Summary
我们提供了一个实用指南提供示踪剂
Abstract
被组织成神经回路的功能地形图。为了形象直观地查看复杂的电路架构，我们开发了一个方法多种地形预测全球的图案，以可靠的标签。小脑是一个理想的的模型来研究神经回路的有序安排。例如，房室脊髓小脑长满青苔的纤维组织已经被证明是一个不可缺少的系统研究苔藓纤维图案的。我们最近表明，麦胚凝集素（WGA）的共轭Alexa的555和488可以用来跟踪，在发展中国家和成年小鼠的脊髓小脑苔藓纤维预测（Reeber等。，2011年）。我们发现了三个主要物业，使标签神经预测的WGA Alexa的示踪剂的理想工具。首先，Alexa的荧光团激烈，其亮度wholemount成像允许后直接跟踪。二，WGA - Alexa的示踪剂标签的整个发展中国家和成人神经projectio轨迹NS。第三，WGA - Alexa的示踪剂正在迅速运逆行及顺行方向。在这里，我们详细描述了如何准备示踪剂和其他所需的工具，如何进行手术治疗脊髓小脑跟踪和如何以最佳形象追溯到三个方面的预测。综上所述，我们提供了一个一步一步跟踪协议，将破译的组织和功能的地图不仅在小脑，而且在皮质，脑干和脊髓的连通。
Protocol
1。示踪剂在体内提供使用无菌手术（第1.1-1.16）
整个过程中，我们建议使用标准的无菌手术技术。这包括使用无菌手套，隔离衣和口罩。工具应进行高压灭菌或使用前彻底清洁的水，然后乙醇。在手术过程中，特别是与动物之间，干净的纸巾碎片珠用热灭菌（无菌250＃18000-45，精细科学的工具）的工具和干燥消毒仪器关闭。此外，至关重要的是，您组织您的工作空间，你有动物准备（剃毛等），手术和恢复区的动物可以很容易地监控，温暖，并与需要的镇痛药提供指定地点。生存手术成功的关键是，以减少感染的风险，并保持一个积极的手术后护理的策略。请参阅表在这里您可以鳍D所有必要的设备和试剂，本议定书。
- Avertin（2,2,2 - Tribromoethanol，Sigma公司，圣路易斯MO;猫＃T48402）新鲜配制麻醉成年小鼠通过腹腔注射（IP）0.2ml/10grams体重的剂量。如其他麻醉药异氟醚或氯胺酮/甲苯噻嗪也同样有效，但确保您的实验室已经在使用前所需的机构和联邦批准。如果您使用的幼仔（P0 - P10），您可以麻醉碎冰10-15分钟。确保每个小狗的皮肤不直接接触与冰（例如，放置在乳胶手套的手指），因为冷水会迅速诱发致命的低温。确认的动物表演与动物的后爪钳或手指脚趾捏在接受麻醉平原。如果有一脚蹬反射，等到动物是这种刺激的反应迟钝，作为一个更深层次的指标麻醉平原。
- 一旦动物完全麻醉躺在它的背侧与它的头远离你和它的尾巴面向您面临的无菌纱布垫。电推剪剃的皮毛，为了给自己一个清晰的手术视野足够宽，能够获得中枢神经系统。两套酒精擦拭，然后70％的酒精/优碘擦拭剃光区域，然后再次用酒精擦拭干净。清洁手术区时，使用内到外的圆形图案。您可以选择您的手术视野清楚划分削减了一个小洞，进入无菌纱布垫，放置在你的光头和清洁手术部位开幕。虽然保持无菌手术领域可以是棘手的工作时的小动物，这样做将有助于降低感染的风险。
- 使用钳提起皮肤，并在较低的胸上腰椎ř以上直接中线切口，用剪刀egion。较低的胸部上腰区可以识别运行手指沿椎骨觉得在脊柱驼背（图1）。
- 切开筋膜和肤浅的脊髓肌肉。如果有必要，停止任何出血烧灼血管，加利福尼亚州福斯特城，精细科学工具;猫＃18000-00。在幼崽，应用，切口周围用棉签温和的压力是足够的止血。
- 删除一个或两个的下胸段棘突执行 - 上腰脊髓背椎板切除术，切割后对脊柱，关节突及背侧的棘突之间的中途两侧椎板（图2） 。要小心，不要破坏你的剪刀脊髓和总是取出小碎骨，因为他们可以划破脊髓。请注意，在产后早期幼崽的脊柱没有完全僵化，这意味着，骨骼都非常软，可以很容易地削减。因此，要注意不要剪得深，因为您可能损伤脊髓。
- 如果你不喜欢在成年小鼠进行背椎板切除术，我们发现，你可以切割软组织之间的椎体节段的脊髓暴露不切割任何骨一个小区域。虽然这两种方法都是有效的路线进入到脊髓，避免背椎板切除术，可确保脊髓仍然完好无损。
- 您的使用千分尺注射器的示踪剂（悬液0.2ml; Gilmont仪器猫填补一把拉住的玻璃电极（高硼硅玻璃毛细管;猫＃300056，哈佛仪器，Holliston，硕士，双级玻璃微管拖轮从Narishige 001 - PC - 10型） ＃GS - 1100）或等效的交付设备。
- 拧紧到位玻璃微电极上的显微和，电极0.1 - 0.5mm的中间插入下胸椎脊髓上腰区中期线和脊髓的外侧缘。动物可能会在注射位点的准确识别的立体定位仪和稳定的动物（小动物脑立体定位仪型号940 - A和电极的机械手模型从Kopf仪器960）举行。另外，如果您的麻醉制度，可定制，实现了稳定的平面上，没有因深呼吸显著运动轻轻地录音下来的动物来就足够了。
- 压力注入到脊髓超过3-5分钟，约WGA的Alexa的488（麦胚凝集素的Alexa Fluor 488共轭;猫＃W11261，Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚）的2％的溶液0.5μL，WGA - Alexa的555 （麦胚凝集素的Alexa Fluor 555共轭;猫＃W32464，Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚），WGA - Alexa的350（麦胚凝集素的Alexa Fluor 350共轭;猫＃W11263，Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚），WGA HRP（麦胚凝集素辣根过氧化物酶;西格玛，圣路易斯，密苏里州猫＃L7017）或10％0.5μLBDA（生物素葡聚糖胺;猫＃D1956，Invitrogen公司，卡尔斯巴德，CA）缓冲磷酸盐（PBS;西格玛，圣路易斯，密苏里州;猫＃P4417）。注射示踪剂，结果这些卷标签大量的纤维。较小的卷将需要针对较小的原子核（或单个核分区域），每个调查员应凭经验确定理想的音量提供注射。离子透入，应考虑为精确的注射准确的纳升交付。我们通常用0.5％的快速绿色（Sigma公司，圣路易斯，密苏里州，猫＃F7252）补充所有示踪解决方案，在手术过程中的可视化的注射部位。
- 我们添加玉米油的加入1μl（Sigma公司，圣路易斯，密苏里州，猫＃C8267）每BDA的解决方案中加入10μl注射前坚持拉移液器的墙壁，以防止混合。如果你有麻烦弹出示踪吸管，慢慢收回的提示创建一个在组织中的小口袋，然后再次尝试注射。这是不寻常的微电极尖端堵塞。在大多数情况下，口袋里还有助于创建一个水库周围的神经元可以吸收的示踪。请记住，总是弹出示踪缓慢，以避免在你的针附近的大规模的组织损伤。
- 轻轻关闭皮肤伤口剪辑和组织胶。或者，您可以使用缝合关闭伤口。
- 注意与实践的外科手术，至少直到此时，可以在不到20分钟完成。
- 放置在恢复室（Vetcare室模型9.16.0猫。哈佛仪器＃340508），以避免低温，加快恢复的速度加热垫（电热垫猫。＃341241）从哈佛仪器的动物。另外，您可以使用许多使加热室的模型之一。监测呼吸频率和检查该动物是试图移动的迹象。大多数动物通常手术后10-15分钟内响应。
- WGA - 555 Alexa的WGA - Alexa的488，和WGA - HRP的快速运输在神经元中，我们发现，在双方产后早期和成年小鼠的Alexa结合示踪剂在24小时内强劲的标签长纤维束（Reeber等2011） 。 WGA - Alexa的350也迅速运虽然相比其他Alexa的染料，其知名度是高度依赖的过滤器设置的质量和灵敏度（数据未显示; Reeber等2011） 北京经济技术开发区，通常需要更长的生存时间，以充分跟踪神经预测，因此，脊髓小脑预测动物将需要大约11天之后牺牲的完整映射。
2。长满青苔的纤维anterogradely追溯到检测
- 在各自的生存期麻醉与Avertin（或您首选的麻醉剂）的小鼠。
- 一旦有没有与0.1M PBS（PH7.2）灌流，血液通过心脏刷新的反射。然后，修复组织灌流4％多聚甲醛的PBS（PFA）的动物。此外你将分析的地区，它始终是必要的，以获得从注射部位注射是多么大的回顾性分析，显示电极造成的组织损伤的程度的组织，并确定在纤维可能标签通道（图3看到Mesulam。Reeber等，1982; 2011）。
- Postfix的的BR灌注小鼠在4％煤灰的24-48小时，然后ains cryoprotect蔗糖稀释在PBS（15％为1〜2小时，或直至组织下沉到容器的底部，然后30％过夜，或直至在缓冲解决方案组织汇）。组织，然后从蔗糖中删除，轻轻擦了擦用纸巾擦干，然后沉浸在组织华侨城模具（最佳切削温度;樱花精科美国公司，CA）。组织使用一个-80 ° C冰箱冷冻和储存在相同的温度，直到它准备好被削减。
- Alexa的荧光团后直接可见标签和不需要额外的染色。因此，灌注后的WGA Alexa的追查组织可以切割和成像上，或直接作为wholemount准备在4％PFA成像。我们发现组织在4％PFA给wholemounts追溯到预测的地形成像的最佳折射率成像。对于部分，切串行40微米厚的科伦人在低温恒温器部分和收集在PBS自由浮动部分。由于煤灰的毒性，确保一个适当的口罩戴在灌注和成像，保持通风良好的地方，并在不使用时立即返回任何PFA或PFA固定组织的密封容器。如果您的显微镜是在位于一个合适的通风柜的，它是理想。
- WGA - HRP标记的纤维，可以发现一个四甲基联苯胺（TMB）显色。我们不会描述HRP染色协议，因为它以前曾详细描述（沃格尔和Prittie 1994年。米利托等人2010）
- 对于BDA标记纤维孵育2小时在链霉亲和素- CY3自由浮动的组织切片（货号＃434315，Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚）或链霉亲和的Alexa Fluor 488或555（货号为488和猫S11223 S21381为555，Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州），在PBS洗，然后装入氟凝胶。对于民建联，孵化组织切片ABC反应缓冲液过夜（货号＃PK - 4000，Vector实验室，公司伯林格姆，CA），在PBS漂洗3次，然后反应5-10分钟，在DAB（0.5mg/ml的矢量Laboratories公司，Burlingame的CA），辅以加入10μl30％H 2 O 2每50毫升DAB溶液。
3。免疫组化
- 免疫组化法进行如前所述（米利托等人，2008年）。简单地说，在0.1M PBS孵化组织切片中含有10％的农工商（NGS; Sigma公司，圣路易斯MO），0.1％Tween - 20的主要抗体在室温为16-18小时（见下文）。洗净组织切片在PBS的3倍，然后孵育二抗在室温下2小时最大（见下文）。再次冲洗组织和揭示了免疫反应，如下所述。
- 为了确定我们共同标记的自由浮动，使用传统方法的双重染色的组织切片的Purkinje细胞和长满青苔的纤维之间的关系。我们使用WGA - Alexa的555跟踪和Alexa 488标记的驴抗鼠抗体（Invitrogen公司/分子探针公司，卡尔斯巴德，CA）检测ZebrinII（1:250;，卡尔加里，加拿大卡尔加里大学博士理查德霍克斯，实物礼品）。 ZebrinII是一种鼠单克隆抗体被用来直接从花杂交瘤细胞培养基。在1:1500稀释的荧光标记的二抗。组织切片染色后安装在带电玻片，然后用Tris缓冲液（电子显微镜科学，哈特菲尔德，PA）氟凝胶或Vectashield hardset coverslipped安装介质用DAPI（货号＃H - 1200，媒介实验室，伯林格姆，CA）三色荧光成像。
- 我们测试处理在初级抗体的情况下组织切片，特异性抗体。在这样的对照实验，检测无信号表明，我们观察到的染色是不是由于非特异性信号从第Ë Alexa的共轭抗体（数据未显示）。
4。显微镜和数据分析
- 我们捕捉的组织部分使用徕卡DFC360 FX（荧光）和DFC490（DAB和TMB反应组织切片）摄像机安装在徕卡DM5500显微镜的显微照片。
- 我们采集和分析的组织部分，使用徕卡应用套件和徕卡应用套件FX软件包的图像。
- wholemounts显微照片被捕获使用徕卡DFC3000 FX相机安装在徕卡MZ16足总杯运行徕卡应用套件FX软件的体视显微镜。
- 我们的显微镜都配备了徕卡CY3（＃11600231）和FITC（＃11513880）过滤器，和一个额外的A4的DAPI /紫外线过滤器（型号＃11504162）DM5500。
- 收购后确定使用徕卡软件优化/曝光过度的图像。我们所有的原始数据导入到Adobe Photoshop CS4和如有必要，瓦特发送正确的每个图像的清晰度，亮度，对比度或水平只整场。其他照片编辑软件，可以用来作为首选。
- 这里介绍的原理图绘制在Adobe Illustrator CS4。
- Alexa的555和CY3染色的神经元，这是用我们的过滤器检测为红色，在整个手稿提出的图像伪彩色洋红。
动物
所有的动物实验研究批准的IACUC动物协议下进行，根据阿尔伯特爱因斯坦医学院的机构准则。男性和女性的远交瑞士韦伯斯特（泰康利，奥尔巴尼，纽约州）或自交系C57BL6J（JAX，酒吧港，ME）的小鼠均保持在我们的殖民地，用于所有的研究。阴道插件检测当天中午被认为是胚胎每天0.5。
5。代表性的成果：
脊髓小脑传入终止到parasagi在小脑ttal带（图3; Voogd等人，1969年; Grishkat和1995年艾森曼，1994年Vogel和Prittie; VIG等2005年; 2009年Apps和霍克斯;米利托等2010;。Reeber等2011）。较低的胸上腰椎脊髓，以证明我们注入WGA - Alexa的示踪剂：1）可以使用这些示踪剂一贯标签的特定子集的终端在小脑（图3; Reeber等2011），2）。 WGA - Alexa的示踪剂，是强烈的明亮，可用于可视化整个小脑苔藓纤维地形的总体格局（图3; Reeber等，2011），3），可以组合使用WGA - Alexa的488和555跟踪多个大片在同一动物（图4），4），WGA - Alexa的示踪与免疫组化染色（图5）兼容。在最近的工作中，我们发现，WGA - Alexa的示踪剂，在早6小时后提供的示踪到脊髓小脑标签终端和是一个很好的选择跟踪的architecturE发展的途径（Reeber等。2011年）。
图1提供一个我们的手术区的形象 。较低的胸上腰椎区域，可沿椎骨运行你的手指感到在脊柱驼背确定示踪剂在体内。答：设备安装。背侧椎板切除应大致在中间的“驼峰航线”，这是由黄色的箭头表示。
图2插图的一个较低的胸-上腰椎段背椎板切除前后 A.一个完整的从较低的胸上，木材鼠标脊柱椎体段的原理B.一个dorsa升椎板切除术是由一个或两个椎体节段的棘突，消除切割之间的关节突和背棘突椎板中途后执行。
图3。WGA - Alexa的示踪剂，是强烈的明亮，可用于可视化传入高分辨率投影地形。示意图说明WGA - Alexa的起源和终止555标记的脊髓小脑的神经元。B.后注射成人脊髓上到下胸腰椎地区提供555 WGA - Alexa的网站的形象 。C. Wholemount形象D. WGA - Alexa的555顺行追踪小脑束后，下胸椎脊髓上腰区的WGA Alexa的555注射前小叶。揭示长满青苔的纤维带，共同ronal组织部分。小叶被定义为罗马数字和中线（适用于所有图像）两边的数字标签苔藓纤维带。比例尺：B，500微米彗星ð 500微米，200微米。
图4。WGA - Alexa的示踪标记多个神经通路在同一动物的有效率 。 A. Wholemount示意图鼠标总结小脑脊髓小脑苔藓纤维带的总体格局。 ，无论是WGA的Alexa的示踪剂，WGA - Alexa的555右侧的腰椎脊髓和WGA Alexa的488注入到同一网段左侧 B.日冕组织切条通过后小叶运到小脑和成功标记的终端不同的子集（见也Reeber等2011）。缩写：摩尔cular层（ML）;浦肯野细胞层（PCL）;颗粒细胞层（GCL）;白质（WM）。比例尺：B，100微米。
图5。WGA - Alexa的示踪剂可用于神经元和预测的三重标记免疫组化和组织学相结合。 A. WGA - Alexa的555是存放在小叶三苔藓纤维终端B. ZebrinII染色显示小叶三数组的浦肯野细胞的条纹。C. DAPI荧光染色的神经元和胶质细胞的细胞核。D.板，A，B合并图像和彗星显示传入乐队，浦肯野细胞的条纹，和一般细胞构筑三重标签。EH。高倍率图像显示板公元盒装地区。浦肯野细胞的条纹编号如前所述（审查（2009年Apps和霍克斯））。缩写：分子层（毫升）;浦肯野细胞层（PCL）;颗粒细胞层（GCL）。比例尺：500微米（AC），H，500微米（EG）。
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Discussion
我们已经描述了手术和技术的成功使用一种新型的荧光为基础的方法，迅速在发展中国家和成年小鼠的神经预测标签的轴突和树突跟踪所需的详细信息。使用WGA - Alexa的我们展示了如何示踪剂和标记可用于图案电路地形分析在高分辨率和在三个方面。
许多示踪剂追踪神经回路，包括霍乱毒素B亚基，生物胞素，Neurobiotin，菜豆leucoagglutinin（PHAL），fluororuby，fluoremerald和荧光金。此外，最近表明，遗传和病毒的示踪剂分子不同的神经元亚群地形连接到他们的目标非常精确。请注意，虽然有些神经示踪剂主要运输无论是在顺行或逆行的方向（如：北京经济技术开发区万兆瓦与3000兆瓦），示踪分子往往是在两个运方向。在我们的研究中，我们将介绍基于示踪剂WGA - Alexa的地形投影模式分析可靠的神经解剖工具。我们表明，WGA - Alexa的荧光明亮，运输迅速，灵活，足以与包括小脑矢状车厢（图3）免疫组化标记配对。
其他神经解剖示踪比较，我们发现使用WGA - Alexa的一些局限性。在北京经济技术开发区（吴等，1999）相反，我们以前发现，当WGA Alexa的（WGA - HRP）没有透露整个形态复杂的终端末梢（Reeber等2011）。然而，我们改进的解剖信息的价值，从获得的配对与免疫组化染色囊泡膜谷氨酸转运体2（VGLUT2）和可卡因和安非他明调节转录肽（CART）免疫组化法（Reeber等2011 WGA - Alexa的跟踪追查终端; Reeber米利托，2011年）。一个WGA - Alexa的其他缺点是信号降解比较迅速，尽管被保护的荧光信号在媒体上，在组织切片。因此，我们通常的图像切割后立即组织，虽然仍然允许在2天的切割成像标记纤维和终端成功地成像。 WGA - Alexa的信号有一个倾向，失去在组织切片的免疫强度。染色过程中使用更少和更短的清洗，可以最大限度地减少这个问题。另一项建议是始终安装和图像跟踪组织切片上的切割与相邻的部分将用于免疫组化处理比较参考的日子之一。在我们手中华侨城（组织TEK，樱花Finetek，托兰斯，CA）嵌入组织块保存在-80 ° C后可以长时间储存灌注和cryoprotection没有任何示踪剂强度的损失。
我们approa跟踪光纤通道可以很容易地适应用于跟踪在皮质，脑干，和脊髓途径中的神经地图。目前，我们正在探索使用WGA - Alexa的示踪剂在体内成像电路，在转基因动物和形成电路形成的动力学研究后选择性消化道病变及药理操作的可能性。由于示踪剂WGA - Alexa的快速交通进行短期分析，使我们的方法，揭示了发生在地形电路结构可塑性的动态变化的潜力。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作得到了新的启动资金来自叶史瓦大学阿尔伯特爱因斯坦医学院的研究者RVS。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bead sterilizer | Fine Science Tools | Model Steri 250 Cat. # 18000-45 | |
| Cauterizer | Fine Science Tools | Cat. # 18000-00 | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | Cat. # 300056 | |
| Dual stage Glass Micropipette Puller | Narishige International | Model 001-PC-10 | |
| Micrometer syringe | Gilmont Instruments | Cat. # GS-1100 | |
| Small Animal Stereotaxic Instrument | Kopf Instruments | Model 940-A | |
| Electrode Manipulator | Kopf Instruments | Model 960 | |
| Vetcare chamber | Harvard Apparatus | Cat. # 340508 | |
| Heating Pad | Harvard Apparatus | Cat. # 341241 | |
| Leica DFC360 FX camera | Leica Microsystems | DFC360 FX | |
| Leica DFC490 camera | Leica Microsystems | DFC490 | |
| Leica DM5500 microscope | Leica Microsystems | DM5500 | |
| Leica DFC3000 FX camera | Leica Microsystems | DFC3000 FX | |
| Leica MZ16 FA microscope | Leica Microsystems | MZ16 FA | |
| CY3 Filter | Leica Microsystems | Model # 11600231 | |
| FITC Filter | Leica Microsystems | Model # 11513880 | |
| A4 DAPI/UV filter | Leica Microsystems | Model # 11504162 | |
| Wheat germ agglutinin, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | Cat. #W11261 | |
| Wheat germ agglutinin, Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | Cat. #W32464 |
References
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- Grishkat, H. L., Eisenman, L. M. Development of the spinocerebellar projection in the prenatal mouse. J. Comp. Neurol. 363, 93-108 (1995).
- Mesulam, M. Tracing neural connections with horseradish peroxidase. , Wiley. New York. (1982).
- Reeber, S. L., Sillitoe, R. V. Patterned expression of a cocaine- and amphetamine regulated transcript (CART) peptide reveals complex circuit topography in the rodent cerebellar cortex. Journal of Comparative Neurology. , (2011).
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