Summary
Раздевания является важным шагом на ранней стадии ВИЧ-1, жизненного цикла и определяется как разборку капсида оболочки и высвобождение вирусного комплекс рибонуклеопротеидных (vRNP). Здесь мы демонстрируем методы выделения нетронутыми ядер от ВИЧ-1 вирионов и для количественного их раздевания
Abstract
Геном ретровируса заключен в капсид окружен липидной оболочкой. Для лентивирусов, таких как ВИЧ-1, конической оболочки капсида состоит из белка CA расположены в виде решетки из шестиугольника. Капсида закрыто 7 пентамеры на широком конце и 5 на узкий конец конуса 1, 2. Заключенная в этой оболочки капсида является вирусный комплекс рибонуклеопротеидных, а вместе они составляют ядро.
После слияния вирусной мембраны с мембраной клетки-мишени, ВИЧ-1 поступает в цитоплазму. Капсида то разбирает освобождения свободного ЦА в растворимой форме 3 в процесс называется раздевания. Внутриклеточные места и времени проведения ВИЧ-1 раздевания мало изучены. Одноместный аминокислотных замен в ЦА, которые изменяют стабильность капсида также ослабить способность ВИЧ-1, чтобы инфицировать клетки 4. Это означает, что стабильность капсид имеет решающее значение для ВИЧ-1 инфекции. ВИЧ-1 раздевания было трудно учиться из-за отсутствия свободных мест в чувствительных и надежных тестов для этого процесса. Здесь мы опишем количественный метод исследования раздевания в пробирке использованием ядра изолированы от инфекционных ВИЧ-1 частиц. Подход предполагает выделение ядер путем осаждения концентрированных вирионов через слой моющего средства и в линейный градиент сахарозы, в холод. Для количественной оценки раздевания, изолированных ядер инкубируют при 37 ° С для различных определенные интервалы времени, а затем осаждали ультрацентрифугирования. Степень раздевания анализируется количественная доля ЦА в супернатант. Этот подход был применен для анализа последствий вирусных мутаций на ВИЧ-1 капсида стабильности 4, 5, 6. Следует также полезны для изучения роли клеточных факторов ВИЧ-1 раздевания.
Protocol
1. Производство ВИЧ-1 частиц
Прежде чем продолжить, вы должны получить разрешение и следовать указаниям из офиса биобезопасности вашей организации на работу в центр биобезопасности одобрен для инфекционного ВИЧ. Вы должны убедиться, что надлежащего ухода и техники безопасности соблюдаются во время работы в биологической лаборатории.
Производство ВИЧ-1 частиц, как правило, выполняются переходные трансфекции 293T клетки с ВИЧ-1 провирусной ДНК с помощью трансфекции фосфатом кальция методом 7, 8. Высокий титр вируса натуральной оспы выросла на культуре зараженных Т-клеток, также подходят.
- Культура 293T клеток изменения Eagle Дульбеко Средняя (DMEM), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) с добавлением антибиотиков [пенициллина (100 МЕ / мл) и стрептомицин (100 мкг / мл)] при 37 ° C, 5% CO 2 .
- Отсоедините клетки почти сливающийся блюда с использованием 0,25% трипсина-EDTA и семян 2x10 6
- На следующий день, ячейка монослоя должно быть около 25% сливной и готовы к трансфекции. В течение шести блюд ячеек для трансфекции, принеси 120 мкг провирусной ДНК до объема 2,7 мл стерильной воды. К этой смеси добавить 0,3 мл 2,5 М CaCl 2 и 3 мл 2XBBS, и соединение должным образом с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз. Позвольте смеси постоять при комнатной температуре в течение 10-20 минут.
- Добавить 1 мл полученной смеси по каплям в центре каждого блюда в то время как закрученной осторожно перемешать. Место блюда в течение ночи (~ 16 часов) в термостат при температуре 35 ° C и 3% CO 2.
- Аспирируйте культуральной среде и осторожно добавляют 5 мл PBS.
- Аспирируйте PBS и добавьте 5 мл свежей среды. Культуры клеток в инкубаторе при температуре 37 &град; С и 5% CO 2 дополнительных 24-48 часов.
- Сбор культуры супернатант, содержащий вирусные частицы, передачи его в 50 мл коническую трубку центрифуги. Комбинат супернатантах от всех блюд и центрифуге при 1500 мкг в течение 5 мин для осаждения клеток и мусора. Фильтры супернатант использованием 0,45 мкм пор по размерам фильтры шприц. Необходимо принять меры для минимизации образования аэрозолей при работе с живым вирусом. Это включает в себя использование конических труб с уплотнительными кольцами ротора или крышки ведра во время центрифугирования шаг. Если это невозможно, колпачки из трубок должен быть заключен парафильмом.
2. Концентрация ВИЧ-1 вирионов ультрацентрифугированием
- Место культуры супернатант (30 мл) в 38,5 мл polyallomer центрифуге трубки (для Бекман SW32Ti ротора или эквивалент). Аккуратно подложки вирусом, содержащим супернатант с 5 мл раствора 20% сахарозы в PBS с помощью 5 мл пипетки.
- Центрифуга течение 3 часов при32000 оборотов в минуту при температуре 4 ° C (175 000 мкг на г макс) для частиц гранул вируса.
- Удалить супернатант аспирацией, стараясь не нарушить гранул в нижней части трубы. Добавить 0,5 мл 1XSTE буфера (10 мМ Трис-HCl [рН 7,4], 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА), чтобы трубу и место при температуре 4 ° С в течение 1 часа, чтобы ослабить гранул. Использование широким отверстием 1 мл пипетки осторожно кончиком пипетки вверх и вниз несколько раз, чтобы отделить осадок со дна трубы. Далее, передача ослабил гранулы для 1,5 трубки микроцентрифужных мл, избегая пенообразования. Инкубируйте при 4 ° С в течение еще 1-3 часов, чтобы позволить небольшие пряди вирус разойтись. В этот период, подготовить градиенте сахарозы, как описано в пункте 3.1.
- Аккуратно пипетки суспензии вируса вверх и вниз несколько раз, и центрифуге при 8000 оборотов в минуту (6000 мкг) при 4 ° С в охлажденном микроцентрифужную в течение 1 мин для удаления остатков сгустки. Держите образец холодной в этом процессе.
3. Сахароза градиентцентрифугирования, чтобы изолировать ядра
ВИЧ-1 ядра выделяли с использованием «спин-через" метод 9, который является модификацией ранее описанного метода для очистки ВИЧ-2 ядер 10.
- Подготовка 12 мл линейного 30% до 70% сахарозы градиент в 1XSTE буфера в 14,5 мл polyallomer центрифуге трубки для SW32.1Ti ротора. Для подготовки градиент, используйте 20 мл градиент первого; место 6 мл 70% раствора сахарозы на ближней стороне (близко к порту розетки) и 6 мл 30% раствора сахарозы на противоположной стороне. Убедитесь, что пузырьки воздуха не попавшие в канал, соединяющий две камеры. Используйте Auto плотностях потока градиента бывшего перекачивать градиентом от основания до вершины трубки, содержащей 1 мл 85% раствора сахарозы в нижней части. Аккуратно градиента при 4 ° С до охлаждения (2-4 часов).
- Использование широким отверстием 1 мл пипетки осторожно кончиком Наложение градиента с 0,25 мл 15% раствора сахарозы в STE, содержащей 1% тритон Х-100. Аккуратно наложения с 0,25 мл 7,5% раствора сахарозы в STE использованием широким отверстием 1 мл пипетки чаевые. Будьте осторожны, чтобы не смешать слои.
- Аккуратно наложения с 0,5 мл суспензии вируса, начиная с шага 2.4. Этот шаг должен быть выполнен тщательно, чтобы избежать каких-либо нарушений в градиент и смешивания слоев, подстилаемые сахарозы.
- Место труб в предварительно охлажденный SW32.1Ti ведро и центрифуге при 32000 оборотов в минуту (187 000 мкг на г макс) в течение ночи (16-20 часов) при 4 ° C. Для того чтобы избежать паузы в центрифуге, не начинайте центрифугирования до вакуума в центрифуге достигает 250 мкм
- Соберите 1 мл фракции сверху вниз градиента использованием автоматического плотностях потока градиента ректификационной колонны. Место труб на льду сразу после сбора. Смешать содержимое труб путем обращения несколько раз, и вывести 50 мкл каждой фракции для количественного ИФА или обратный анализ деятельности транскриптазы.
4. Локализация ВИЧ-1 ядери хранения стержней
- Перед выполнением раздевания анализов, важно определить, какие фракции содержат нетронутыми ВИЧ-1 ядер. Это может быть определено путем p24 ELISA или обратный анализ деятельности транскриптазы использованием 50 мкл аликвоты с шагом 3,6.
- Восстановление CA связанные с ядрами часто связано с устойчивостью ядер. Измерьте основные связанные ЦС, p24 ELISA 9 с использованием выборки из каждой фракции. Кроме того, мера обратной транскриптазы деятельности каждой фракции. Использование обоих методов пик должен быть около фракция 10.
- Бассейн фракций, содержащих ядра. Если ядра не должны использоваться для раздевания анализа немедленно, аликвоту объединения ядер в 0,2 до 0,3 мл аликвоты, флэш-заморозить в жидком N2 и хранить при температуре -80 ° C. Сердечники замороженных таким образом подходят для раздевания анализа. Выход основной связанной CA, как правило, 1-2 мкг на миллилитр p24 или около 15% от общего вириона связанныхp24.
5. Кинетический анализ ВИЧ-1 раздевания
- Количество ВИЧ-1 ядер требуется на раздевания реакции составляет приблизительно 50 нг. Для выполнения анализа в пробирке раздевания, predilute аликвоту ядра с равным объемом холодной 1XSTE буфера для снижения вязкости суспензии и свести к минимуму ошибки пипетирования.
- Далее разбавленный 100 мкл ядер в 0,15 мл холодного буфера 1XSTE, содержащие 10 мкг / мл БСА в 1,5 трубки микроцентрифужных мл. Мы дополним STE буфера с BSA (10 мкг / мл), свести к минимуму адсорбции CA к стенкам трубы. Смешайте путем обращения трубку несколько раз. Не вихрь образцов. Инкубируйте труб в водяной бане при температуре 37 ° С в течение интервалы времени (15, 30, 60 и 120 мин). Трубы должны быть погружены в ванну с водой по крайней мере до уровня внутреннего образца для того, чтобы обеспечить даже потепление.
- Во время инкубации, осторожно перемешать содержимое пробирки периодически (как правило, 5 -10 мин), щелкая трубки. Для нулевой контроль минуты, развести 100 мкл ядер в 0,15 мл холодного буфера 1XSTE и инкубировать на льду в течение всей длине эксперимента (120 мин). Нулевой контроль минуту дает базальной значение раздевания и используется для определения увеличения раздевания ядер инкубируют при 37 ° C для различных определенные интервалы времени.
- В конце инкубационного периода, остановить процесс раздевания, помещая пробирки в лед на 10 минут.
- Центрифуга труб при 45000 оборотов в минуту (TLA-55 ротора; 125000 мкг на г макс.) в течение 20 минут при 4 ° C. Это гранулы нетронутыми ядрами и свободным CA выпустила в результате раздевания ядер останется в супернатант. Ротор должен быть предварительно охлажденном при 4 ° С до загрузки образцов.
- Передача супернатант к новым предварительно охлажденном труб микроцентрифужную желательно с использованием гель-погрузка советы хранить при комнатной температуре. Обратите внимание, что шарик не будет видна невооруженным глазом, так что будьте крайне осторожно Wотя пипетирования из надосадочной жидкости. Ресуспендируют гранул в 250 мкл разбавителя образца ИФА (0,5% Тритон Х-100 и 5% доноров телячьей сыворотки в PBS). Для обеспечения эффективного растворения гранул, вихревые после добавления разбавителя ИФА образца. Количественная CA содержание гранул и супернатант использованием p24 ELISA, как описано в следующем разделе.
- Степень раздевания получено путем вычисления доли CA присутствует в супернатант.
6. Анализ для ЦС, p24 ELISA
- Многие коммерческие наборы ИФА имеются в наличии и может быть использована для количественного CA. Используйте любой коммерческой или "внутренний" ИФА и включают в себя p24 стандартов для определения линейности анализа. Растворы пробы должны быть проанализированы для обеспечения точности.
- Мы разработали домашние ИФА которые мы обычно используем для анализа на СА. Процедура взято из предыдущего доклада 11 и выполняется с использованием детектора захвата и антитела можно получить ПОМОЩИ NIHS исследований и Программа Ссылка реагента.
7. Представитель Результаты:
Примером результате ИФА для определения фракций, содержащих ядро показано на рисунке 1. После сбора фракций (1 мл), 50 мкл пробы из каждой фракции была использована для серийных разведений и проанализированы с помощью ИФА. Общего р24 получен путем добавления значений в течение двенадцати фракций составила 14,5 мкг. Как показано на рисунке фракций от 8 до 10 ядер, содержащихся. P24 значение для ядро-содержащие фракции была 2,17 мкг. Процент основных связанных p24 (14,97%) была определена путем принятия отношение р24 значение для основных фракций (2,17 мкг) на общую стоимость p24 (14,5 мкг). Доля 1 или 2 всегда содержит самое высокое количество p24, что составляет свободное CA, который не связан с ядрами. Это сопровождается постепенным уменьшением значения р24 с каждым последующим дробь, то резкое увеличение и, наконец, резкое падение р24ценностей. Если должного ухода берется при загрузке градиент то пик основных связанных CA находится вокруг фракция 10.
Типичный результат, полученный путем анализа кинетики раздевания ВИЧ-1 ядра показана на рисунке 2. График показывает, зависящих от времени увеличение раздевания дикого типа ВИЧ-1 ядер. Процентов раздевания значение получено путем расчета доли CA присутствует в супернатант. С практикой анализа является высокой воспроизводимостью и полезно для определения стабильности вирусного ядра в пробирке. Обратите внимание, что воспроизводимость анализа во многом зависит от правильной обработки образцов в процессе процедуры. Так как ядра тепла лабильной, образцы должны быть сохранены при 4 ° С в течение анализа, за исключением во время инкубационного периода.
Рисунок 1 Равновесие градиента плотности центрифугированияВИЧ-1 ядер. Концентрированную суспензию вируса применялся в начало 30 до 70% линейный градиент сахарозы с наложением 1% Triton-X-100. После ночь центрифугированием при 187 000 мкг и 4 ° C, 1 мл фракции собирали сверху (доля 1) вниз (доля 12) и p24 был количественно с помощью иммуноферментного анализа.
Рисунок 2 Время течение ВИЧ-1 раздевания в пробирке. Очищенная ВИЧ-1 ядер разводили и инкубировали при 37 ° С для указанных интервалах времени. Нулевой образец мин инкубировали на льду в течение всей длины эксперимента. После инкубации образцы ultracentrifuged на 125 000 мкг в течение 20 минут при 4 ° C. Супернатант и гранулы были отделены и проанализированы p24 ELISA. Степень раздевания определяли, как описано в текст протокола. Каждый раздевания Реакцию проводили в двух экземплярах; погрешности перекрыть диапазон из двух значений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод, описанный здесь, чтобы очистить ВИЧ-1 ядер для изучения раздевания в пробирке полезна для изучения этой стадии ВИЧ-1 жизненного цикла, особенно из-за отсутствия утвержденным методом для анализа на ВИЧ-1 раздевания в клетках-мишенях. Хотя этот метод использует равновесия ультрацентрифугирования, чтобы очистить ядра, другие использовали прямой гранулирования после короткого лизиса с 1% Triton-X-100, 12, 13 или гранулирования через подушку сахарозы обложил 0,1% Triton-X-100, 14, 15.
Восстановление ядер, полученные этим методом подлежит экспериментальной изменчивости. Переменная в успехе этого протокола является эффективность трансфекции. Обычно мы загружаем количество вируса, эквивалентную не менее 7 мкг p24 по градиенту. Наша лаборатория использует трансфекции фосфатом кальция методом вирус производства. Хотя другие методы трансфекции может быть подходящим, мы не оценивали их для изоляции сердечников. Другие важные уагiables, которые влияют на урожайность основных соблюдать осторожность в применении слоев с градиентом и в соответствии образцы холодного. Предельное внимание должно быть принято при подготовке сахарозы градиенты, чтобы избежать смешивания градиента. Любые нарушения при применении концентрированной суспензии вируса может привести к нежелательным и в начале контакта вирионы с моющим средством под слоем сахарозы барьером, такие длительный контакт может распадаться хрупкие ядра и привести к снижению капсида ассоциации. Также не менее важно сохранить градиент плотности сахарозы и холодной суспензии вируса на протяжении всей процедуры. Процедура была освоена и успешно используется многими различными учеными в нашей лаборатории.
ВИЧ-1 ядра термолабильных 4, поэтому, очень важно для фракционирования градиенте сахарозы в то время как холодно и разместить собранных фракций сразу же на льду. После раздевания ядер также зависит от рН и концентрации солей буфера4, это очень желательно для измерения рН STE буфер перед проведением теста. Скорость раздевания может незначительно меняться в зависимости от каждой партии ядер. Раздевания реакции должна быть выполнена в двух экземплярах, и если значения отличаются более чем на 15%, то реакция должна быть выполнена в трех экземплярах до консистенции. Бесплатный CA белка имеет тенденцию придерживаться внутренних стен трубы, поэтому крайне важно, чтобы включить BSA в конечной концентрации 10 мкг / мл в реакционной смеси, чтобы свести к минимуму адсорбции CA к стенкам трубы.
Как упоминалось ранее, раздевания анализа, описанного здесь, может использоваться для выявления и изучения факторов, влияющих на клеточный раздевания. Он также может быть использована для изучения влияния капсида ориентации соединений и клеточных факторов на обратной транскрипции в ядер, использующих эндогенного анализа транскрипции наоборот. Выделение ВИЧ-1 ядер в достаточных количествах может также разрешить анализвзаимодействий с капсида клеточных факторов с помощью микроскопии immunogold электрона.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
ВИЧ-1 раздевания исследования в лаборатории Эйкена были поддержаны грантами NIH AI40364, AI50423 и AI076121. Несколько ключевых материалов, в том числе реагенты, используемые в p24 ELISA, были предоставлены NIH исследований СПИДа и справочные программы, Отдел СПИДа, NIAID, NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| PBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| Triton-X-100 | Mallinckrodt Baker Inc. | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | Acros Organics | 9005-64-5 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Cellgro | 25-053-CI | |
| 2XBBS | Composition: 50mM BES [pH 6.95], 280 mM NaCl and 1.5 mM Na2HPO4. Adjust pH to 6.95 at room temperature. Filter sterilize & store in aliquots at -20°C. | ||
| Coating antibody: Monoclonal antibody to p24 (183-H12-5C) | National Institutes of Health | 3537 | |
| Primary antibody: HIV-Ig (hyperimmune human patient serum) | National Institutes of Health | 3957 | |
Secondary antibody: Goat anti-human IgG, peroxidase conjugated |
Pierce, Thermo Scientific | 31130 | |
| HRP substrate | KPL Inc | 50-76-11 | |
| Immulon 2HB 96 well plates | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3455 | |
| SW32Ti and SW32.1 Ti rotors and compatible ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| TLA-55 rotor and tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| High speed microfuge tubes | Beckman Coulter Inc. | 326823, 358123, 357448 | |
| Auto-Densi Flow density gradient fractionator | Labconco Corp. | 4517000 | |
| Gradient Former | CBS Scientific Co. Inc. | GM-20 | |
References
- Ganser, B. K., Li, S., Klishko, V. Y., Finch, J. T., Sundquist, W. I. Assembly and analysis of conical models for the HIV-1 core. Science. 283, 80-83 (1999).
- Li, S., Hill, C. P., Sundquist, W. I., Finch, J. T. Image reconstructions of helical assemblies of the HIV-1 CA protein. Nature. 407, 409-413 (2000).
- Aiken, C. Viral and cellular factors that regulate HIV-1 uncoating. Curr. Opin. HIV. AIDS. 1, 194-199 (2006).
- Forshey, B. M., Schwedler, U. von, Sundquist, W. I., Aiken, C. Formation of a human immunodeficiency virus type 1 core of optimal stability is crucial for viral replication. J. Virol. 76, 5667-5677 (2002).
- Forshey, B. M., Aiken, C. Disassembly of human immunodeficiency virus type 1 cores in vitro reveals association of Nef with the subviral ribonucleoprotein complex. J. Virol. 77, 4409-4414 (2003).
- Wacharapornin, P., Lauhakirti, D., Auewarakul, P. The effect of capsid mutations on HIV-1 uncoating. Virology. 358, 48-54 (2007).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).
- Aiken, C. Methods in Molecular Biology. Prasad, V. R., Ganjam, K. V. 485, 41-53 (2009).
- Kotov, A., Zhou, J., Flicker, P., Aiken, C. Association of Nef with the human immunodeficiency virus type 1 core. J. Virol. 73, 8824-8830 (1999).
- Kewalramani, V. N., Emerman, M. Vpx association with mature core structures of HIV-2. Virology. 218, 159-168 (1996).
- Wehrly, K., Chesebro, B. p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents. Methods. 12, 288-293 (1997).
- Welker, R., Hohenberg, H., Tessmer, U., Huckhagel, C., Kräusslich, H. G. Biochemical and structural analysis of isolated mature cores of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 74, 1168-1177 (2000).
- Briggs, J. A., Wilk, T., Welker, R., Kräusslich, H. G., Fuller, S. D. Structural organization of authentic, mature HIV-1 virions and cores. EMBO J. 22, 1707-1715 (2003).
- Auewarakul, P., Wacharapornin, P., Srichatrapimuk, S., Chutipongtanate, S., Puthavathana, P. Uncoating of HIV-1 requires cellular activation. Virology. 337, 93-101 (2005).
- Accola, M. A., Ohagen, A., Göttlinger, H. G. Isolation of human immunodeficiency virus type 1 cores: retention of Vpr in the absence of p6(gag. J. Virol. 74, 6198-6202 (2000).
