D, F met 7H, J).
- Vroege en late stadia van wesp ontwikkeling van de host larven en poppen (fig. 8). Om ontwikkelingsstadia van wespen te onderzoeken, worden geïnfecteerde larven ontleed op verschillende tijdstippen na ovipositie. Hier laten we een steekproef van deze fasen van Leptopilina spp. Van een besmet wild-type D. melanogaster gastheren.
Figuur 1. Verschillende soorten sluipwespen en ovipositie van de wesp ei. Alle beelden werden verkregen met behulp van een Leica stereomicroscoop. Een Trichopria drosophilae vrouwelijke wesp oviposits ei in een D. melanogaster pop. B Vergroting van ovipositie van Trichopria drosophilae in de host-pop. C gemelanizeerd plekken geven de wondgenezing op de site van ovipositie. D L. boulardi man. E G. xanthopoda vrouw. F L. victoriae vrouw. G L. Heterotoma mannelijke (links) en vrouwen.
Figuur 2. Levenscycli die de vlieg / wesp wapenwedloop. Ovipositie resulteert in een van de twee uitkomsten. Op de host immuunreacties te slagen aan de ontwikkeling van de wesp (links), of de wesp te blokkeren dwarsboomt de gastheer immuun responsnses en slaagt (rechts). Gewijzigd ten opzichte van Melk en Govind, 1999 18.
Figuur 3. Derde instar larven met de organen van belang voorafgaand aan de dissectie. Alle beelden werden verkregen met behulp van een Leica stereomicroscoop. Een HML> GFP larve met GFP (groen) fluorescentie (pijl) in individuele cellen van de lymfeklier de algemene locatie van de lymfeklier geeft aan in een intacte dier. De larve werd afgebeeld met fluorescentie en helderveld optica. Pijlpunten wijzen plaatsen van belang voor de lymfeklier dissectie protocol beschreven in de tekst. B Cg> GFP larve met GFP expressie in de dikke lichaam naar de locatie van het orgel in een intacte Anim gevenal. Pijlpunten wijzen plaatsen belangrijk voor het vet lichaam ontleding protocol beschreven in de tekst.
Figuur 4. Immuno-genetisch circuit van gastheer immuunrespons tegen sluipwesp aanvallen. Belangrijkste onderdelen van het Toll route worden weergegeven. Spätzle (SPZ) wordt geactiveerd door het protease Spätzle verwerking enzym, SPE. Geactiveerde SPZ dient als ligand voor tol. Intracellulaire signalering leidt tot de activering van NF-kB transcriptiefactoren, rug-en Dif. Cactus dient als IκB remmer van het pad. Activering van Drosomycin, een canonieke Toll pad target-gen, kan worden gecontroleerd met behulp van transgene vlieg stammen met het GFP-reporter (zie Fig. 6I, J).
Figuur 5. Inkapseling in reactie op L. victoriae besmetting inSerpent> GFP-dl Drosophila hosts. Een versterker in de Slang gen tot expressie komt in bloedcellen 13. Wanneer deze versterker de expressie van het GFP-Dorsal fusie-eiwit in een transgen aandrijft, dorsale gedetecteerd via het groene fluorescentie van GFP in sommige plasmatocytes en lamellocytes die het capsules en aggregaten. Alle beelden werden verkregen met een Zeiss LSM confocale microscoop. Een ei van L. victoriae. BD Lamellocytes (witte pijlen) op het achterste eind van het ei uitdrukkelijke GFP-Dorsale. CD een vergroting van het monster in paneel B. EH Monsters worden tegengekleurd met rhodamine-gelabelde phalloidin om filamenteuze actine (F-actine, rood) te visualiseren en met Hoechst 33258 tot DNA (blauw). E Encapsulated ei van L. te visualiseren victoriae. F gemelanizeerd capsule van L. victoriae. GH L. victoriae infectie induceert bloedcellen (plasmatocyte en lamellocyte) aggregatie.
Figuur 6. Immuunrespons tegen wesp infectie. Afbeeldingen in panelen A en B werden verkregen met behulp van een Zeiss Axio Scope. Afbeeldingen in panelen CJ werden verkregen met behulp van een Zeiss LSM confocale microscoop. Een Host larve met gemelanizeerd ingekapselde wesp ei (pijlpunt) door de transparante cuticula. B Vertegenwoordiger derde instar larvale lymfeklier gekleurd met Hoechst 33258 onthult cellen van alle kwabben en afgewisseld pericardiale cellen. Schaal bar is 100 μ. CJ Alle monsters werden tegengekleurd met Hoechst 33258 (tot label kernen) en rhodamine phalloidin (tot F-actine-label). CD Anterior lymfeklier lobben van de controle (C) en L. victoriae-geïnfecteerde (D) MSNF9-GFP dieren. In besmette dieren, MSNF enhancer expressie, die specifiek zijn voor lamellocytes 14 wordt gedetecteerd met een nucleaire GFP reporter. E Plasmatocytes geïsoleerd van niet-geïnfecteerde dieren niet GFP uit te drukken. Deze dieren hebben zeer weinig of geen lamellocytes. F Plasmatocytes (GFP-negatieve, korte pijl) en nieuw-gesplitste, grotere lamellocytes (lange pijlen) met zwakke nucleaire GFP expressie van L. victoriae-geïnfecteerde MSNF9-GFP larve. G Gratis en geaggregeerde plasmatocytes en lamellocytes van de hemocoel van een L. victoriae-geïnfecteerde Drs-GFP larve. Expressie van het DRS-GFP reporter wordt geactiveerd in sommige plasmatocytes (korte pijl), maar niet in lamellocytes (lange pijlen) na de infectie. H ingekapseld en gemelanizeerd wesp larve van L. boulardi-infectie MSNF9-GFP gastheer larve. Talrijke MSNF9-GFP-positieve lamelloctyes rond de wesp larve (donkere structuur; dikke pijl) en vertonen sterke nucleaire GFP-expressie (lange pijlen). Deze panel eerder gepubliceerd in PLoS One 15. IJ Fat lichaamscellen ontleed van niet-geïnfecteerde (I) en L. victoriae-geïnfecteerde (J) Drs-GFP larve. GFP is nucleaire en cytoplasmatische in vet lichaamscellen van besmette dieren. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 7. Spätzle expressie na sluipwesp infectie. AJ Monsters werden tegengekleurd met Hoechst 33258 om DNA te visualiseren. Alle beelden werden verkregen met een Zeiss LSM confocale microscoop. AF Anterior lobben ontleed uit ongeïnfecteerde yw larven. Monsters werden behandeld voor indirecte immuno zonder primaire antilichaam (A en B) of anti-SPZ antilichaam (rood, C, D, E, F) en tegengekleurd met Alexa Meel-phalloidin labelen F-actine in cellen (groen;. B, D, F) GJ Anterior lobben ontleed van geïnfecteerde yw larven en gekleurd met anti-SPZ antilichaam (rood, G, H, I, J) en Alexa Fluor-phalloidin (groen;. Panelen H, J) EF Hogere vergrotingen van monsters C en D. IJ een vergroting van de monsters in G en H, respectievelijk. Schaal bars in panelen AD, G, H vertegenwoordigen 50 um.
Figuur 8. Larvale en popstadium stadia van L. Heterotoma en L. boulardi. afzonderlijke fases werden geïsoleerd uit larven of pop fly gastheren na de besmetting, zoals aangegeven. Alle beelden werden verkregen met behulp van een Zeiss Axio Scope. Bovenste rij AF L. Heterotoma stadia, 1-6 dagen na infectie. Onderste rij AF Postembryonic L. boulardi fasen 4 tot 12 dagen na infectie.
Figuur 9. Stroomschema van de experimentele protocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De belangstelling voor sluipwespen van Drosophila is stijgende als moleculaire technieken voor het hele genoom te decoderen efficiënt en kosteneffectief. Echter, ten opzichte van hun uitzonderlijk goed bestudeerde gastheren, vele fascinerende aspecten van de biologie wesp blijft onduidelijk. Deze omvatten kwesties in verband met bereik, onderdrukking van het immuunsysteem, superparasitering, en het gedrag te hosten. De focus van deze presentatie was om de effecten van de infectie aan te tonen op het immuunsysteem van de vlieg weefsels. De ontleding technieken gedemonstreerd kan worden gebruikt voor de analyse van de genexpressie op het RNA niveau (in situ hybridisatie), of extractie van nucleïnezuur microarrays of PCR, of Western analyse van eiwitten. Een grote verscheidenheid aan vlieg stammen zijn verkrijgbaar bij de voorraad en individuele onderzoekslaboratoria te manipuleren en te labelen immuuncellen. De keuze van vlieg stammen wordt bepaald door de experimentele vragen. Deze ontleding technieken kunnen worden gebruikt voor de analyse van immuneweefsels van andere soorten Drosophila.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
We zijn dankbaar aan Prof Todd Schlenke voor Trichopria drosophilae, prof. dr. Tony IP voor transgene vlieg stammen, en prof. dr. Carl Hashimoto voor anti-Spätzle antilichamen. Wij danken heden en verleden leden van het lab voor hun bijdrage aan deze presentatie. Dit werk werd ondersteund door de volgende subsidies: van NIH (S06 GM08168, RISE 41399-009, en de G12-RR03060), USDA (NRI / USDA CSREES 2006 tot 03817 en 2009-35302-05277) en PSC-CUNY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast | Fisher Scientific | S80245-3 | Active Dry |
| Fly Food | Home made | Corn meal, sugar | Standard |
| Honey | Dutch Gold | From the store | Clover |
| Vials | Fisher Scientific | AS514 | |
| Cotton plug/Foam stopper | Fisher Scientific | 14-127-40A | |
| Spatula | Fisher Scientific | 21-401-15 | |
| Pyrex dissecting dish | Fisher Scientific | 50-930-382 | 9-well |
| Microscope slides pre-cleaned | Fisher Scientific | 7101 | 25.4 mm x 76.2 mm |
| Glass coverslips | Pearl | D12544 | 22 x 50 |
| Glass coverslips | Pearl | G12544 | 22 x 60 |
| Pasteur Pipette | J H Berge | 71-5200-05 | |
| 100 mm Tweezers | Sigma-Aldrich | T-4662 | Style # 5 |
| Wash Bottle | Fisher Scientific | 03-409-22A | Fisherbrand |
| Kim Wipess | Fisher Scientific | 34155 | Kimberly Clark |
| Paper Towel | Fisher Scientific | Fisher X-101-C | 1/8 x 13 1/8 in. |
| Leica stereomicroscope | Empire Imaging Systems, INC. | 10446208 | MZFLIII |
| Zeiss Stereomicroscope | Carl Zeiss, Inc. | 000000-1006-126 | "Stemi" 1000 or 2000-C |
| Light Source -LED Gooseneck illuminator | Fisher Scientific | 12563501 | |
| Stage | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Zeiss Laser 510 Scanning Confocal Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Incubator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 815 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Salt Solution 1X | Fisher Scientific | MT-21-030-CM Mediatech | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 64-17-5 | 99.5 % |
| Formaldehyde (37% w/w) | Fisher Scientific | F79-1 | |
| H–chst 33258 | Molecular Probes, Life Technologies | H-1398 | 0.2 μg/ml Excitation 352 nm; Emission 461 nm |
| Rhodamine phalloidin | Molecular Probes, Life Technologies | R415 | 200 units/ml (6.6 μM) Excitation 546 nm; Emission 565 nm |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Molecular Probes, Life Technologies | A22289 | Excitation 495 nm; Emission 518 nm 300 units/ml |
| CO2 tank | TW Smith | ||
| Anti-Spz antibody | Gift Dr. C. Hashimoto (Yale) | ||
| Secondary antibody TRITC-conjugated donkey anti-rabbit, concentration 1:50. | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | Detected at Excitation 546 nm; Emission 565 nm |
| Antifade | MP Biomedicals | ICN10274790 | 0.08 mg of N-propyl gallate in 20 ml of 50% glycerol in 1X PBS |
| Wasp Strains | Fly Strains | ||
| L. victoriae16 | y w | ||
| L. boulardi 171 | UAS-GFP-Dorsal17 | ||
| L. heterotoma2 | SerpentHemoGal413 | ||
| L. heterotoma 141 | MSNF9-moCherry14 | ||
| Trichopria drosophilae | MSNF-GFP15 | ||
| G. xanthopoda18 | y w Serpent-Gal4 UAS GFP-Dorsal/Basc4 | ||
| y w ; Drosomycin-GFP/CyO y+12 | |||
References
- Schlenke, T. A., Morales, J., Govind, S., Clark, A. G. Contrasting infection strategies in generalist and specialist wasp parasitoids of Drosophila melanogaster. PLoS Pathog. 3, 1486-1501 (2007).
- Chiu, H., Morales, J., Govind, S. Identification and immuno-electron microscopy localization of p40, a protein component of immunosuppressive virus-like particles from Leptopilina heterotoma, a virulent parasitoid wasp of Drosophila. J. Gen. Virol. 87, 461-470 (2006).
- Gueguen, G., Rajwani, R., Paddibhatla, I., Morales, J., Govind, S. VLPs of Leptopilina boulardi share biogenesis and overall stellate morphology with VLPs of the heterotoma clade. Virus Res. 160, 159-165 (2011).
- Paddibhatla, I., Lee, M. J., Kalamarz, M. E., Ferrarese, R., Govind, S. Role for sumoylation in systemic inflammation and immune homeostasis in Drosophila larvae. PLoS Pathog. 6, e1001234 (2010).
- Sorrentino, R. P., Carton, Y., Govind, S. Cellular immune response to parasite infection in the Drosophila lymph gland is developmentally regulated. Dev. Biol. , 243-265 (2002).
- Sorrentino, R. P., Melk, J. P., Govind, S. Genetic analysis of contributions of dorsal group and JAK-Stat92E pathway genes to larval hemocyte concentration and the egg encapsulation response in Drosophila. Genetics. 166, 1343-1356 (2004).
- Jung, S. H., Evans, C. J., Uemura, C., Banerjee, U. The Drosophila lymph gland as a developmental model of hematopoiesis. Development. 132, 2521-2533 (2005).
- Krzemien, J., Crozatier, M., Vincent, A. Ontogeny of the Drosophila larval hematopoietic organ, hemocyte homeostasis and the dedicated cellular immune response to parasitism. Int. J. Dev. Biol. 54, 1117-1125 (2010).
- Martinez-Agosto, J. A., Mikkola, H. K., Hartenstein, V., Banerjee, U. The hematopoietic stem cell and its niche: a comparative view. Genes Dev. 21, 3044-3060 (2007).
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annu. Rev. Immunol. 25, 697-743 (2007).
- Schlegel, A., Stainier, D. Y. Lessons from "lower" organisms: what worms, flies, and zebrafish can teach us about human energy metabolism. PLoS Genet. 3, e199 (2007).
- Ferrandon, D., Jung, A. C., Criqui, M., Lemaitre, B., Uttenweiler-Joseph, S., Michaut, L., Reichhart, J., Hoffmann, J. A. A drosomycin-GFP reporter transgene reveals a local immune response in Drosophila that is not dependent on the Toll pathway. EMBO J. 17, 1217-1227 (1998).
- Bruckner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C. M., Rorth, P., Perrimon, N. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev. Cell. 7, 73-84 (2004).
- Tokusumi, T., Shoue, D. A., Tokusumi, Y., Stoller, J. R., Schulz, R. A. New hemocyte-specific enhancer-reporter transgenes for the analysis of hematopoiesis in Drosophila. Genesis. 47, 771-774 (2009).
- Tokusumi, T., Sorrentino, R. P., Russell, M., Ferrarese, R., Govind, S., Schulz, R. A. Characterization of a lamellocyte transcriptional enhancer located within the misshapen gene of Drosophila melanogaster. PLoS One. 4, e6429 (2009).
- Morales, J., Chiu, H., Oo, T., Plaza, R., Hoskins, S., Govind, S. Biogenesis, structure, and immune-suppressive effects of virus-like particles of a Drosophila parasitoid, Leptopilina victoriae. J. Insect Physiol. 51, 181-195 (2005).
- Bettencourt, R., Asha, H., Dearolf, C., Ip, Y. T. Hemolymph-dependent and -independent responses in Drosophila immune tissue. J. Cell Biochem. 92, 849-863 (2004).
- Melk, J. P., Govind, S. Developmental analysis of Ganaspis xanthopoda, a larval parasitoid of Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 202, 1885-1896 (1999).
