Summary
Desencapsulamento é um passo essencial na fase inicial do ciclo de vida do HIV-1 e é definido como a desmontagem do shell capsídeo ea liberação do complexo de ribonucleoproteína viral (vRNP). Aqui, nós demonstrar técnicas para isolar núcleos intactos de HIV-1 virions e para quantificar a sua desencapsulamento
Abstract
O genoma do retrovírus é envolto em um capsídeo cercada por um envelope lipídico. Para lentivírus, como o HIV-1, o shell do capsídeo cônica é composto de proteína CA organizados como uma rede de hexágono. O capsídeo é fechada por sete pentamers no final largo e 5 na parte mais estreita do cone 1, 2. Encerradas nesta shell capsídeo é o complexo ribonucleoproteína viral, e juntos eles compõem o núcleo.
Após a fusão da membrana viral com a membrana da célula-alvo, o HIV-1 é liberada no citoplasma. O capsídeo, em seguida, liberando desmonta CA livre na forma solúvel 3 em um processo conhecido como desencapsulamento. A localização intracelular eo calendário de HIV-1 desencapsulamento são mal compreendidos. Único amino-ácido substituições em CA que alteram a estabilidade do capsídeo também prejudicar a capacidade do HIV-1 para infectar as células 4. Isso indica que a estabilidade do capsídeo é crítico para infecção VIH-1. HIV-1 desencapsulamento tem sido difícil de estudar por falta de disponibilidade de ensaios sensíveis e confiáveis para este processo. Aqui nós descrevemos um método quantitativo para o estudo in vitro utilizando desencapsulamento núcleos isolados de HIV-1 infecciosas partículas. A abordagem envolve o isolamento de núcleos por sedimentação de partículas virais concentradas através de uma camada de detergente e em um gradiente de sacarose linear, no frio. Para quantificar desencapsulamento, os núcleos isolados são incubados a 37 ° C para vários intervalos de tempo e posteriormente peletizadas por ultracentrifugação. A extensão da desencapsulamento é analisada pela quantificação da fração do CA no sobrenadante. Esta abordagem tem sido empregada para analisar os efeitos das mutações virais do HIV-1 estabilidade capsídeo 4, 5, 6. Deve também ser útil para estudar o papel dos fatores celulares em HIV-1 desencapsulamento.
Protocol
1. Produção de partículas de HIV-1
Antes de prosseguir, você deve obter a permissão e siga as orientações do escritório de Biossegurança da sua instituição para trabalhar em uma instalação de biossegurança aprovado para HIV infecciosas. Você deve garantir que a atenção adequada e precauções de segurança são seguidas durante a trabalhar no laboratório de biossegurança.
Produção de partículas de HIV-1 é normalmente realizada por transfecção transiente de células 293T com HIV-1 DNA proviral utilizando um método de transfecção de fosfato de cálcio 7, 8. Estoques altos títulos de vírus cresceu em cultura de células T infectadas também são adequados.
- Cultura 293T células Modified Dulbecco Eagle Medium (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e suplementadas com antibióticos [penicilina (100 UI / ml) e estreptomicina (100 mg / ml)], a 37 ° C CO, 5% 2 .
- Separar células de pratos quase confluentes com 0,25% tripsina-EDTA e sementes de 2x10 6
- No dia seguinte, a monocamadas de células deve ser de cerca de 25% confluentes e pronto para transfecção. Por seis pratos de células a serem transfectadas, trazer 120 mg de DNA proviral até um volume de 2,7 ml com água estéril. Para esta mistura adicione 0,3 ml de 2,5 M CaCl 2 e 3 ml de 2XBBS, e misture bem por pipetagem cima e para baixo várias vezes. Deixe a mistura descansar em temperatura ambiente por 10-20 minutos.
- Adicionar 1 ml da mistura resultante gotas para o centro de cada prato enquanto agita suavemente para misturar. Coloque os pratos durante a noite (~ 16 horas) em um conjunto de incubadora a 35 ° C e 3% CO 2.
- Aspirar o meio de cultura e gentilmente adicionar 5 ml de PBS.
- Aspirar PBS e adicionar 5 ml de meio fresco. Cultura das células na incubadora a 37 edeg; C e 5% de CO 2 para adicional de 24-48 horas.
- Recolher o sobrenadante de cultura contendo partículas virais, transferi-lo para um tubo de centrífuga 50 ml. Combine os sobrenadantes de todos os pratos e centrifugar a 1.500 xg por 5 min para as células pellet e detritos. Filtrar o sobrenadante usando 0,45 mM filtros de poros de tamanho da seringa. Devem ser tomadas precauções para minimizar a formação de aerossóis durante o trabalho com o vírus vivo. Isso inclui o uso de tubos cônicos com O-rings ou tampas balde rotor durante a etapa de centrifugação. Se isso não for possível, as tampas dos tubos deve ser envolvido com parafilme.
2. Concentração de HIV-1 virions por ultracentrifugação
- Coloque o sobrenadante da cultura (30 ml) em um tubo de centrífuga 38,5 ml polyallomer (para rotor Beckman SW32Ti ou equivalente). Suavemente underlay o sobrenadante contendo vírus com 5 ml de solução de sacarose 20% em PBS usando uma pipeta de 5 ml.
- Centrifugar por 3 horas a32.000 rpm a 4 ° C (175.000 xg em r max) de partículas do vírus da pelota.
- Retire o sobrenadante por aspiração, tomando cuidado para não perturbar o pellet no fundo do tubo. Adicionar 0,5 ml de tampão 1XSTE (10 mM Tris-HCl [pH 7,4], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) para o tubo e colocar a 4 ° C por 1 hora para soltar o pellet. Usando um wide-bore uma ponta da pipeta pipeta suavemente ml cima e para baixo algumas vezes para retirar o sedimento do fundo do tubo. Em seguida, transferir o pellet afrouxou a um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, tendo o cuidado de evitar a formação de espuma. Incubar a 4 ° C por mais de 1-3 horas para permitir que os pequenos aglomerados de vírus para dispersar. Durante esse período, prepare o gradiente de sacarose como descrito no passo 3.1.
- Pipeta suavemente a suspensão de vírus para cima e para baixo várias vezes e centrifugar a 8.000 rpm (6.000 xg) a 4 ° C em microcentrífuga refrigerada por 1 min para remover aglomerados residual. Manter o frio da amostra durante este processo.
3. Gradiente de sacarosecentrifugação para isolar núcleos
HIV-1 núcleos estão isolados utilizando um "spin-thru" método 9, que é uma modificação do método descrito anteriormente para a purificação de HIV-2 núcleos 10.
- Prepare um gradiente de sacarose 12 ml linear de 30% a 70% em tampão 1XSTE em um tubo de centrífuga 14,5 ml polyallomer para SW32.1Ti rotor. Para preparar gradiente, use um gradiente de 20 ml anterior; lugar 6 ml da solução de sacarose 70% no lado mais próximo (perto da porta de saída) e 6 ml da solução de sacarose 30% do outro lado. Certifique-se que as bolhas de ar não são presos no canal que liga as duas câmaras. Use o Auto gradiente DENSI Flow-ex para bombear o gradiente de baixo para cima do tubo contendo 1 ml da solução de sacarose 85% na parte inferior. Delicadamente, coloque o gradiente de temperatura de 4 ° C até refrigerado (2-4 horas).
- Usando um wide-bore uma ponta da pipeta ml suavemente o gradiente overlay com 0,25 ml da solução de sacarose 15% em STE contendo 1% Triton X-100. Suavemente sobreposição com 0,25 ml da solução de sacarose 7,5% em STE usando um wide-bore uma ponta da pipeta ml. Tenha cuidado para não misturar as camadas.
- Suavemente sobreposição com 0,5 ml de suspensão de vírus a partir do passo 2.4. Esta etapa deve ser realizada com cuidado para evitar qualquer perturbação no gradiente e mistura das camadas de sacarose underlaid.
- Coloque os tubos no balde SW32.1Ti pré-resfriado e centrifugar a 32.000 rpm (187.000 xg em r max) durante a noite (16-20 horas) a 4 ° C. Para evitar a pausa da centrífuga, não comece a centrifugação até o vácuo na centrífuga chega a 250 mM
- Colete 1 ml frações de cima para baixo do gradiente usando o gradiente de fraccionamento da Auto-DENSI-Flow. Coloque os tubos em gelo imediatamente após a coleta. Misturar o conteúdo dos tubos por inversão várias vezes, e retirar 50 ul de cada fração para a quantificação por ELISA ou ensaio de atividade da transcriptase reversa.
4. Localização de núcleos de HIV-1e armazenamento de núcleos
- Antes de realizar ensaios desencapsulamento, é importante para determinar quais frações contêm intacta HIV-1 núcleos. Isto pode ser determinado por ELISA p24 ou ensaio de atividade da transcriptase reversa usando os 50 mL alíquotas a partir do passo 3.6.
- A recuperação da CA associado com os núcleos é muitas vezes relacionada com a estabilidade dos núcleos. Medir o núcleo associado CA por ELISA p24 9, utilizando uma amostra de cada fração. Alternativamente, medir a atividade da transcriptase reversa de cada fração. Usando ambos os métodos o pico deve ser em torno fração 10.
- Piscina as frações contendo núcleos. Se os núcleos não devem ser usadas para desencapsulamento ensaio imediatamente, alíquota dos núcleos reunidos em 0,2-0,3 ml alíquotas, flash freeze-em N2 líquido e armazenar a -80 ° C. Núcleos congelados desta forma são adequados para o ensaio desencapsulamento. O rendimento do CA-core é tipicamente associada 1-2 mcg por mililitro de p24 ou cerca de 15% do total virion-associadop24.
5. Ensaio de cinética de HIV-1 desencapsulamento
- A quantidade de HIV-1 núcleos necessária por reação desencapsulamento é de aproximadamente 50 ng. Para executar o ensaio in vitro desencapsulamento, Pré-diluir a alíquota de núcleos com um volume igual de tampão 1XSTE frio para reduzir a viscosidade da suspensão e para minimizar os erros de pipetagem.
- Diluir ainda mais 100 ul dos núcleos em 0,15 ml de tampão 1XSTE frio contendo 10 mg / ml de BSA em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Nós complementar o tampão STE com BSA (10 mg / ml) para minimizar a adsorção do CA para as paredes do tubo. Misture por vezes invertendo o tubo várias. Não vortex as amostras. Incubar os tubos em banho-maria a 37 ° C por intervalos de tempo (15, 30, 60 e 120 min). Os tubos devem ser imersas em banho de água pelo menos até o nível da amostra interna a fim de garantir até mesmo o aquecimento.
- Durante a incubação, misture suavemente o conteúdo do tubo periodicamente (normalmente 5 -10 min) por um movimento súbito do tubo. Para um controle minuto zero, diluir 100 ml de núcleos em 0,15 ml de tampão 1XSTE frio e incubar no gelo por todo o comprimento do experimento (120 min). O controle minuto zero dá o valor desencapsulamento basal e é usado para determinar aumento de desencapsulamento de núcleos incubados a 37 ° C por diferentes intervalos de tempo.
- No final do período de incubação, parar o processo de desencapsulamento colocando os tubos em gelo durante 10 minutos.
- Centrifugar os tubos a 45.000 rpm (TLA-55 rotor; 125.000 xg em r max) por 20 minutos a 4 ° C. Isto pellet núcleos intactos e os CA livre liberado como resultado de desencapsulamento de núcleos permanecerão no sobrenadante. O rotor deve ser pré-resfriada a 4 ° C antes de carregar as amostras.
- Transfira o sobrenadante para novos tubos de microcentrífuga pré-resfriada de preferência usando gel-carregamento dicas armazenados em temperatura ambiente. Por favor, note que o pellet não será visível a olho nu, por isso tome cuidado extremo wnquanto pipetagem fora o sobrenadante. Volte a suspender as pellets em 250 mL de ELISA diluente de amostra (0,5% Triton X-100 e 5% dos doadores soro bovino em PBS). Para garantir a dissolução eficiente do pellet, vortex após adicionar o diluente de amostra ELISA. Quantificar o conteúdo de CA do pellet e sobrenadante usando ELISA p24 como descrito na seção seguinte.
- A extensão da desencapsulamento é obtido através do cálculo da fração de CA presentes no sobrenadante.
6. Ensaio para a CA por ELISA p24
- Muitos kits comerciais ELISA estão disponíveis e podem ser usados para quantificar CA. Usar qualquer comercial ou "in-house" ELISA e incluem padrões p24 para determinar a linearidade do ensaio. Diluições das amostras devem ser testados para garantir a precisão.
- Temos desenvolvido um ELISA caseiros que usam rotineiramente para ensaio para CA. O procedimento é adaptado de um relatório anterior 11 e é realizada utilizando detector de captura e anticorpos disponível a partir de AID NIHS Programa de Pesquisa e de reagente de referência.
7. Resultados representativos:
Um exemplo de um resultado de ELISA para determinar frações contendo núcleo é mostrado na Figura 1. Após a coleta de frações (1 ml cada), 50 mL de amostra de cada fração foi usada para fazer diluições seriadas e analisados por ELISA. O p24 total obtido somando os valores de doze frações foi de 14,5 mg. Como mostrado nas frações figura 8 a 10 núcleos contidos. O valor para as frações p24-core contendo 2,17 mg foi. A porcentagem de núcleos associados p24 (14,97%) foi determinado tendo a relação de valor para as frações p24 core (2,17 mg) para o valor total p24 (14,5 mg). Fração 1 ou 2 conterá sempre maior quantidade de p24, o que representa CA livre que não está associado com os núcleos. Isto é seguido por uma redução gradual nos valores de p24 com cada fração subseqüente, em seguida, um aumento acentuado e, finalmente, uma gota afiada no p24valores. Se é bom tomar cuidado ao carregar o gradiente, em seguida, o pico de core-associados da CA é encontrado em torno fração 10.
Um resultado típico obtido através do ensaio de cinética de desencapsulamento de HIV-1 núcleos é mostrado na Figura 2. O gráfico mostra um aumento tempo-dependente em desencapsulamento de tipo selvagem HIV-1 núcleos. O percentual desencapsulamento valor foi obtido através do cálculo da fração de CA presentes no sobrenadante. Com a prática, o ensaio é altamente reprodutível e é útil para determinar a estabilidade dos núcleos viral in vitro. Por favor, note que a reprodutibilidade do ensaio é altamente dependente do tratamento adequado das amostras durante o procedimento. Uma vez que os núcleos são instáveis o calor, as amostras devem ser mantidas a 4 ° C durante todo o ensaio, exceto durante o período de incubação.
Figura 1 Equilibrium centrifugação em gradiente de densidade deHIV-1 núcleos. A suspensão de vírus concentrado foi aplicado para o topo de um gradiente de sacarose 30 a 70% linear coberta com 1% Triton-X-100. Após centrifugação durante a noite a 187.000 xg e 4 ° C, 1 ml foram coletadas frações de cima (Fração 1) para baixo (Fração 12) e p24 foi quantificada por ELISA.
Figura 2 curso Hora do HIV-1 desencapsulamento in vitro. Purificada HIV-1 núcleos foram diluídos e incubados a 37 ° C para os intervalos de tempo indicado. A amostra min zero foi incubado em gelo por todo o comprimento do experimento. Após a incubação, as amostras foram ultracentrifugadas em 125.000 xg por 20 minutos a 4 ° C. Sobrenadante e pelotas foram separados e analisados por ELISA p24. A extensão da desencapsulamento foi determinada conforme descrito no texto do protocolo. Cada reação desencapsulamento foi realizada em duplicata; barras de erro abrange a gama dos dois valores.
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Discussion
O método descrito aqui para purificar HIV-1 núcleos para estudar desencapsulamento in vitro é útil para estudar esta fase do ciclo de vida do HIV-1, especialmente devido à indisponibilidade de um método validado para analisar HIV-1 desencapsulamento em células-alvo. Embora este método usa ultracentrifugação equilíbrio para purificar núcleos, outros autores utilizaram a peletização direta após lise breve com 1% Triton X-100-12, 13 ou peletização através de uma almofada de sacarose sobrepostas com 0,1% Triton X-100-14, 15.
A recuperação de núcleos obtidos por este método está sujeito a variação experimental. Uma variável no sucesso deste protocolo é a eficiência de transfecção. Normalmente nós carregamos uma quantidade de vírus equivalente a pelo menos 7 mg de p24 no gradiente. Nosso laboratório usa um método de transfecção de fosfato de cálcio para a produção de vírus. Enquanto os métodos de transfecção também podem ser adequados, não tenham avaliado los para o isolamento de núcleos. Var outros importantesiables que influenciam o rendimento do núcleo são o cuidado na aplicação das camadas para o gradiente e em manter as amostras de frio. Maior cuidado deve ser tomado ao preparar gradientes de sacarose para evitar a mistura de gradiente. Qualquer perturbação ao aplicar a suspensão de vírus concentrado podem levar a contato indesejado e início dos vírions com detergente abaixo da camada de sacarose barreira; contato prolongado como pode quebrar os núcleos frágeis e levarão à redução do capsídeo associação. Também é igualmente importante para manter o gradiente de densidade de sacarose eo frio suspensão de vírus em todo o processo. O procedimento foi dominado e usado com sucesso por muitos cientistas diferentes em nosso laboratório.
HIV-1 núcleos são termicamente lábil 4 e, portanto, é muito importante para gradiente de sacarose fracionar o tempo está frio e colocar as fracções recolhidas imediatamente em gelo. Desde desencapsulamento de núcleos também é dependente do pH e da concentração de sal do buffer4, é altamente aconselhável para medir o pH de tampão STE antes de começar o ensaio. A taxa de desencapsulamento podem variar ligeiramente com cada lote de núcleos. Desencapsulamento reações devem ser realizadas em duplicata, e se os valores diferem em mais de 15%, então as reações devem ser realizados em triplicado até a consistência é alcançado. Livre de proteína CA tem uma tendência a ficar com as paredes internas dos tubos, por isso é imperativo incluir BSA na concentração final de 10 mcg / ml na mistura de reação para minimizar a adsorção do CA para as paredes dos tubos.
Como mencionado anteriormente, o ensaio desencapsulamento descritos aqui podem ser usadas para identificar e estudar os fatores que afetam celulares desencapsulamento. Também pode ser usado para estudar o efeito do capsídeo compostos alvo e fatores de celular na transcrição reversa em núcleos usando um ensaio de transcrição reversa endógena. Isolamento do HIV-1 cores em quantidade suficiente também pode permitir a análisedas interações do capsídeo com fatores de celular por imuno microscopia eletrônica.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
HIV-1 desencapsulamento estudos em laboratório Aiken foram apoiados pelo NIH concede AI40364, AI50423 e AI076121. Vários materiais-chave, incluindo reagentes utilizados na ELISA p24, foram fornecidos pelo NIH AIDS Programa de Pesquisa e Referência, da Divisão de AIDS, NIAID, NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| PBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| Triton-X-100 | Mallinckrodt Baker Inc. | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | Acros Organics | 9005-64-5 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Cellgro | 25-053-CI | |
| 2XBBS | Composition: 50mM BES [pH 6.95], 280 mM NaCl and 1.5 mM Na2HPO4. Adjust pH to 6.95 at room temperature. Filter sterilize & store in aliquots at -20°C. | ||
| Coating antibody: Monoclonal antibody to p24 (183-H12-5C) | National Institutes of Health | 3537 | |
| Primary antibody: HIV-Ig (hyperimmune human patient serum) | National Institutes of Health | 3957 | |
Secondary antibody: Goat anti-human IgG, peroxidase conjugated |
Pierce, Thermo Scientific | 31130 | |
| HRP substrate | KPL Inc | 50-76-11 | |
| Immulon 2HB 96 well plates | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3455 | |
| SW32Ti and SW32.1 Ti rotors and compatible ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| TLA-55 rotor and tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| High speed microfuge tubes | Beckman Coulter Inc. | 326823, 358123, 357448 | |
| Auto-Densi Flow density gradient fractionator | Labconco Corp. | 4517000 | |
| Gradient Former | CBS Scientific Co. Inc. | GM-20 | |
References
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