Summary
I den här artikeln beskrivs hur du förbereder en fluorescensmärkt version av bakteriofag lambda, infektion i
Abstract
Systemet innefattar bakteriofag (fag) lambda och bakterien E. E. coli har länge varit ett paradigm för cell-ödet bestämma 1,2. Efter samtidig infektion av cellen av ett antal fager, är en av två vägar som valts: lytiskt (virulent) eller lysogen (vilande) 3,4. Vi har nyligen utvecklat en metod för att fluorescent märkning enskilda fager, och kunde undersöka efter infektion beslut i realtid under mikroskop, på enskilda fager och celler 5. Här beskriver vi den fullständiga förfarandet för att utföra infektionen experimenten beskrivna i vårt tidigare arbete 5. Detta innefattar skapandet av fluorescerande fager, infektion av cellerna, avbildning under mikroskop och dataanalys. Den fluorescerande fagen är en "hybrid", co-uttryckande vildtyp och YFP-fusion versioner av kapsid gpD-proteinet. En rå faglysat först erhålls genom att inducera en lysogen av GPD-EYFP (enhbalanseras Gul fluorescerande protein) fag, hyser en plasmid som uttrycker vildtyp gpD. En serie reningssteg utförs sedan, följt av DAPI-märkning och avbildning under mikroskopet. Detta görs för att kontrollera likformigheten, DNA-förpackning effektivitet, fluorescenssignal och strukturell stabilitet av fag beståndet. Den initiala adsorption av fager till bakterier utförs på is, sedan följt av en kort inkubation vid 35 ° C för att utlösa viralt DNA-injektion 6. Fagen / bakterier blandning förflyttas sedan till ytan av en tunn näringsagar platta, täckt med ett täckglas och avbildas i ett epifluorescensmikroskop. Den post-infektionsprocessen följs under 4 timmar, vid 10 min intervall. Flera steg positioner spåras så att ~ 100 cell infektioner kan spåras i ett enda experiment. Vid varje position och tidpunkt, är bilder som förvärvats i fas-kontrast och röda och gröna fluorescerande kanaler. Den faskontrast bild används senare för automatiserad celL erkännande medan de fluorescerande kanaler används för att karakterisera infektionen resultat: produktion av nya fluorescerande fager (grön) följt av cell-lys, eller uttryck för lysogeny faktorer (röd) följt av återupptagen celltillväxt och delning. De förvärvade tidsfördröjda filmer bearbetas med hjälp av en kombination av manuella och automatiserade metoder. Dataanalys resulterar i att identifiera infektion parametrar för varje infektion händelse (t.ex. antal och positioner att infektera fager) samt infektion resultat (lys / lysogeny). Ytterligare parametrar kan extraheras, om så önskas.
Protocol
1. Skapande av en rå faglysat (figur 1)
- I en 50 ml kolv, inokulera en färsk koloni av LE392 (λ LZ1) [pPLate * D] (se tabell 1 för detaljer) i 6 ml LB-medium 7 kompletterat med 10 pg / ml kanamycin och 100 pg / ml ampicillin. Växa över natten vid 30 ° C med mild skakning (180 rpm).
- Späd kulturen 1:100 in LBM (LB kompletterat med 10 mM MgSO 4) och växa vid 30 ° C med mild skakning (180 rpm). För att optimera utbytet fag, se till att odlingsvolymen är inte mer än en tiondel av kolven volymkapaciteten. Vi förbereder vanligtvis två flaskor med 2-liters eller 2,5-liters kapacitet, och tillsätt 2,5 ml över natten kultur i 250 ml LBM medium i varje kolv.
- När celldensiteten når OD 600 ≈ 0,6 (~ 2,5 till 3 timmar), inducerar lysogenen genom att flytta kulturen till en 42 ° C vattenbad skakare under 18 minuter med mild skakning (180 rpm), och sedan incubate vid 37 ° C med mild skakning (180 rpm) tills lys är synlig (kultur blir klar, i ~ 60 till 90 minuter).
- Tillsätt 2% kloroform till kulturen, skaka för hand för att blanda, och sedan inkubera under 15 min vid rumstemperatur. Varning: Använd handskar för att hantera kloroform, och undvik inandning det.
- Överför kulturen i två 250 flaskor ml centrifugrör, centrifugera kulturen i en Sorvall GSA-rotor vid 10.000 rpm under 15 minuter vid 4 ° C. Återvinn supernatanten innehållande fagpartiklarna, och kassera pelleten av skräp. Utför en andra centrifugering för att se till att bli av med synliga rester.
- Använd ett standardprotokoll fag titrering 8 för att mäta fag koncentrationen. Fag-titer bör vara ~ 5-10 x 10 9 pfu / ml. Använd en supF stam som LE392 som indikator stammen på grund av Sam7 mutation i genotypen av fluorescerande fag och använda toppagar och agarplattor görs med rik NZYM att få större plattor (FiGure 2).
2. Fag rening (figur 1)
- Häll lysatet i en stor (t.ex. 2-liters), tillsätt DNas I och RNas (1 fig / ml vardera) till lysatet för att smälta nukleinsyrorna befriade från lyserade bakterier och inkubera 1 timme vid rumstemperatur.
- Lägg 1M NaCl i lysatet, överföra lysatet i 250 flaskor ml centrifugrör, och inkubera 3 timmar på is. Centrifugera lysatet i en Sorvall GSA vid 10.000 varv per minut under 15 minuter vid 4 ° C. Återvinn supernatanten. Fag-titer bör vara liknande den hos det råa lysatet, vilket är ~ 5-10 x 10 9 pfu / ml. Tillsatsen av NaCl främjar dissociation av fagpartiklar från bakteriellt skräp och krävs för effektiv utfällning av fagpartiklar med PEG 8.
- Häll lysatet i en stor kolv, t.ex. 2-liters kolv, tillsätt 10% (vikt / volym) PEG8000 i lysatet, sakta rör eller skaka för att lösa PEG8000 vid rumstemperatur. Överför lysatet till 250 ml procentrifuge flaskor och sedan inkubera över natten (~ 16 h) vid 4 ° C. Centrifugera lysatet i en Sorvall GSA-rotor vid 10.000 varv per minut under 15 minuter vid 4 ° C. Kasta bort supernatanten.
- Blötlägg pelleten (fagpartiklarna utfälldes med PEG8000) med fag SM-buffert (4 ml SM-buffert per 250 ml inledande faglysat). Inkubera med mycket mild skakning eller ingen skakning under 16 timmar vid 4 ° C.
- Försiktigt ta ut lysatet (SM-buffert med fagpartiklarna) till en 50 ml Eppendorf-centrifugrör, och sedan tvätta de återstående pelleten med 0,5 till 1 ml SM-buffert.
- Lägg lika stor volym kloroform till lysatet. Blanda försiktigt lysatet med kloroform genom att vända upp och ner ett par gånger. Centrifugera vid 4.000 rpm under 15 minuter vid 4 ° C i en Eppendorf 5804R eller liknande bänk-topp-centrifug.
- Upprepa steg 2,6 för att få en tydligare lysat. Fag-titer bör vara ~ 1-2 x 10 11 ^ pfu / ml.
- Bered SM / CsCl-lösningar med tre olika densiteter (ρ) av 1,3 g / ml, 1.5 G / ml och 1,7 g / ml. Mät brytningsindex (η) för att få en mer korrekt densitet läsning. Densiteten Omvandlingen 9 är ρ = 10,8601 η - 13,4974 vid 25 ° C. Se tabell 3 för detaljer.
- Använd en spruta med en lång nål att ladda lösningen i en 14 ml ultra-klart Beckman 40Ti ultracentrifug rör. För att undvika blandning och att bilda en bättre densitetsgradient, underliggande lösningen (dvs. skiktning med ökande densitet under varandra) bör användas, dvs försiktigt ladda 2 ml SM / CsCl-lösningar på order av 1,3 g / ml, 1,5 g / ml och 1,7 g / ml genom att föra in nålen med en 3 ml spruta till botten av röret.
- Försiktigt ladda 8 ml faglysat genom överlagring från toppen av 14 ml ultracentrifug rör. Förbered en vågröret. Centrifugera i en Beckman SW40Ti-rotor vid 24.000 rpm under 4 timmar vid 4 ° C.
- Försiktigt ta ut röret i ett mörkt rum och lysa från toppen av röret mot en svart bakgrund med AFlashlight. Fag-bandet bör vara klart synlig vid platsen för gränsytan mellan 1,3 g / ml och 1,5 g / ml SM / CsCl skikt (Figur 3A). Punktering genom sidan av röret något under bandet med en 21,5 gauge nål med en 3 ml spruta. Försiktigt samla ~ 500 ^ il av fagsuspensionen. Fag-titer bör vara ~ 5-10 x 10 11 ^ pfu / ml.
- Placera fagsuspensionen i en 4 ml ultra-klart Beckman ultracentrifug SW60Ti rotorrör. Fyll röret med 1,5 g / ml SM / CsCl-lösning. Förbered en vågröret. Centrifugera i en Beckman SW60Ti rötor vid 35.000 rpm under 24 h vid 4 ° C.
- Upprepa samma procedur som i steg 2,11 att samla in fag från det synliga bandet. Bandet bör vara synlig, såsom visas i figur 3B.
- Ladda fagsuspensionen i ett dialysmembran kassett (tabell 2) och dialysera tre gånger mot en 1000-faldig volym av SM-buffert vid 4 ° C under varaktigheter av 3 timmar, 3 timmar och overnight (~ 16 timmar). Syftet med dialys är att bli av med CsCl närvarande i fagsuspensionen. Den slutliga titern fag bör vara ~ 5-10 x 10 11 ^ pfu / ml.
3. Förbered en agarosgel platta (Figur 4)
- Rengör 6 objektglas (75 x 50 mm, 1 mm tjock) med 70% etanol.
- Ordna 5 bilder och säkra med tejp som visas i figur 4.
- Blanda 0,09 g agaros i 6 ml medium i en liten bägare täckt med klamra wrap (ger 1,5% agaros). Värm på en värmeplatta tills lösningen blir klar.
- Häll agaroslösningen på de säkrade bilderna.
- Placera den sista bilden på toppen, noggrant undviker luftbubblor. Placera vikt på toppen och låt svalna under ~ 30 minuter.
- Ta bort de 4 glider på sidan, och linda plattan tillsammans med de övre och nedre bilder med klamra wrap. Plattan kan lagras vid 4 ° C i upp till 3 dagar.
4. Testa renad fag beståndet
- Förbereden PBS-agarosgel platta som beskrivits ovan (avsnitt 3).
- Fläck den renade fagen med DAPI. Blanda 10 pl fag (~ 1 X 10 10 pfu / ml) med 10 pl 10 pg / ml DAPI (slutlig DAPI-koncentration av 5 pg / ml), inkubera under 30 min vid 4 ° C eller 10 min vid rumstemperatur.
- Placera 1 il av fag / DAPI blandning vid centrum av en No.1 24 x 50 mm täckglas, overlay en liten bit (~ 10 x 10 mm) av den förberedda PBS-agaros platta. Den lilla del av agaros platta skärs med ett rakblad efter att den övre bilden på sandwich gelén avlägsnas. Bild provet under epifluorescensmikroskop genom YFP och DAPI-kanaler. Enskilda fager bör vara synlig som diffraktionsbegränsad fluorescerande "fläckar" i båda kanalerna (Figur 5). Använd samma mikroskop och inställningar kameran som i steg 6,2 nedan.
5. Infektion (figur 6)
- I en 14 ml Falcon-rör, inokulera en färsk koloni LE392 [PP RE-Mcherry] (se tabell 1 för detaljer) i 2 ml LB-medium kompletterat med 100 pg / ml ampicillin, 10 mM MgSO 4 och 0,2% maltos. Växa över natten vid 37 ° C med måttlig skakning (265 rpm).
- Späd kulturen 1:1000 in LBMM (LB kompletterat med 10 mM MgSO 4 och 0,2% maltos), dvs lägg 5 pl övernattskultur i 5 ml LBMM medium i en 50 ml kolv. Växa till OD 600 ≈ 0,4 vid 37 ° C med måttlig skakning (265 rpm).
- Använd LBM medium för förbereda en BVL-agarosgel platta som beskrivs i avsnitt 3 ovan.
- Centrifugera 1 ml celler vid 2.000 g i en bänk-topp mikrocentrifug under 2 minuter vid rumstemperatur. Avlägsna supernatanten och försiktigt återsuspendera cellerna i 20 | il iskall LBMM att nå OD 600 och 20.
- När manipulera renade fag lager, använd en bred pipettspets eller klippa den vanliga pipettspetsen för att göra spetsen öppnar bredare, för att undvika klippning fagpartiklarna 3. Försiktigt MIX 20 pl celler med 20 | il av renad fag för att nå en genomsnittlig fager-till-cell-förhållande i området 0,1 - 5. Inkubera på is under 30 minuter för att tillåta fag adsorption och sedan inkubera i en 35 ° C vattenbad under 5 min för att utlösa fag DNA-injektion 6.
- Pipettera upp och ner några gånger till att skilja eventuella cellaggregat. Återigen använda en bred pipettspets att undvika skjuvning fagerna. Späd blandningen 1:10 till LBMM, t.ex. 5 ul blandningen i 45 ul LBMM.
- Placera en bit LBM-agaros platta (~ 10 x 10 mm) på en No.1 22 x 22 mm täckglas. Den förberedda LBM-agaros platta bör placeras vid rumstemperatur i minst 1 timme före användning för att säkerställa att agaros plattan når rumstemperatur. Placera 1 ul av fag / cellblandningen på agaros plattan och vänta under 1 min för att tillåta blandningen att absorbera i agarosen plattan. Placera försiktigt en No.1 24 x 50 mm täckglas ovanpå agaros plattan. Detta förfarande är tänkt att undvika skjuvning fagerna från infected cellen (figur 6).
6. Efter cellöde under mikroskop
- Försiktigt montera täckglas på scenen av mikroskopet. För avbildning, använda en hög-förstoring (t.ex. 100x) mål (se Mikroskop System i diskussion nedan).
- Får en bild som för första tid. Den här bildserien kommer att användas för att karakterisera de första numren och positioner för alla infekterande fager. Ta en serie med 15 bilder på 200 nm z-axel (vertikal) intervall. Bild via YFP kanalen. Dessutom, ta en enda i-fokus bild genom faskontrast och kanaler mCherry. Optimera ljusintensiteten och exponeringstid för att få tillräcklig signal samtidigt minimera blekning och cellskador (se bild Förvärv i diskussion nedan).
- Skaffa en time-lapse film av efter infektion cell öde. Bild provet i fas-kontrast YFP och mCherrykanalerna vid tidsintervall om 10 min för cirka 4 timmar. Under time-lapse film, använda ett enda z-positionen bild per kanal per tidpunkt, för att undvika onödig exponering av provet, vilket kan leda till blekning och fototoxicitet.
7. Bildanalys
- Manuellt räkna antalet fager och spela fag plats och cellens längd i första tid. Detta kan göras med hjälp av programvara som Metamorph eller ImageJ. Spela cellen öden (lytisk, lysogen eller oinfekterade), lys tid och all annan önskad information genom att spela time-lapse film. Att identifiera olika celler öden, se Time-lapse film i representativa resultat nedan.
- Utöver den manuella analysen ovan kan mer kvantitativ information (t.ex. fluorescens nivå över tid i enskilda celler) extraheras med hjälp av automatiserade cell-erkännande och härstamning spårning algoritmer. Vi använder ett hem byggt Matlab program för tracing cell härstamning och fluorescens nivå, tillsammans med Schnitzcell Matlab-kod för cell segmentering (skriven av Elowitz gruppen vid Caltech).
8. Representativa resultat:
Fag Plating:
De plack av de fluorescensmärkta fagerna (i steg 1,6 och avsnitt 2) är betydligt mindre än de av vild typ (fig 2). Vi inkubera därför plattorna minst 12 h i 37 ° C inkubator under placken att vara synliga.
Fag Ultracentrifugering:
Efter ultracentrifugering av fag provet med CsCl steggradient (steg 2,10), bör två band vara synliga (figur 3A). Den övre bandet, vid gränsytan mellan fagsuspensionen och SM / CsCl 1,3 g / ml lager, innehåller celldebris och tomma kapsider fag. Den nedre bandet, vid gränsytan mellan SM / CsCl 1,3 g / ml och 1,5 g / ml lager, är fagen bandet. This band visas grönaktig för fluorescerande fag λ LZ2. Bandet för vildtyp fag λ IG2903 verkar blåaktig 5. Efter ultracentrifugering av CsCl jämvikt gradient i steg 2,12, bör en fag bandet vara synligt i den mellersta delen av röret (figur 3B). Eftersom den fluorescerande fag λ LZ2 innehåller en blandning av gpD-EYFP och gpD kapsider, förhållandet av protein-till-DNA är högre än den hos vildtypen. Därför är bandet av det fluorescerande fag λ LZ2 något ljusare (verkar vara på en högre plats i röret) än vildtypen λ IG290310.
DAPI färgning:
Figur 5 visar typiska bilder som erhållits efter märkning fagen med DAPI (avsnitt 4). De YFP och DAPI signaler om en framgångsrikt renad fag bör ha nära 100% korrespondens. Vi observerar oftast att mindre än 1% av YFP platss innehåller inte DAPI (representerande kapsider utan det virala genomet). Mindre än 1% av DAPI fläckarna inte innehåller YFP (motsvarande icke-fluorescerande fager) 5.
Time-lapse film:
Lytiska celler känns igen av ansamling av YFP fluorescens (grön kanal) inuti cellen, följt av cell-lys. Lysogena celler känns igen av ansamling av enhetliga mCherry fluorescens (röd) inuti cellen och ett återupptagande av normal celltillväxt och delning. Infekterade celler (eller celler där infektionen har misslyckats) kommer inte att visa någon av fenotyper ovan och kommer att växa och dela normalt. Figur 7 visar några bild-uppsättningar faskontrast, YFP och mCherry kanaler och motsvarande överlagrade bilder av dessa tre kanaler, från en typisk tidsförlopp film (avsnitt 6). De individuella fagerna (gröna fläckar) är klart synliga vid den initiala tidsramen (figur 7A). Typiskt, ett antalav fager ses på cellytan (förmodligen infektera dessa celler) medan andra fager oadsorberade, såsom visas i figur 7B (vänstra panelen). Infektionen Resultatet blir urskiljbara över tiden. Den lytiska cykeln indikeras av den intracellulära produktionen av nya fager (grön, figur 7C), följt av cell-lys (sprängskisser celler med frigjorda gröna fager, Figur 7D). Lysogeny indikeras av produktionen av mCherry från P RE promotorn (röd, figur 7C) och återupptagandet av celltillväxt och delning (röd, figur 7D).
Figur 1. AB). Fagen renas genom en serie steg (paneler CL).
Figur 2. Fagplack. Plack av det fluorescerande fag (vänster) är mindre än de av vild typ (höger) efter inkubering plattor under 12 timmar vid 37 ° C.
Figur 3. Fag band efter ultracentrifugering. A) två band synliga efter ultracentrifugering i en CsCl steggradient. Den översta motsvarar celldebris och tomma kapsider fag, den nedre bandet innehåller den önskade fagen. Vänster: fluorescerande fag, höger:. Vild typ B ) En enda fag band är synligt efter ultracentrifugering i en CsCl jämvikt gradient. Den fluorescerande fag bandet (vänster) är grönaktig, jämfört med en blåaktig band för vildtyp fag (höger).
Figur 4. Förfarandet för framställning agarosgel plattor.
Figur 5. Fluorescerande bilder av fager efter DAPI-färgning. Enskilda fager är lätt urskiljbara, och YFP och DAPI signaler samtidigt lokalisera mycket bra.
Figur 6. Schematisk beskrivning av faginfektion och bildhantering installationen. Klicka här för att se en fullstor version av denna bild.
Gure 7 "src =" / files/ftp_upload/3363/3363fig7.jpg "/>
Figur 7. Typiska bilder från en time-lapse film av fag infektion. Visas är faskontrast, YFP och mCherry kanaler, samt en överlagring av de tre kanalerna. (A) YFP-kanal bilder från den första tidsperioden. Vänster, summan av YFP bilder i olika z-positioner. De tre högra bilderna är exempel på YFP bilder med olika z-positioner, som motsvarar olika delar av cellytan. (B), (C) och (D) överlagrade bilder (vänster) i fas-kontrast (mitten-vänster), YFP (mitten-höger) och mCherry (höger) kanaler vid olika tidsramar. (B) Vid t = 0, två celler ses, varje infekterad av en enda fag (gröna fläckar), och en cell infekteras av 3 fager. Observerades också vissa oadsorberade fager. (C) Vid t = 80 min, har de två celler infekterade av enskilda fager vardera gått in i lytisk väg, som visard av den intracellulära produktionen av nya fager (grön). Cellen infekteras av 3 fager har gått in i den lysogena reaktionsvägen, såsom indikeras av produktionen av mCherry från PRE promotorn (röd). (D) Vid t = 2 tim, har den lytiska vägen resulterade i cell-lys (cell exploderade), medan lysogena cellen har delat §.
§ Vänster paneler i figur 7 (c) och (D) återges från Cell, 141, Lanying Zeng, Samuel O. Skinner, Chenghang Zong, Jean Sippy, Michael Feiss och Ido Golding, beslutsfattande på en subcellulär nivå avgör resultatet av bakteriofag Infektion, 682-691, Copyright (2010), med tillstånd från Elsevier.
| Stamnamn | Relevant genotyp | Källa / referens |
| Bakteriella stammar | ||
| LE392 | supF | John Cronan, University of Illinois |
| Fag-stammar | ||
| λ LZ1 | GPD-EYFP, cI857 Sam7 D-eyfp B :: kanR | Zeng et al. 5 |
| λ LZ2 | GPD-mosaik, samma genotyp som λ LZ1 | Zeng et al. 5 |
| Plasmider | ||
| pP RE - mCherry | mCherry under kontroll av P-RE, amp ^ | Zeng et al. 5 |
| pPLate * D | gpD under kontroll av λ sena promotorn, amp ^ | Zeng et al. 5 |
Tabell 1. Bakteriestammar,fager och plasmider som används i detta arbete.
| Densitet ρ (g / ml) | CsCl (g) | SM (ml) | Brytningsindex η |
| 1,30 | 39 | 86 | 1,3625 |
| 1,50 | 67 | 82 | 1,3815 |
| 1,70 | 95 | 75 | 1,3990 |
Tabell 3. CsCl-lösningar framställdes i SM-buffert (100 ml) för steggradienter.
Discussion
Bakteriestammar, fag och plasmider:
Stam LE392 är supF. Det valdes för att undertrycka Sam7 mutationen i faggenomet (se tabell 1 för detaljer). Således kommer inducerade lysogener lyserar småningom och släpper fagpartiklar, liksom infekterade celler som har valt den lytiska vägen. Lysogena celler odlas vid 30 ° C på grund av närvaron av den temperaturkänsliga cl 857-allelen i faggenomet. Efter värmeinduktion, är gpD-EYFP och vild typ gpD samuttrycks från genomet av λ LZ1 och plasmiden pPlate * D resp. Som ett resultat, innehåller kapsiden av den nyligen skapade fagen λ LZ2 en blandning av gpD-EYFP och gpd proteiner. Denna mosaik fag är strukturellt stabil och tillräckligt fluorescerande för att möjliggöra detektion av enskilda fager 5. pP RE - mCherry är en reporter plasmid används för att upptäcka val av lysogena pathway.. Promotorn P RE aktiveras av CII under upprättandet av lysogeny 1,11. pP RE - mCherry 5 härleddes från Pe-GFP 11 genom att ersätta GFP med mCherry 12. För mer information se vår tidigare arbete 5.
Tillväxt Konditionsparameter:
Under lysogen induktion (avsnitt 1), ger milda skakning vid 180 rpm en bra virusutbyte 13. Användning av glukos i tillväxtmediet bör undvikas eftersom glukosmetabolismen genererar sura metaboliska produkter, och mogna lambda partiklar är instabila vid surt pH 13. Tillsatsen av MgSO 4 syftar till att stabilisera fagkapsiden 3. För fager som bär vild typ cl (i stället för cl 857), kan lysogenen induceras med användning av DNA-skadande medlet mitomycin C 3. I steg 1,3, inkuberingen vid 37 ° C bör normalt inte överstiga 90 minuter. Det är usef ul att kontrollera celldensiteten genom OD 600 var 30 min. För en god lysat, sjunker OD 600 till cirka 0,2 eller mindre, och de återstående OD 600 är ett resultat av celldebris. Inkubation alltför länge kan resultera i en lägre fag utbyte eftersom den nyskapade fagen kan börja att injicera deras DNA i cellrester. För att erhålla en synlig fag band (minst 1 x 10 11 fagpartiklar) i steg 2,11 och 2,13, växa minst 500 ml kultur i steg 1,2. Tillsatsen av 0,2% maltos i tillväxtmediet i steg 5,1 och 5,2 syftar till att inducera uttryck av lamm, receptorn för fag lambda adsorption 3,14. Den 1000-faldig utspädning i stället för 100-faldigt i steg 5,2 syftar till att minska mCherry bakgrundsnivån från reporterplasmid pP RE - mCherry. I steg 5,5 för fag DNA-injektion triggning, 35 ° C valts för att undvika induktion av den temperaturkänsliga cI857-allelen.
Fag Rening:
jove_content "> De fag reningssteg (steg 2,1 genom 2,11) kan ersättas med andra reningsprotokoll 5, men den slutliga ultracentrifugering genom CsCI jämvikt gradient (steg 2,12 och 2,13) är oundviklig. behövs i steg 2,10 och 2,12 till Swinging bucket rotorer säkerställa skarpa synliga fag band. Skaffa en ren fag lager lätt kan ta upp till en vecka, så det är nödvändigt att kontrollera fag-titern på vägen att se till att ingenting går fel under de mellanliggande stegen.Fag Hantering:
Under alla reningsförfaranden i avsnitt 2, är det viktigt att hantera faglysat försiktigt för att undvika klippning fag svansar från faghuvuden. Under cellinfektion i avsnitt 5 (t.ex., stegen 5,5 till 5,7), är det också viktigt att undvika skjuvning av fagpartiklar från den infekterade cellen. Observera att om fagen skjuvas från den infekterade cellen efter injicering dess DNA, är resultatet en "mörk" infektion, dvs ifection resultatet kommer att observeras i experiment, men den infekterande fagen inte. För att minimera sådana problem, använder vi ett brett pipettspets när hanteringen fager eller fag / cellblandningen.
DAPI Test:
Färgning av fag lager med DAPI (avsnitt 4) är en snabb och effektiv metod för att kontrollera renhet fag lager. Den kan också användas för att testa för eventuell nedbrytning av en existerande fag lager över tiden. För en ren bestånd bör samlokalisering av YFP och DAPI-signaler enligt fluorescensmikroskop vara nära 100%. Vi observerar typiskt att mindre än 1% av YFP fläckarna inte innehåller DAPI (representerande kapsider utan det virala genomet), vilket tyder på att dessa partiklar inte klarade paketera viralt DNA eller hade redan injicerat deras DNA annanstans. Mindre än 1% av DAPI fläckarna inte innehåller YFP (motsvarande icke-fluorescerande fager). Om så inte är fallet, steg 2,12 till 2,14 behöver upprepas i order att rena igen. När det gäller avbildning parametrar är mikroskopet inställningen i steg 4,3 inte lika kritisk som i avsnitt 5 eftersom ingen långsiktig live-cell imaging krävs här. Men att hålla samma mikroskopi inställningar som i avsnitt 5 är användbar om man vill kalibrera fluorescensintensiteten av en enda fagpartikel. Om PBS-agaros platta är inte mycket ren, eller för mycket DAPI färgämne används, kan vissa DAPI fläckar motsvarande fag-DNA omges med en "halo". Om alltför lite DAPI färgämne används, kan signalen från DAPI-kanalen vara mycket svag.
Mikroskop System:
För avbildning i avsnitt 6, använder vi en kommersiell inverterat epifluorescensmikroskop (Eclipse TE2000-E, Nikon) med en 100x mål (Plan Fluo, numerisk apertur 1,40, oljeimmersion) och standard filter set (Nikon). Fluorescensen ljuskällan är en båglampa med kontroll av ljusintensitet. Följande funktioner är datorstyrd: x, y och z posättningen, ljusfält och fluorescens fönsterluckor, och fluorescens filter val. En autofokus funktionen krävs. Annars kan fokus glida lätt bort under time-lapse film (normalt 4 timmar lång). Möjligheten att förvärva flera (x, y) positioner vid varje tidpunkt är användbar, eftersom den gör det möjligt att följa flera infektion händelser parallellt. Vi förvärvar vanligtvis 8 steg positioner i varje film, efter upp till 100 infektion händelser. Kameran vi använder är en kyld 512x512 CCD med 16x16 um pixel kamera med ett dynamiskt omfång av 16 bitar (Cascade512, ljustekniska). Förvärvet sker med Metamorph mjukvara (Molecular Devices). Mikroskopet skall placeras i en temperatur-kontrollerad rum, alternativt skall mikroskopets vara omgiven av en temperatur-kontrollerad kammare.
Bild Förvärv:
För levande cell imaging, är det viktigt att undvika onödig exponering av provet, vilket kan leda till blekning och phototoxicity. Därför är det bäst att först karakterisera systemet för att hitta en optimal ljusexponering som möjliggör fluorescensdetektion utan leder till överdriven blekning eller hämma celltillväxt. För att få en bra fluorescens bild spela med spännande ljusintensitet, exponeringstid och kamera vinst. I steg 6,2-6,3 är 10 minuter ramintervall valts för att minimera ljusexponering. I varje bildruta är bara en enda i-fokus bild behövs i fas-kontrast (för cell erkännande) och fluorescerande kanaler (för bestämning av cellens öde). I den första tidpunkten, är dock flera z-positionen bilder genom YFP-kanalen som krävs för att fånga alla infekterande fager på cellytan. Den YFP exponeringstiden i den inledande ramen kan också behöva vara högre än den som används för time-lapse film i de senare tidsramar.
Bildanalys:
Mycket noggrant räkna fagpartiklar runt cellytan i steg 7,1. Somnämnts ovan tar vi en serie av z-stackar genom YFP-kanal i steg 6,2. Detta kan dock lämnar fortfarande en del fluorescerande fagpartiklar utanför fokus, som utmanar räkningen. Cellen längd i första tidsramen mäts med Metamorph programmet. Cellen längd kan också mätas genom ImageJ eller andra programverktyg. Dessutom kan en automatisk hem byggt Matlab-programmet vara mycket användbara för att erhålla information såsom fluorescens förändras över tid tillsammans cellinjer.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi är tacksamma mot Michael Feiss och Jean Sippy för vägledning om fag skapande och rening. Vi tackar Michael Elowitz för att tillhandahålla programvaran celligenkänning, Schnitzcell. Arbetet i Golding labbet stöds av anslag från National Institutes of Health (R01GM082837), National Science Foundation (082.265, PFC: Centrum för Fysik av levande celler), Welch Foundation (Grant Q-1759) och Human Frontier Science Program (RGY 70/2008).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4527-10KU | |
| RNase | Sigma-Aldrich | R4642-10MG | |
| PEG8000 | Fisher Scientific | BP233-1 | |
| SM buffer | TEKnova, Inc. | S0249 | |
| NZYM | TEKnova, Inc. | N2062 | |
| CsCl | Sigma-Aldrich | C3011-250G | |
| Syringe | BD Biosciences | 309585 | |
| Needle | BD Biosciences | 305176 | |
| Dialysis cassette | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 66333 | |
| Microscope slide | Corning | 2947-75x50 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| SW40Ti ultra-clear tube | Beckman Coulter Inc. | 344060 | |
| SW60Ti ultra-clear tube | Beckman Coulter Inc. | 344062 | |
| SW40Ti rotor | Beckman Coulter Inc. | 331302 | |
| SW60Ti rotor | Beckman Coulter Inc. | 335649 | |
| Refractometer | Fisher Scientific | 13-947 | |
| Epifluorescence microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE2000-E | |
| Table 2. Reagents and equipment. | |||
References
- Oppenheim, A. B., Kobiler, O., Stavans, J., Court, D. L., Adhya, S.
- Ptashne, M. A genetic switch : phage lambda revisited. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
- Hendrix, R. W. Lambda II. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1983).
- Hershey, A. D. The Bacteriophage lambda. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1971).
- Zeng, L. Decision making at a subcellular level determines the outcome of bacteriophage infection. Cell. 141, 682-691 (2010).
- Edgar, R. Bacteriophage infection is targeted to cellular poles. Mol. Microbiol. , (2008).
- Ausubel, F. M. Current protocols in molecular biology. , John Wiley & Sons. (1994).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning : a laboratory manual. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
- Fasman, G. D. Practical handbook of biochemistry and molecular biology. , CRC press. (1989).
- Kaiser, A. D. On the internal structure of bacteriophage lambda. J. Gen. Physiol. 49, 171-178 (1966).
- Kobiler, O. Quantitative kinetic analysis of the bacteriophage lambda genetic network. Proc Natl Acad Sci. 102, 4470-4475 (2005).
- Shaner, N. C. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
- Personal communication with M. Feiss. , Forthcoming.
- Schwartz, M. The adsorption of coliphage lambda to its host: effect of variations in the surface density of receptor and in phage-receptor affinity. J. Mol. Biol. 103, 521-536 (1976).
