Summary
재조합 adeno - 관련 바이러스 (rAAVs) 벡터를 위해 점점 중요 해지고 있습니다
Abstract
최근에는 재조합 adeno는 - 관련 바이러스 벡터 (AAV) 동물의 생체내 연구에 대해 점점 더 가치가 있고, 또한 현재 인간 임상 실험에서 테스트되고 있습니다. 야생 형 AAV는 parvoviridae 제품군의 비 병원성 회원 본질적으로 복제 - 결함이다. 광범위한 도입 프로필, 낮은 면역 반응뿐만 아니라 이러한 벡터와 달성 강하고 영구 transgene 표현들을 체외 및 생체내 유전자 전달에 대한 인기와 다양한 도구를 만들었습니다. rAAVs이 쉽고 저렴 실험실에서 생산하고, 자신의 유리한 안전 프로파일에 따라 수, 일반적으로 낮은 안전 등급 부여됩니다. 여기서 우리는 AAV1와 AAV2 모두의 capsid 단백질을 포함하는 키메라 rAAVs의 생산과 titering하는 방법을 설명합니다. 이러한 이른바 키메라 벡터의 사용은 높은 titres 주식 (AAV1)와 정화로 모두 부모 serotypes의 장점을 결합친화성 크로마 토그래피 (AAV2)에 의해. 이러한 AAV의 serotypes 모든 AAV의 serotypes의 연구 최고이며, 개별적으로 광범위한 감염 패턴을했습니다. 여기에서 설명한 키메라 벡터 AAV1과 AAV2의 전염성 속성을해야하기 때문에 신경, 골격 근육, 췌장, 다른 사람 사이에 신장을 포함하여 조직의 넓은 범위를 감염 것으로 기대하실 수 있습니다. 방법은 헤파린 열 정화를 사용하여 여기에 설명된 내용, 방법은 세슘 염화물 기울기 원심 분리를 통해 다른 정화 방법보다 높은 바이러스 titer와 청소기 바이러스 준비를 제공 믿었다. 또한, 우리는 이러한 벡터가 쉽고 빠르게 생산 감염성 입자의 수를 정확하게 읽기를 제공 titered 수있는 방법에 대해 설명합니다.
Protocol
다음과 같은 프로토콜을 요약 보여주기위한 그림 1을 참조하십시오.
안전주의 : 조립 바이러스 입자들과 접촉을 해 왔습니다 모든 자료 Virkon 솔루션 또는 기타 적합한 살균제로 소독해야합니다.
1. 플라스미드 DNA 주식 (~ 2 일)의 준비
- 다음 plasmids는 1이 필요합니다 :
- pRV1 - AAV2 담당자와 모자 시퀀스를 포함
- pH21 - AAV1 담당자와 모자 시퀀스를 포함
- pFdelta6 - 아데노 바이러스 - 헬퍼 플라스미드
- 플라스미드 AAV는 AAV2 포장 신호 (거꾸로 터미널 반복, ITRs) 어귀 재조합 표현 카세트를 포함하는
- pFdelta6이 부분 삭제를 방지하기 위해 Stbl2 유능한 세포 성장해야하지만, pRV1와 pH21는 DH5alpha 유능한 세포의 성장 수 있습니다. 부분 삭제가 DH5alpha 세포에서 발생하는 경우에는 AAV의 plasmids은 Stbl2 세포의 성장 수 있습니다.
- 플라스미드 DNA는 고품질의 RNA 오염 물질의 무료 있어야합니다. Plasmids는 다음과 소화를 사용하여 무결성 검사를 할 수 있습니다 :
- pRV1 - 소화와 XbaI은 7.5 킬로바이트 및 3.8 킬로바이트의 밴드를 제공
- pH21 - EcoRI로 소화 4.5 킬로바이트의 밴드 2.8 킬로바이트 및 0.2 킬로바이트를 제공
- pFdelta6 - HindIII와 소화가 5.5 킬로바이트의 밴드, 3킬로바이트, 3킬로바이트 2.3 킬로바이트 및 1.5 킬로바이트를 제공
2. (- 3 일 2) transfection에 대한 인간의 배아 신장 293 (Hek293) 세포의 준비
- 플레이트이 80% 합류 150cm 다섯 15cm 직경 Nunc 조직 문화 요리에 Hek293 전지 2 flasks. 세포는 70해야 - transfection (약 48 시간이 도금 후) 전에 80% 합류. 10% 소태아 혈청과 100 U / ML 페니실린 / 100 μg / ML 스트렙토 마이신을 포함하는 낮은 포도당 표준 Dulbecco의 수정 독수리 중간 (DMEM)에 문화 세포.
- transfection 전에 3 시간 DMEM을 제거하고 Iscove로 교체의 수정된 Dulbecco의 중간 (IMDM)는 소태아 혈청 5 %를 포함.
3. 바이러스 plasmids의 Transfection (transfection에 대해 ~ 1 시간 부화 3 일)
- 바이러스의 단일 배치 (5 X 15cm 조직 문화 플레이트)에 대한 다음과 같은 준비 :
- 플라스미드 62.5 μg AAV
- 125 μg pFdelta6
- 31.25 μg pRV1
- 31.25 μg pH21
- 1650 μl 2.5 M CaCl 2
- 12 ML DH 2 O
- 50 ML 튜브에 2 급 조직 문화 후드 살균 필터 transfection 혼합물에.
- 솔루션을 vortexing 반면, 신속하게이 X의 HEPES 13 ML을 추가 (산도 7.05) 염분 버퍼. 50 ML 튜브의 뚜껑을 교체하고 15 초 동안 와동로 진행합니다. 일분 45 초 동안 서 떠나 훌륭한 흰색 침전물이 형성됩니다.
- 부드럽게 각 15cm 조직 문화 요리에 transfection 솔루션의 5 ML를 추가합니다. 소용돌이 모양의 접시는 믹스 앤 인큐베이터로 돌아갑니다.
- transfection 후 16시간은 IMDM 미디어를 제거하고 DMEM로 바꿉니다.
4. (2 시간) 세포의 Lysing 및 rAAVs의 수확
- transfection 후 72 시간, 세포 배양 접시에서 미디어를 제거하고 폐기. 모든 폐기물은 Virkon 솔루션 또는 기타 적합한 살균제로 소독 치료를해야합니다.
- 부드럽게 따뜻한 1X 인산염의 세포를 세척 식염수는 (; 산도 7.4 PBS) 버퍼.
- 각 판 25 ML 따뜻한 PBS를 추가하고 부드럽게 세포 스크레이퍼와 세포를 제거합니다. 50 ML 튜브의 중지를 수집합니다.
- 10 분 800 XG에 펠릿 세포.
- NaCl 150 MM, 20 MM 트리스 산도 8.0에서 뜨는 및 resuspend 펠렛을 폐기, 조직 문화 판 당 10 ML을 사용합니다. 이 50 ML 튜브로 가라.
- DH 2 O.에서 10 %의 나트륨 deoxycholate의 새로운 솔루션을 준비 0.5 %의 최종 농도 각 튜브에이 1.25 ML을 추가합니다. ML 당 50 단위의 최종 농도 benzonase nuclease를 추가합니다. 철저하게 튜브를 섞습니다.
- 15 분에 대한 3000 XG에 centrifuging하여 세포 파편을 제거합니다. 신선한 50 ML 관에 전송 모든 세포 부스러기가 (5 단계 참조) 헤파린 열 차단 방지하기 삭제되었습니다 보장합니다. 이 단계에서는 샘플을 계속하기 전에 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. 우리는 감염의 감소없이 -20 ° C에서 몇 주 동안 샘플을 저장합니다.
5. rAAVs의 헤파린 열 정화 (2-3시간)
- 해당 솔루션은 흐름 있도록 5.4 단계 5.2에 대한 분당 1 ML에있는 컬럼을 통해 연동 펌프를 사용하여 설치 HiTrap의 헤파린 열. 기포가가 헤파린 컬럼에 도입되지 않도록하는 것이 중요합니다.
- 10 ML 150 MM NaCl, 20 MM 트리스, 산도 8.0로 컬럼을 평형.
- 칼럼 50 ML 바이러스 솔루션을 적용하고 흐름을 통해 수 있습니다.
- 20 ML 100 MM NaCl, 20 MM 트리스, pH를 8.0로 컬럼을 씻으십시오.
- 5 ML의 주사기를 사용하면 열 w을 씻어 계속한 ML 300 MM NaCl, 20 MM 트리스, 산도 8.0 다음 ith 일 ML 200 MM NaCl, 20 MM 트리스, 산도 8.0,. 흐름을 통해 폐기하십시오.
- 적용하여 열에서 5 ML 주사기와 부드러운 압력 elute 바이러스를 사용 :
- 1.5 ML 400 MM NaCl, 20 MM 트리스, 산도 8.0
- 3.0 ML 450 MM NaCl, 20 MM 트리스, 산도 8.0
- 1.5 ML 500 MM NaCl, 20 MM 트리스, 산도 8.0
- 15 ML의 원심 분리기 튜브에서 이러한를 수집합니다.
6. 농도와 rAAVs의 무균 여과 (1 시간)
- 100,000 분자량의 컷오프와 Amicon 울트라 - 4 원심 필터 유닛을 사용하여 벡터를 집중. 이분 (실온에서) 2000 XG에 농축기와 원심으로 열 eluate 4 ML을로드합니다. 나머지 바이러스 솔루션과 반복 원심 분리와 flowthrough 및 재장전 농축기를 폐기하십시오. 집중 볼륨 약 250 μl해야합니다. 집중 볼륨이보다 훨씬 더 많은 경우, 흐름 T를 폐기hrough는 볼륨이 약 250 μl 때까지 일분 단계에서 원심 분리기를 계속합니다.
- 500 μl의 최종 볼륨 바이러스에 PBS 250 μl를 추가하고 농축기에서 제거합니다.
- 13mm 직경 0.2 μm의 주사기 필터를 통해 필터 벡터. 벡터는 ° C까지 필요한 -80에서 aliquoted하고 저장해야합니다.
7. (3 일간) 바이러스 주식 Titering
이 기자의 유전자 또는 유전자 immunocytochemically 감지 제품을 운전 Hek293 세포에서 활성화되어 발기인이 필요합니다. Hek293 세포는 다른 세포 라인이나 기본 셀 문화가 사용할 수와 호환되지 않습니다 벡터를 제작하는 경우.
- 50% 합류 - 그들이 40되도록 Hek293 세포를 시딩하여 18 폴리 - L - 라이신 코팅 유리 coverslips 또는 Nunc 챔버 슬라이드 18 우물을 준비합니다. Cre - 의존 rAAVs의 적정 위해 안정 표현 Cre recombinase이 Hek293 세포를 사용합니다.
- 시리얼 D 각각 잘 감염AAV 벡터 (그림 2A)의 ilutions. 희석 당 3 우물을 사용합니다. 우리는 일상적으로 각각 물론 직접 바이러스를 추가합니다.
- 72시간은 실온 10 분 (2 % PFA의 최종 농도를주는) 중간에 4 % paraformaldehyde의 동일한 볼륨 (PFA)를 추가하여 Hek293 세포를 수정 후.
- 세포에게 PBS로 세 번 씻어, DH 2 O와 coverslip에 린스.
- 가장 높은 희석 요인을 세 우물에서 transduced 세포의 수를 세어하지만 여전히 감염된 세포를 포함하는 이들의 평균을 찾아 microliter 당 전염성 단위 (그림 2B)의 번호를 가르쳐주기 희석 요소를 기준으로 곱하면됩니다.
8. 예상 결과
Hek293 세포는 향상된 녹색 형광 단백질 (eGFP)가 그림 2B에 표시하는 바이러스 인코딩 transduced. 우리는 일반적으로 마이크로 리터 당 약 6 × 10 6 전염성 입자의 일관성 titers을 얻을 수 있습니다. 우리는 일상적으로 stereotaxic 인제 이러한 벡터를 사용성인 쥐 두뇌에 ction. 이것은 특정 지역과 관련된 유전자 발현 2에 대한 강력한 기술을 제공합니다. 우리가 Cre - 형질 전환 마우스 2 대상 지역으로 Cre recombinase 종속 rAAVs을 주입 셀 타입의 선택적 유전자 발현이 지역의 특이성을 결합합니다. 그림 2C - E는 성인 parvalbumin - Cre 유전자 변형 마우스 3 가지 뇌 영역에 eGFP 인코딩 Cre - 의존 rAAVs의 stereotaxic 주사의 예를 보여줍니다.
그림 1. rAAV 생산을위한 프로토콜의 도식 그림. 1.) Hek293 전지는 도금 및 70 재배 - 80 % 합류합니다. 2.) AAV와 도우미 plasmids은 준비하고 Hek293 세포로 transfected 수 있습니다. 3.) 매체는 transfection 후 DMEM 16시간으로 변경되고 Hek293 세포는 다른 56시간에 대한 양식입니다. 4.) Hek293 세포는 수확 및 lysed 있습니다. rAAV 벡터는 C에 의한 세포의 잔해로부터 분리entrifugation. 5.) 바이러스성 입자 농도 및 살균하기 전에 헤파린 컬럼을 통해 정화됩니다. 6.) Hek293 세포 24 잘 접시에 성장과 전염성 단위의 수를 결정하는 AAV 벡터의 시리얼 dilutions로 감염됩니다.
그림 2. Titering 및 rAAV1 / 2의 생체내 응용 프로그램 인치 바이러스 titer를 측정 Hek293 세포의 (A) 설정. Hek293 세포 rAAVs 일련 dilutions와 transduced 있습니다. C, 감염되지 않은 제어, N, undiluted 바이러스 주식 1 μl. (B) Hek293 세포 eGFP을 표현 rAAVs에 감염. (CE) 바이러스성 eGFP 표현은 제한됩니다 Cre - 표현 Cre가 활성화된 rAAVs의 stereotaxic 주입 후 parvalbumin - Cre 유전자 변형 마우스의 다른 대상 지역에서 뉴런합니다. 예 이미지 (C) 망상 시상 및 globus pallidus에서 GFP의 immunoreactivity를 보여, (D) 이가있는 이랑과 해마의 (E) CA1 지역. DG, 드ntate 이랑, RT, 망상 thalamic 핵, GP, globus pallidus의. 스케일 바 : B, 500 μm의, C, 100 μm의, D, 100 μm의, 전자, 500 μm의.
Discussion
rAAV 벡터 동물의 생체내 연구에 대한 가치가 점점지고 있습니다. 여기, 우리는 기업에 바이러스 생산의 값비싼 아웃소싱을 피하고하여이 유용한 벡터의 광범위한 응용을 용이하게 할 수있는, 생산 rAAVs을위한 간단하고 저렴한 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜 (참고 1 기준) 동등한 비율 4 양쪽 부모 serotypes의 capsid 단백질을 포함하는 키메라 rAAV1 / 2 벡터의 생산을 설명합니다. 헤파린 컬럼에 바인딩하여 rAAV 벡터의 정화는 AAV2 capsid 단백질의 표현에 의존하지만, 여기에 설명된 AAV1 이외 serotypes과 함께하실 수 있습니다. 또한, AAV6은 감소 친화력과 함께 있지만, 헤파린에 바인딩하는 것으로보고되었습니다, 그리고 잠재적으로이 절차를 사용하여 헤파린 5,6 열이 정화 수 있습니다. 그것은 다른 serotypes는 헤파린 칼럼 용출 5,7에 대한 NaCl의 다른 농도가 필요합니다, 그러나 지적해야합니다.
포장 rAAV의 genomes은 5.2 킬로바이트 8까지 포장 효율 날카로운 감소로 4.1 및 4.9 킬로바이트 사이에 최적으로 표시되었다. transgene 표현의 셀 유형 - 특정 규제는 일반적으로 작은 AAV 입자 내에 수용 수없는 요소를 행동을 대형 CIS에 의해 달성되기 때문에이 포장 제한은 rAAV 시스템의 가장 큰 단점으로 간주 수 있습니다. 이러한 우리가 아니라 같은 단계 6.3에서 설명하는 PBS를 추가하는 것보다 한 500 μl 배치에 250 μl에 집중 별도의 바이러스 배치를 결합하는 AAV 포장 한도에 가까운 패키지 유전자 시도로 인한 것과 같은 낮은 titer의 일괄를 극복하기. 신뢰성 셀 타입의 특정 형질 도입은 통합 Cre - 드라이버 마우스 및 포장 한도를 스트레칭 피하기 위해 조건부 rAAV 카세트 (아래 참조)에 의해 얻을 수 있습니다.
지폐,이 프로토콜은 높은 t의 생산에 쉽게 따라 지침을 제공하기 위해 시도하는 동안iter rAAV, 그건 헤파린 친화도 크로마 토그래피에 의한 정화를위한 AAV2 capsid 단백질 moieties의 존재를 필요로합니다. AAV2 이외 Serotypes는 대체 절차에게 9를 사용 정화해야합니다. 헤파린 열 정화의 장점은 그것이 세슘 염화물 경사도 10을 사용 제작 그 이상의 감염 속도를 가지고 AAV 벡터를 생성하는 생각입니다. 그러나이 방법에는 몇 가지 단점도 있습니다. 예를 들어, 헤파린을 묶고 다른 단백질은 또한 정화 바이러스 재고가 나타날 수 있습니다. 헤파린 - 정화 벡터의 tropism이 벡터 titer 10, 구체적으로 흥분성의 20 억제 뉴런 (그림 2) 중 하나를 대상으로 우리의 접근 방법에 의해 영향을받을 수 있지만 AAV - 중재 transgene 표현의 Cre - 유도된 활성화를 고용하고 titre - 독립적입니다. 헤파린 열 정화하는 대안의 사용을보다 높은 바이러스 titer와 순수한 준비를 생산 iodixanol 밀도 구배의 사용이다세슘 염화물 기울기 10. 이 방법은 99% 순도 11보다 큰 벡터를 생성하기 위해 헤파린 열 정화와 함께하실 수 있습니다. 따라서 신중한 검토가 바이러스성 정화 방법은 자신의 특정 다운 스트림 응용 프로그램에 가장 적합한하는 개별 그룹으로 이동해야합니다.
이 프로토콜과 관련된 가장 일반적인 문제는 낮은 바이러스 titer입니다. 우리의 경험에서 이것은 일반적으로 낮은 transfection 효율, 또는 헤파린 칼럼에서 바이러스의 용출로 추적할 수 있습니다. 모든 transfection 자료 transfection하기 전에 상온에서해야하고, 테스트 transfections는 각 연구실에 최적의 조건을 찾기 위해 수행되어야합니다. transfection의 다른 방법은 lipofectamine과 같은, 고효율 있지만, prohibitively 비싼 수 있습니다. 또한, 헤파린 열 용출 솔루션의 농도와 산도는 헤파린 열 witho에서 virions 완벽하게 용출에 대한 중요UT 손상. 또 다른 중요한 포인트는 패키징 세포 조직 문화 요리의 표면에 잘 준수해야한다는 것입니다. 세포 절차를 수행하는 동안 어떤 단계에서 분리하는 경우 그것은 실험과 서리를 없애다 세포의 새로운 약병을 종료하는 것이 좋습니다.
설치류의 transgene 표현의 Spatio - 시간적 제어를 쉽게 정확한 해부 학적 타겟팅과 동물의 발달 단계에 의해 이루어진다. 효율적인 AAV - 중재 유전자 전송은 utero 12,13에 표시되었습니다. 성인 두뇌에서 stereotaxic 주사 후 rAAV 입자에 감염된 영역뿐만 아니라 바이러스 titer의 변화에 의해뿐만 아니라 사출 매개 변수를 변경하여 훨씬 더 큰 영역에 아주 작은 타겟 지역에서 조정할 수 있습니다. 이것은 볼륨과 속도 주입과 바이러스 정지 14 폴리올 mannitol의 포함을 포함합니다. Mannitol은 또한 체계 rAAV 주입 15 일 이후에 조직의 다양한 감염을 향상시키기 위해 사용할 수 있습니다 </>를 한모금.
rAAV (약 4.7 KB)의 포장 용량은 아마도 이러한 바이러스 벡터에서 표현할 수있는 유전자의 관점에서 가장 제한 요소입니다. 그러나, 최근 연구는 이것이 부분적으로 별도의 rAAV 벡터에 큰 분할 또는 유전자 발현 카세트에 의해 극복하고 virions이 같은 세포 16 감염시 유전자 발현을 시작, 다리 순서를 소개 할 수있는 것으로 나타났습니다. rAAV 벡터에 의해 운반 유전자의 표현 수준도 크게 자체 무료 rAAV 벡터 17를 사용하여 향상된 수 있습니다. rAAV 벡터의 Stereotaxic 주사는 특정 지역과 관련된 방식으로 유전자 발현을 유도를위한 신속하고 저렴한 가격과 강력한 방법을 제공합니다. 조합 2 차 생성 RNA 간섭 전략 18 rAAVs 또한 특정 지역과 관련된 다운 유전자 노크 사용할 수 있습니다. rAAVs는 회로 및 셀 타입을 달성하기 Cre - 유전자 변형 생쥐 또는 셀 타입의 특정 발기인과 함께 조합하여 사용할 수예 : tet 시스템과 피팅 rAAVs가 바이러스 매개 유전자 발현 22,23 이상의 시간적 제어를 추가하면서, 높은 공간 해상도 2,19-21와 유전자 조작을 허용 특정 유전자의 표현. 이러한 예제는 이러한 벡터의 거대한 조합 가능성을 설명하고 올 년간 rAAV 기반 연구의 급속한 증가를 예측했다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amicon Ultra centrifugal filters | EMD Millipore | UFC810024 | 100,000 MWCO |
| Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Dulbeco’s modified Eagle medium (DMEM) | Invitrogen | 10567014 | Supplement with 10% FCS and 10 units/ml penicillin/100 μg/ml streptomycin |
| Hek293 cells | American Type Culture Collection | CRL-1573 | Use at passage less than 30 |
| HEPES buffered saline | Sigma-Aldrich | 51558 | |
| HiTrap Heparin cartridge | Sigma-Aldrich | 54836 | |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium | Invitrogen | 12440-053 | Supplement with 5% FCS |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D5670 | Make fresh solution for each batch |
| 15 cm Tissue culture dishes | Fisher Scientific | 157150 | |
| Stbl2 competent cells | Invitrogen | 10268-019 | |
| Virkon solution | Fisher Scientific | NC9821357 | Leave to disinfect overnight before discarding to drain |
| Table 1. Specific reagents required for protocol | |||
References
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