Summary
Uncoating HIV-1 yaşam döngüsünün ilk aşamasında önemli bir adım ve kapsid kabuk sökülmesi ve viral ribonükleoprotein kompleksi (vRNP) serbest bırakılması olarak tanımlanır. Burada, HIV-1 virionlar sağlam çekirdek tecrit ve bunların uncoating ölçülmesi için teknikleri göstermek
Abstract
Retrovirüsler genom lipid bir zarf tarafından çevrili bir kapsid kaplı. HIV-1 olarak lentiviruses için altıgen bir kafes olarak düzenlenmiştir CA protein, konik kapsid kabuk oluşur. Kapsid dar sonunda koni 1, 2, 7 pentamers geniş sonunda ve 5 kapalı . Bu kapsid kabuk kaplı viral ribonükleoprotein kompleksi ve birlikte çekirdek oluşturur.
HIV-1, hedef hücre zarı ile viral membran füzyonu takiben, sitoplazmaya salınır. Kapsid sonra uncoating olarak adlandırılan bir süreç içinde çözünür formu 3 CA serbest bırakmadan sökülebilir. HIV-1 uncoating hücre içi konumu ve zamanlama tam olarak anlaşılamamıştır. Kapsid istikrarı değiştirmez CA Tek amino asit yer değiştirmelerin hücreleri 4 bulaştırmak için de HIV-1 yeteneğini bozar. Bu kapsid istikrarı HIV-1 enfeksiyonu için kritik olduğunu gösterir. HIV-1 uncoating Bu işlem için duyarlı ve güvenilir testlerin mevcudiyeti eksikliği nedeniyle çalışma zor olmuştur. Burada bulaşıcı HIV-1 parçacıkları izole çekirdeği kullanılarak in vitro uncoating çalışmak için kantitatif bir yöntem açıklanmaktadır. Yaklaşımı soğuk, deterjan ve doğrusal bir sukroz gradient katmanı üzerinden konsantre virionlar sedimentasyon çekirdek izolasyonu içerir. Uncoating ölçmek için, izole çekirdek 37 inkübe ° C çeşitli zaman aralıklarında ve Ultrasantrifügasyon tarafından sonradan pelet. Uncoating kapsamı süpernatantı CA kısmını nicel analiz edilir. Bu yaklaşım, HIV-1 kapsid istikrar 4, 5, 6 viral mutasyonların etkilerini analiz etmek için istihdam edilmiştir . Ayrıca HIV-1 uncoating hücresel faktörlerin rol çalışmak için yararlı olacaktır.
Protocol
1. HIV-1 parçacıkların üretimi
Devam etmeden önce, izin almak gerekir ve bulaşıcı HIV için onaylanmış bir biyogüvenlik tesisinde çalışmak üzere kurum Biyogüvenlik ofis yönergeleri izleyin. Bunu uygun bakım sağlamak ve biyogüvenlik laboratuar çalışma sırasında güvenlik önlemleri takip edilmektedir.
HIV-1 parçacıkların üretimi genellikle kalsiyum fosfat transfeksiyon yöntemi 7, 8 ile HIV-1 proviral DNA ile 293T hücrelerinde geçici transfeksiyon tarafından yapılır. Bulaşmış T hücrelerinin kültürü ile yetişen yüksek titresi virüs hisse senetleri de uygundur.
- % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve antibiyotik ile desteklenmiş içeren Dulbecco'nun Modifiye Kartal Medium (DMEM) Kültür 293T hücreleri [Penisilin (100 IU / ml) ve Streptomisin (100 mg / ml)] 37 ° C,% 5 CO 2 .
- % 0.25 'lik tripsin-EDTA ve tohum 2x10 6 kullanarak yaklaşık konfluent yemekleri hücreleri Ayır
- Ertesi gün, hücre mono tabakaları yaklaşık% 25 konfluent ve transfeksiyon için hazır olmalıdır. Transfekte hücreleri altı yemekleri için, 2.7 ml steril su ile hacmi 120 mikrogram proviral DNA getirmek. Bu karışımı 0.3 ml 2.5 M CaCl 2 ve 2XBBS 3 ml ekleyin ve birkaç kez aşağı yukarı pipetleme düzgün karıştırın. Karışımı 10-20 dakika oda sıcaklığında bekletin.
- Karıştırmak için hafifçe dönen her yemeğin merkezine çıkan karışımı damla damla 1 ml ekleyin. Inkübatör 35 ° C ve% 3 CO 2 set gecede yemekler (~ 16 saat) yerleştirin.
- Kültür ortamı aspire edin ve hafifçe 5 ml PBS ekleyin.
- PBS aspire edin ve 5 ml taze orta ekleyin. 37 ve inkübatörde Kültür hücrelerideg C ve% 5 ek 24-48 saat için 2 CO.
- Viral parçacıkların bulunduğu kültür süpernatant toplayın, 50 ml konik santrifüj tüpüne aktarın. Tüm yemekler süpernatantlar birleştirin ve pelet hücreleri ve enkaz 5 dakika boyunca 1.500 xg'de santrifüj. 0.45 mikron gözenek boyutu şırınga filtreleri kullanarak süpernatantı Filtresi. Önlemler canlı virüs ile çalışırken aerosol oluşumunu en aza indirmek için önlemler alınmalıdır. Bu santrifüj basamağı sırasında O-ring veya rotor kova kapakları ile konik tüplerin kullanımını içerir. Bu mümkün değilse, tüpler, vidalı kapakları parafilm ile sarılmalıdır.
2. HIV-1 virionlar Ultrasantrifügasyon konsantrasyonu
- Kültür süpernatant 38.5 ml polyallomer santrifüj tüpüne (Beckman SW32Ti rotor veya eşdeğeri) (30 ml) koyun. 5 ml, 5 ml pipetlemeyin kullanarak PBS içinde% 20 sukroz solüsyonu ile virüs içeren süpernatant hafifçe altında yatan.
- 3 saat santrifüj32.000 rpm, 4 ° C (r max 175.000 xg) pelet virüs partikülleri.
- Tüpün dibinde pelet rahatsız etmemek için özen, aspirasyon ile süpernatantı. 0.5 ml 1XSTE tamponu (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA), 4 tüp ve yere ° C'de 1 saat pelet gevşetmek için. Hafifçe pipetlemeyin yukarı ve aşağı birkaç kez tüp alt pelet ayırmak için geniş çaplı bir 1 ml pipetlemeyin ucu kullanma. Sonraki köpük önlemek için özen gevşetti pelet, 1,5 ml mikrosantrifüj tüp transferi. Küçük öbekler virüs dağıtmak için izin vermek için başka bir 1-3 saat için 4 ° C'de inkübe edin. Bu dönemde, sukroz gradient adım 3.1 'de açıklandığı gibi hazırlayın.
- Yavaşça pipetlemeyin virüs süspansiyon yukarı ve aşağı birkaç kez ve 8,000 rpm (6.000 xg), 4 ° C, 1 dakika boyunca buzdolabında mikrofuge'de santrifüj kalan kümeleri kaldırın. Bu işlem sırasında numune soğuk tutun.
3. Sakkaroz degradeçekirdek izole için santrifüj
HIV-1 çekirdekleri HIV-2 çekirdek (10) arıtma için daha önce açıklanan yöntemi bir değişiklik bir "spin-thru" yöntemi 9 kullanılarak izole edilmiştir.
- 14.5 ml polyallomer SW32.1Ti rotor için bir santrifüj tüpüne 12 ml 1XSTE tampon doğrusal% 30 -% 70 sukroz gradient hazırlayın. Degrade hazırlamak için, eski bir 20 ml degrade kullanmak; yakın tarafında yer% 70 sakaroz çözeltisini 6 ml (çıkış bağlantı noktasına yakın) ve uzak tarafında% 30 sakaroz çözeltisini 6 ml. Hava kabarcıkları, iki odadan birbirine bağlayan kanal kapana kısılmış olmadığından emin olun. Otomatik alttan 1 ml% 85 sakaroz çözeltisini altta içeren tüpün üst degrade pompa eski yoğunlukları Akış degrade kullanın. Yavaşça 4 degrade ° C soğutmalı kadar (2-4 saat).
- Geniş çaplı bir 1 ml pipetlemeyin ucu kullanarak hafifçe 0.25 ml,% 15 sakaroz çözeltisini ile% 1 Triton X-100 içeren STE gradient overlay. Geniş çaplı bir 1 ml pipetlemeyin ucu kullanarak STE% 7.5 sakaroz çözeltisini 0.25 ml yavaşça kaplaması. Katmanları karıştırmak için dikkatli olun.
- Adım 2.4 'ten 0.5 ml virus süspansiyonu ile yavaşça bindirme. Bu adım, herhangi bir degrade bozukluğu ve underlaid sakaroz katmanları karıştırma önlemek için dikkatli bir şekilde yapılmalıdır.
- 4 gecede 32.000 rpm (r max 187.000 xg) (16-20 saat) önceden soğutulmuş SW32.1Ti kova ve santrifüj ° C tüpler yerleştirin Santrifüj vakum 250 mikron ulaşıncaya kadar santrifüj duraklamadan önlemek için, santrifüj başlamayın
- 1 ml üstten Otomatik yoğunlukları Akış degrade parçalama kullanarak degrade alt fraksiyonları toplayın. Toplama üzerine tüpler hemen buz koyun. Tüplerin içeriği tersini birkaç kez karıştırın ve ELISA veya ters transkriptaz aktivite assay ölçümü için her bir fraksiyonu 50 ul çekilme.
4. HIV-1 çekirdek yerelleştirilmesive çekirdek depolama
- Uncoating testleri yapmadan önce, bu kesirler sağlam HIV-1 çekirdek içeren belirlemek için önemlidir. Bu p24 ELISA veya ters transkriptaz aktivite assay adım 3.6 50 ul alikotları kullanarak tespit edilebilir.
- Çekirdeği ile ilişkili CA kurtarma genellikle çekirdek istikrar ile ilgili. P24 ELISA 9 her fraksiyon bir örnek kullanarak çekirdek ilişkili CA ölçün. Alternatif olarak, her bir fraksiyonu ters transkriptaz aktivitesini ölçmek. Her iki yöntem kullanılarak zirveye fraksiyonu 10 civarında olmalıdır.
- Çekirdek içeren fraksiyonları Havuzu. Çekirdek içine toplanmış çekirdek, 0,2 - 0,3 ml alikotları -80 sıvı N2 ve mağaza flaş dondurucu ° C hemen kısım tahlil uncoating için kullanılacak değilse Bu şekilde dondurulmuş Çekirdek uncoating tayini için uygundur. Çekirdek ilişkili CA verimi genellikle p24 mililitrede 1-2 mg veya yaklaşık% 15 toplam virion ilişkilip24.
5. HIV-1 uncoating Kinetik tahlil
- Uncoating reaksiyon başına gerekli HIV-1 çekirdek miktarı yaklaşık 50 ng. In vitro uncoating tayininde gerçekleştirmek için, süspansiyonun viskozitesini azaltmak için çekirdek kısım soğuk 1XSTE tampon eşit hacimde seyreltme ve pipetleme hataları en aza indirmek için.
- Ayrıca, 0.15 ml, 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içinde 10 mcg / ml BSA içeren soğuk 1XSTE tampon çekirdek 100 ul sulandırmak. Biz tüpün duvarlarına CA adsorpsiyonu en aza indirmek için, BSA (10 mg / ml) ile STE tampon tamamlar. Tersine tüp birkaç kez karıştırın. Örnekleri girdap etmeyin. 37 az bir su banyosunda tüpleri ° C'de zaman aralıklarında (15, 30, 60 ve 120 dk). Tüpler hatta ısınma sağlamak için en azından iç örnek düzeyde su banyosuna daldırılmış olmalıdır.
- İnkübasyon sırasında, yavaşça (genellikle 5 periyodik tüp içeriği karıştırmakTüp Flicking 10 dk). Sıfır dakika kontrolü için, 0.15 ml soğuk 1XSTE tampon içine çekirdek 100 ul sulandırmak ve tüm uzunluğu (120 dk) deney için buz üzerinde inkübe. Sıfır dakika kontrolünde bazal uncoating değeri verir ve 37 ° C farklı zaman aralıklarında inkübe çekirdeği, uncoating artışı belirlemek için kullanılır.
- Kuluçka döneminin sonunda, tüpler 10 dakika boyunca buz koyarak uncoating işlemini durdurmak.
- 45.000 rpm (TLA-55 rotor; r maksimum 125.000 xg) tüpler Santrifüj az 20 dakika süreyle 4 ° C Bu pelet çekirdek uncoating bir sonucu olarak piyasaya sağlam bir çekirdek ve serbest CA süpernatantı kalacaktır. Rotor, 4 ° C örnekleri önce yükleme precooled olmalıdır.
- Tercihen oda sıcaklığında saklanan jel yükleme ipuçları kullanarak yeni precooled mikrofuge'ye tüpleri süpernatantı aktarın. Pelet çıplak gözle görülebilen olmayacağını lütfen unutmayın, bu yüzden, çok dikkatli wsüpernatantı pipetleme hile. ELISA örnek seyreltici (PBS içinde% 0.5 Triton X-100 ve 5% Donör buzağı serumu) 250 ul pelet tekrar ELISA örnek seyreltici ekledikten sonra pelet etkin bir şekilde çözülmesini, vorteks sağlamak. Aşağıdaki bölümde açıklandığı gibi p24 ELISA kullanarak pelet ve süpernatant CA içerik sayısal olmalıdır.
- Uncoating kapsamı süpernatantı CA kesir hesaplanması ile elde edilir.
6. P24 ELISA yöntemi ile CA Testi
- Birçok ticari ELISA kitleri mevcuttur ve CA ölçmek için kullanılabilir. Kullanın ve herhangi bir ticari veya "in-house" ELISA testinin doğrusallık belirlemek için p24 standartları içerir. Numunelerin çözeltiler doğruluğunu sağlamak için çalışılmalıdır.
- Biz rutin CA için tahlil için kullanabileceğiniz bir ev yapımı ELISA yöntemi geliştirdik. Prosedür, bir önceki rapordan 11 uyarlanmıştır ve NIH YARDIM edinilebilir yakalama ve dedektör antikorlar kullanılarak yapılırS Araştırma ve Referans Reaktif Programı.
7. Temsilcisi Sonuçlar:
ELISA sonucu çekirdek içeren fraksiyonları belirlemek için bir örnek Şekil 1'de gösterilmiştir. Fraksiyonları (1 ml) topladıktan sonra, her bir fraksiyonu 50 ul örnek seri dilüsyonları yapmak için kullanılır ve ELISA yöntemi ile analiz edilmiştir. Oniki kesirler değerler ekleyerek elde edilen toplam p24 14.5 mikrogram oldu. Rakam kesirler 8 ile 10 çekirdeği içerdiği gösterilmiştir. Çekirdek içeren fraksiyonlar için p24 değeri 2.17 mg. Çekirdek kesirler için p24 değeri oranı (2.17 mcg), toplam p24 değeri (14.5 mikrogram) alarak çekirdek ilişkili p24 yüzdesi (% 14.97) tespit edildi. Kesir 1 veya 2, p24, her zaman yüksek miktarda içerir; bu çekirdek ile ilişkili değildir ücretsiz CA temsil eder. Bu, sonraki her fraksiyonu ile p24 değerleri kademeli olarak azaltılması, sonra keskin bir artış ve p24 nihayet keskin bir düşüş takip ediyordeğerleri. Degrade yüklenirken uygun bakım alınırsa sonra çekirdek ilişkili CA zirve fraksiyonu 10 civarında bulunmuştur.
HIV-1 çekirdek uncoating kinetiği assaying elde edilen tipik bir sonucu Şekil 2'de gösterilmiştir. Grafik, yabani tip HIV-1 çekirdek uncoating bir zamana bağımlı bir artış gösterir. Süpernatantı CA kesir hesaplanmak suretiyle yüzde uncoating değeri elde edildi. Uygulama ile, testin yüksek tekrarlanabilir ve in vitro olarak viral çekirdek istikrar belirlemek için yararlıdır. Testin tekrarlanabilirliği, işlem sırasında örneklerin uygun taşıma son derece bağımlı olduğunu lütfen unutmayınız. Çekirdek ısıya dayanıksız olduğundan, örnekleri ° C tahlil boyunca kuluçka dönemi sırasında dışında 4 muhafaza edilmelidir.
Şekil 1 Denge yoğunluk gradiyenti santrifüjHIV-1 çekirdek. % 1 Triton X-100 ile üst üste% 30 ila% 70 doğrusal sukroz gradient üst konsantre bir virüs süspansiyonu uygulandı. 187.000 xg ve 4 geceleme santrifüj sonrasında ° C, 1 ml kesirler yukarıdan aşağıya (Kesir 1) (Kesir 12) toplandı ve p24 ELISA yöntemi ile belirlendi.
In vitro HIV-1 uncoating 2 Saat dersin Şekil. Saflaştırılmış HIV-1 çekirdekleri ° C belirtilen zaman aralıkları için seyreltilmiş ve 37 saat inkübe edildi. Sıfır min örnek deney tamamı boyunca buz üzerinde inkübe edildi. Inkübasyon sonrasında, örnekler 4 ° C'de 20 dakika boyunca 125.000 xg'de ultra santrifüje edildi Süpernatant ve pelet p24 ELISA ile ayrılmış ve analiz edildi. Protokol metninde açıklandığı gibi uncoating bir ölçüde tespit edildi. Her uncoating tepki yinelenen yapıldı; hata çubuklarını iki değer aralığına yayılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yöntem, hedef hücreleri, HIV-1 uncoating analiz etmek için geçerli bir yöntem olmaması nedeniyle bu aşamada, HIV-1 yaşam döngüsü eğitimi için yararlı in vitro uncoating çalışmada HIV-1 çekirdek arındırmak için buraya nitelendirdi. Bu yöntem, çekirdek arındırmak için denge Ultrasantrifügasyon kullanıyor olsa da, diğerleri ile kısa Parçalama işleminden sonra doğrudan peletleme kullandık% 1 Triton X-100, 12, 13 ya da% 0,1 Triton X-100, 14, 15 ile üst üste sakaroz yastık yoluyla peletleme.
Bu yöntem ile elde edilen çekirdek kurtarma deneysel varyasyonu bağlıdır. Bu protokolün başarı değişken transfeksiyon verimliliği. Genelde en az 7 mg degrade p24, eşdeğer bir miktar virüs yükleyin. Laboratuvarımız, virüs üretimi için bir kalsiyum fosfat transfeksiyon yöntemi kullanır. Ederken, diğer transfeksiyon yöntemleri de uygun olabilir, biz onları çekirdek izolasyonu için değerlendirilir değil. Diğer önemli bir varçekirdek verimi etkileyen iables degrade katmanları uygulayarak ve örnekleri soğuk tutarak alınan bakım. Sakaroz gradyanlar hazırlarken Degrade karışmasını önlemek için azami dikkat edilmelidir. Konsantre virüs süspansiyonu uygulanması sırasında herhangi bir rahatsızlık bariyer sakaroz tabakası altında deterjan ile virionlar istenmeyen ve erken temas neden olabilir; gibi uzun süreli temas kırılgan çekirdeği parçalanmak ve azaltılmış kapsid dernek yol açabilir. Bu işlem boyunca sakaroz yoğunluk gradiyenti ve virüs süspansiyonu soğuk tutmak için de eşit derecede önemlidir. Bu prosedür birçok farklı bilim adamları tarafından laboratuvarda hakim ve başarılı olmuştur.
HIV-1 çekirdek 4 ısıya duyarlı; bu nedenle, soğuk ve buz üzerinde hemen toplanan fraksiyonları ise sukroz gradient damıtmak için çok önemlidir. Çekirdek uncoating da tampon pH ve tuz konsantrasyonu bağımlı olduğundan4 testi ile devam etmeden önce STE tampon pH ölçümü için son derece tavsiye edilir . Uncoating oranı biraz çekirdek her parti ile değişebilir. Uncoating reaksiyonlar yinelenen ve değerler% 15 den fazla farklı ise kıvam elde edilinceye kadar, sonra reaksiyonları üç nüsha halinde olmalıdır. Ücretsiz CA protein tüplerin iç duvarları ayrılmamak için bir eğilim vardır, bu nedenle tüplerin duvarları CA adsorpsiyonu en aza indirmek için reaksiyon karışımı nihai konsantrasyonu 10 mg / ml BSA dahil etmek zorunludur.
Daha önce de belirtildiği gibi, uncoating tahlil burada açıklanan hücresel uncoating etkileyen faktörleri belirlemek ve çalışma için kullanılabilir. Ayrıca endojen bir ters transkripsiyon deneyi ile çekirdek ters transkripsiyon kapsid hedefleme bileşikler ve hücresel faktörlerin etkisini araştırmak için de kullanılıyor olabilir. Yeterli miktarda HIV-1 çekirdek İzolasyon da analiz izin verebilirkapsid immunogold elektron mikroskobu ile hücresel faktörler ile etkileşimleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
HIV-1 Aiken laboratuvar uncoating çalışmalar NIH hibe AI40364 AI50423 ve AI076121 tarafından desteklenmiştir. P24 ELISA kullanılan reaktifler de dahil olmak üzere birçok önemli malzemeler, NIH AIDS Araştırma ve Referans Programı, AIDS Bölümü, NIAID, NIH tarafından verilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| PBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| Triton-X-100 | Mallinckrodt Baker Inc. | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | Acros Organics | 9005-64-5 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Cellgro | 25-053-CI | |
| 2XBBS | Composition: 50mM BES [pH 6.95], 280 mM NaCl and 1.5 mM Na2HPO4. Adjust pH to 6.95 at room temperature. Filter sterilize & store in aliquots at -20°C. | ||
| Coating antibody: Monoclonal antibody to p24 (183-H12-5C) | National Institutes of Health | 3537 | |
| Primary antibody: HIV-Ig (hyperimmune human patient serum) | National Institutes of Health | 3957 | |
Secondary antibody: Goat anti-human IgG, peroxidase conjugated |
Pierce, Thermo Scientific | 31130 | |
| HRP substrate | KPL Inc | 50-76-11 | |
| Immulon 2HB 96 well plates | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3455 | |
| SW32Ti and SW32.1 Ti rotors and compatible ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| TLA-55 rotor and tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| High speed microfuge tubes | Beckman Coulter Inc. | 326823, 358123, 357448 | |
| Auto-Densi Flow density gradient fractionator | Labconco Corp. | 4517000 | |
| Gradient Former | CBS Scientific Co. Inc. | GM-20 | |
References
- Ganser, B. K., Li, S., Klishko, V. Y., Finch, J. T., Sundquist, W. I. Assembly and analysis of conical models for the HIV-1 core. Science. 283, 80-83 (1999).
- Li, S., Hill, C. P., Sundquist, W. I., Finch, J. T. Image reconstructions of helical assemblies of the HIV-1 CA protein. Nature. 407, 409-413 (2000).
- Aiken, C. Viral and cellular factors that regulate HIV-1 uncoating. Curr. Opin. HIV. AIDS. 1, 194-199 (2006).
- Forshey, B. M., Schwedler, U. von, Sundquist, W. I., Aiken, C. Formation of a human immunodeficiency virus type 1 core of optimal stability is crucial for viral replication. J. Virol. 76, 5667-5677 (2002).
- Forshey, B. M., Aiken, C. Disassembly of human immunodeficiency virus type 1 cores in vitro reveals association of Nef with the subviral ribonucleoprotein complex. J. Virol. 77, 4409-4414 (2003).
- Wacharapornin, P., Lauhakirti, D., Auewarakul, P. The effect of capsid mutations on HIV-1 uncoating. Virology. 358, 48-54 (2007).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).
- Aiken, C. Methods in Molecular Biology. Prasad, V. R., Ganjam, K. V. 485, 41-53 (2009).
- Kotov, A., Zhou, J., Flicker, P., Aiken, C. Association of Nef with the human immunodeficiency virus type 1 core. J. Virol. 73, 8824-8830 (1999).
- Kewalramani, V. N., Emerman, M. Vpx association with mature core structures of HIV-2. Virology. 218, 159-168 (1996).
- Wehrly, K., Chesebro, B. p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents. Methods. 12, 288-293 (1997).
- Welker, R., Hohenberg, H., Tessmer, U., Huckhagel, C., Kräusslich, H. G. Biochemical and structural analysis of isolated mature cores of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 74, 1168-1177 (2000).
- Briggs, J. A., Wilk, T., Welker, R., Kräusslich, H. G., Fuller, S. D. Structural organization of authentic, mature HIV-1 virions and cores. EMBO J. 22, 1707-1715 (2003).
- Auewarakul, P., Wacharapornin, P., Srichatrapimuk, S., Chutipongtanate, S., Puthavathana, P. Uncoating of HIV-1 requires cellular activation. Virology. 337, 93-101 (2005).
- Accola, M. A., Ohagen, A., Göttlinger, H. G. Isolation of human immunodeficiency virus type 1 cores: retention of Vpr in the absence of p6(gag. J. Virol. 74, 6198-6202 (2000).
