Summary
Uncoating er et viktig skritt i den tidlige fasen av HIV-1 livssyklus og er definert som demontering av kapsid skallet og utgivelsen av viral ribonucleoprotein kompleks (vRNP). Her demonstrerer vi teknikker for å isolere intakt kjerner fra HIV-1 virioner og for å kvantifisere deres uncoating
Abstract
Genomet av retrovirus er innkapslet i en kapsid omgitt av en lipid konvolutt. For lentiviruses, slik som HIV-1, er konisk kapsid skallet består av CA protein arrangert som et gitter av sekskant. Den kapsid er lukket med syv pentamers på den brede enden og 5 på den smale enden av en kjegle, 2. Innkapslet i denne kapsid skallet er viral ribonucleoprotein komplekse, og sammen utgjør kjernen.
Etter fusjon av viral membran med målet cellemembranen, er HIV-1 slippes ut i cytoplasma. Kapsid så demonterer slippe fri CA i oppløselig form 3 i en prosess omtales som uncoating. Den intracellulære plassering og tidspunkt for HIV-1 uncoating er dårlig forstått. Enkelt amino-syre substitusjoner i CA som endrer stabiliteten i kapsid også svekke evnen til HIV-1 til å infisere celler fire. Dette indikerer at stabiliteten i kapsid er kritisk for HIV-1 infeksjon. HIV-1 uncoating har vært vanskelig å studere på grunn av manglende tilgjengelighet av sensitive og pålitelige analyser for denne prosessen. Her beskriver vi en kvantitativ metode for å studere uncoating in vitro bruk kjerner isolert fra smittsomme HIV-1 partikler. Tilnærmingen innebærer isolering av kjerner av sedimentering av konsentrert virioner gjennom et lag av vaskemiddel og inn i en lineær sukrose gradient, i kulden. Å kvantifisere uncoating, er de isolerte kjerner inkubert ved 37 ° C for ulike tidsinnstilte intervaller og senere pelleterte av ultracentrifugation. Omfanget av uncoating er analysert av kvantifisere brøkdel av CA i supernatanten. Denne tilnærmingen har blitt ansatt for å analysere effekten av viral mutasjoner i HIV-1 kapsid stabilitet 4, 5, 6. Det bør også være nyttig for å studere rollen av cellulære faktorer i HIV-1 uncoating.
Protocol
1. Produksjon av HIV-1 partikler
Før du fortsetter, må du innhente tillatelse og følge retningslinjene fra Biosafety kontoret institusjon for å arbeide i et biosikkerhet anlegg godkjent for smittsomme HIV. Du må sørge for at riktig stell og sikkerhetsreglene følges under arbeider i biosikkerhet laboratoriet.
Produksjon av HIV-1 partikler er vanligvis utføres av transient transfeksjon av 293T celler med HIV-1 proviral DNA ved hjelp av en kalsiumfosfat transfeksjon metode 7, 8. Høy titer virus bestanden vokst med kultur av infiserte T-celler er også egnet.
- Kultur 293T celler i Dulbecco modifiserte Eagle Medium (DMEM) inneholder 10% fetal bovint serum (FBS) og supplert med antibiotika [Penicillin (100 IE / ml) og Streptomycin (100 mikrogram / ml)] ved 37 ° C, 5% CO 2 .
- Løsner celler fra nesten confluent retter med 0,25% Trypsin-EDTA og frø 2x10 6
- På den neste dagen, bør cellen monolayers være ca 25% confluent og klar for transfeksjon. For seks retter av celler til å være transfektert, ta 120 mikrogram proviral DNA opp til et volum på 2,7 ml med sterilt vann. Til denne blandingen legge 0,3 ml 2,5 M CaCl 2 og 3 ml 2XBBS, og bland ordentlig ved pipettering opp og ned flere ganger. La blandingen stå i romtemperatur i 10-20 minutter.
- Tilsett 1 ml av den resulterende blandingen dropwise til midten av hver tallerken mens virvlende forsiktig å blande. Plasser retter natten (~ 16 timer) i en inkubator innstilt på 35 ° C og 3% CO 2.
- Aspirer kultur medium og tilsett 5 ml PBS.
- Aspirer PBS og tilsett 5 ml av frisk medium. Kultur cellene i inkubator ved 37 &grader, C og 5% CO 2 for ytterligere 24-48 timer.
- Samle kultur supernatanten som inneholder viruspartikler, overføre den til en 50 ml konisk sentrifugerør. Kombiner supernatants fra alle retter og sentrifuger ved 1500 xg i 5 min til pellet celler og rusk. Filter supernatanten med 0,45 mikrometer pore-size sprøyte filtre. Forholdsregler bør tas for å minimere aerosol dannelse mens du arbeider med levende virus. Dette inkluderer bruk av koniske rør med O-ringer eller rotor bøtte dekker under sentrifugering trinnet. Hvis dette ikke er mulig, bør skrulokk av rørene være pakket med Parafilm.
2. Konsentrasjon av HIV-1 virioner av ultracentrifugation
- Plasser kultur supernatanten (30 ml) i en 38,5 ml polyallomer sentrifugerør (for Beckman SW32Ti rotor eller tilsvarende). Forsiktig underlag viruset inneholder supernatanten med 5 ml løsning av 20% sukrose i PBS med en 5 ml pipette.
- Sentrifuger i 3 timer ved32 000 rpm ved 4 ° C (175 000 xg ved r max) til pellet viruspartikler.
- Fjern supernatanten ved aspirasjon, ta vare for ikke å forstyrre pellet i bunnen av røret. Tilsett 0,5 ml 1XSTE buffer (10 mM Tris-HCl [pH 7,4], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) til røret og legg ved 4 ° C i 1 time å løsne pellet. Ved hjelp av en bred-boring 1 ml pipette tip forsiktig pipettér opp og ned noen ganger for å løsne pellet fra bunnen av røret. Deretter overfører løsnet pellet til et 1,5 ml mikrosentrifuge tube, ta vare å unngå skumdannelse. Inkuber ved 4 ° C i ytterligere 1-3 timer for å la de små klumper av virus å spre. I denne perioden forberede sukrose gradient som beskrevet i trinn 3.1.
- Forsiktig pipettér viruset suspensjonen opp og ned flere ganger og sentrifuger ved 8000 rpm (6000 xg) ved 4 ° C i en nedkjølt microfuge for 1 min å fjerne rester av klumper. Hold prøven kaldt under denne prosessen.
3. Sukrose gradientsentrifugering å isolere kjerner
HIV-1 kjernene er isolert ved hjelp av en "spin-thru" metoden 9 som er en endring av tidligere beskrevet metode for rensing av HIV-2 kjerner 10.
- Tilbered en 12 ml lineær 30% til 70% sukrose gradient i 1XSTE buffer i en 14,5 ml polyallomer sentrifugerør for SW32.1Ti rotor. For å forberede gradient, kan du bruke en 20 ml gradient tidligere; sted 6 ml av 70% sukrose løsning på nær side (nær utløpet port) og 6 ml 30% sukroseløsning på yttersida. Sørg for at luftbobler ikke er fanget i kanalen forbinder de to kamre. Bruk Auto Densi-Flow gradient tidligere å pumpe gradient fra bunnen til toppen av tuben inneholder 1 ml av 85% sukroseløsning nederst. Påfør gradient ved 4 ° C inntil avkjølt (2-4 timer).
- Ved hjelp av en bred-boring 1 ml pipette spissen forsiktig overlay gradient med 0,25 ml av 15% sukroseløsning i STE inneholder 1% Triton X-100. Forsiktig overlay med 0,25 ml 7,5% sukroseløsning i STE å bruke et bredt-boring 1 ml pipettér spissen. Vær forsiktig med å blande lagene.
- Forsiktig overlay med 0,5 ml virus suspensjon fra trinn 2.4. Dette trinnet bør gjøres forsiktig for å unngå forstyrrelser i gradient og blanding av underlaid sukrose lagene.
- Plasser rørene i pre-avkjølt SW32.1Ti bøtte og sentrifuger 32000 rpm (187 000 xg ved r max) over natten (16-20 timer) ved 4 ° C. For å unngå pause av sentrifugen, ikke starte sentrifugering før vakuum i sentrifugen når 250 mikrometer
- Samle 1 ml fraksjoner fra topp til bunn på graderingen bruke Auto-Densi-Flow gradient fractionator. Sett rørene på is umiddelbart etter samlingen. Bland innholdet i rørene ved å snu noen ganger, og trekke 50 mL av hver fraksjon for kvantifisering av ELISA eller revers transkriptase aktivitet analysen.
Fire. Lokalisering av HIV-1 kjernerog lagring av kjerner
- Før du utfører uncoating analyser, er det viktig å finne ut hvilke fraksjoner inneholder intakt HIV-1 kjerner. Dette kan bestemmes ved p24 ELISA eller revers transkriptase aktivitet assay bruker 50 mL alikvoter fra trinn 3.6.
- Gjenvinning av CA forbundet med kjerner er ofte knyttet til stabiliteten av kjernene. Mål kjernen tilhørende CA av p24 ELISA 9 bruker en prøve fra hver fraksjon. Alternativt kan måle reverstranskriptase aktiviteten til hver fraksjon. Bruk begge metoder toppen bør være rundt brøkdel 10.
- Pool de fraksjoner som inneholder kjerner. Hvis kjernene skal ikke brukes for uncoating analysen umiddelbart, alikvoter den samlede kjernene i 0,2 til 0,3 ml alikvoter, flash-fryse i flytende N2 og oppbevar ved -80 ° C. Kjerner frosset på denne måten er egnet for uncoating analysen. Utbyttet av kjernen-assosiert CA er vanligvis 1-2 mikrogram av p24 per milliliter eller omtrent 15% av det totale virion-assosiertp24.
5. Kinetic analysen av HIV-1 uncoating
- Mengden av hiv-1 kjerner kreves per uncoating reaksjon er ca 50 ng. Å utføre in vitro uncoating analysen, predilute den delmengde av kjerner med et likt volum av kulde 1XSTE buffer for å redusere viskositeten på fjæringen og minimere pipettering feil.
- Videre fortynne 100 mL av kjernene til 0,15 ml kaldt 1XSTE buffer som inneholder 10 mikrogram / ml BSA i en 1,5 ml mikrosentrifuge tube. Vi supplere STE buffer med BSA (10 mikrogram / ml) for å minimalisere adsorpsjon av CA til veggene i røret. Bland ved å snu røret flere ganger. Ikke vortex prøvene. Inkuber rørene i vannbad ved 37 ° C for tidsinnstilte intervaller (15, 30, 60 og 120 min). Rørene skal være nedsenket i vannbad minst opp til nivået på den interne prøven i for å sikre jevn oppvarming.
- Under rugingen, forsiktig blande innholdet i røret periodisk (vanligvis 5 -10 min) ved flicking røret. For en null minutt kontroll, fortynn 100 mL av kjerner i 0,15 ml kaldt 1XSTE buffer og inkuberes på is for hele lengden av eksperimentet (120 min). Null minutt kontroll gir basal uncoating verdi og brukes til å bestemme økning i uncoating av kjerner inkubert ved 37 ° C for ulike tidsinnstilte intervaller.
- På slutten av inkubasjonstiden, stoppe uncoating prosessen ved å legge rørene i isen i 10 minutter.
- Sentrifuger rørene ved 45 000 rpm (TLA-55 rotor; 125000 xg ved r max) i 20 minutter ved 4 ° C. Dette vil pellet det intakte kjerner og den frie CA utgitt som et resultat av uncoating av kjerner vil forbli i supernatanten. Rotoren skal precooled ved 4 ° C før lasting prøvene.
- Overfør supernatanten til nytt precooled microfuge rør fortrinnsvis bruker gel-loading tips oppbevares ved romtemperatur. Vær oppmerksom på at pellets vil ikke være synlig for det blotte øye, så ta ekstrem forsiktighet while pipettering ut supernatant. Resuspender pellets i 250 mL av ELISA prøve fortynning (0,5% Triton X-100 og 5% Donor kalv serum i PBS). For å sikre effektiv oppløsning av pellets, vortex etter tilsetting av ELISA prøve fortynning. Kvantifisere CA innholdet i pellet og supernatanten bruker p24 ELISA som beskrevet i følgende avsnitt.
- Omfanget av uncoating oppnås ved å beregne brøkdel av CA stede i supernatanten.
Seks. Assay for CA av p24 ELISA
- Mange kommersielle ELISA kits er tilgjengelige og kan brukes til å kvantifisere CA. Bruk noen kommersielle eller "in-house" ELISA og inkluderer p24 standarder for å bestemme linearitet av analysen. Fortynninger av prøvene bør analyseres for å sikre nøyaktighet.
- Vi har utviklet en hjemmelaget ELISA som vi rutinemessig bruke til analysen for CA. Prosedyren er tilpasset fra en tidligere rapport 11 og er utført ved hjelp av fangst og detektor antistoffer tilgjengelig fra NIH AIDS Forskning og Reference Reagens Program.
7. Representant Resultater:
Et eksempel på et resultat fra ELISA for å bestemme fraksjoner som inneholder kjernen er vist i figur 1. Etter samle fraksjoner (1 ml hver), ble 50 mL av prøven fra hver brøkdel brukes til å lage seriefortynning og analysert med ELISA. Den totale p24 oppnås ved å legge til verdiene for tolv fraksjoner var 14,5 mikrogram. Som vist i figuren fraksjonene 8-10 inneholdt kjerner. Den p24 verdi for kjerne-holdige fraksjoner var 2,17 mikrogram. Prosentandelen av kjerne-assosiert p24 (14,97%) ble fastsatt ved å ta forholdet p24 verdi for kjernen fraksjonene (2,17 mg) til den totale p24 verdien (14,5 mikrogram). Fraksjon 1 eller 2 vil alltid inneholde høyeste beløpet av p24; dette representerer gratis CA som ikke er forbundet med kjerner. Dette er etterfulgt av en gradvis reduksjon i p24 verdier med hver etterfølgende fraksjon, deretter en kraftig økning og til slutt et kraftig fall i p24verdier. Hvis skikkelig omsorg er tatt under innlasting av gradient da toppen av kjerne-assosierte CA er funnet rundt brøkdel 10.
Et typisk resultat oppnås ved å analysere kinetikken av uncoating av HIV-1 kjerner er vist i figur 2. Grafen viser en tidsavhengig økning i uncoating av vill-typen HIV-1 kjerner. Den prosent uncoating verdi var oppnådd ved å beregne brøkdel av CA stede i supernatanten. Med praksis, er analysen svært reproduserbare og er nyttig for å bestemme stabiliteten av viral kjerner in vitro. Vær oppmerksom på at reproduserbarheten av analysen er svært avhengig av riktig håndtering av prøvene under prosedyren. Siden kjernene er varmen labile, bør prøvene opprettholdes ved 4 ° C gjennom hele analysen unntatt i inkubasjonstiden.
Figur 1 Equilibrium density gradient sentrifugering avHIV-1 kjerner. En konsentrert virus suspensjon ble brukt på toppen av en 30 til 70% lineær sukrose gradient kledde med 1% Triton-X-100. Etter natten sentrifugering på 187 000 xg og 4 ° C ble 1 ml fraksjoner samlet inn fra toppen (Brøk 1) til bunnen (Fraction 12) og p24 ble kvantifisert ved ELISA.
Figur 2 Tid løpet av HIV-1 uncoating in vitro. Renset HIV-1 kjernene var utvannet og inkubert ved 37 ° C for den angitte tidsintervaller. Null min prøven ble inkubert på is for hele lengden av eksperimentet. Etter inkubering ble prøvene ultrasentrifugeres på 125 000 xg i 20 minutter ved 4 ° C. Supernatanten og pellets ble separert og analysert av p24 ELISA. Omfanget av uncoating ble bestemt som beskrevet i protokollen teksten. Hver uncoating reaksjonen ble utført i to eksemplarer; feilfelt span rekkevidden av de to verdiene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden som beskrives her for å rense HIV-1 kjerner for å studere uncoating in vitro er nyttig for å studere denne fasen av HIV-1 livssyklus, spesielt på grunn av utilgjengelighet av en validert metode for å analysere HIV-1 uncoating i målcellene. Selv om denne metoden bruker likevekt ultracentrifugation å rense kjerner, andre har brukt direkte pelletering etter kort lysis med 1% Triton-X-100 12, 13 eller pelletering gjennom en sukrose pute kledde med 0,1% Triton-X-100 14, 15.
Gjenvinning av kjernene oppnådd ved denne metoden er gjenstand for eksperimentell variasjon. En variabel i suksessen til denne protokollen er transfeksjon effektivitet. Vanligvis legger vi inn en mengde av virus som tilsvarer minst 7 mikrogram av p24 på gradient. Vårt laboratorium benytter en kalsiumfosfat transfeksjon metode for virus produksjon. Mens andre transfeksjon metoder kan også være egnet, har vi ikke evaluert dem for isolering av kjerner. Andre viktige variables som påvirker kjernen yield er omsorg tatt i bruk av lag til gradient og i tråd prøvene kald. Ytterste forsiktighet må utvises ved utarbeidelse sukrose gradienter for å unngå blanding av gradient. Enhver forstyrrelse ved bruk av konsentrert viruset suspensjon kan føre til uønsket og tidlig kontakt mellom virioner med vaskemiddel under barrieren sukrose lag; slik langvarig kontakt kan brekke i stykker skjøre kjerner og føre til redusert kapsid foreningen. Det er også like viktig å holde sukrose tettshetsgradient og viruset suspensjon kaldt gjennom hele prosedyren. Prosedyren har blitt mastret og med hell brukes av mange forskjellige forskere i vårt laboratorium.
HIV-1 kjernene er varme-labile 4, og derfor er det svært viktig å fraksjonerer den sukrose gradient mens det er kaldt og å plassere de innsamlede fraksjonene umiddelbart på is. Siden uncoating av kjerner er også avhengig av pH og salt konsentrasjonen av buffer4, er det svært gunstig å måle pH STE buffer før du fortsetter med analysen. Frekvensen av uncoating kan lett variere med hvert parti av kjerner. Uncoating reaksjoner bør utføres i to eksemplarer, og hvis verdiene avviker med mer enn 15%, så reaksjonene skal utføres i tre eksemplarer til konsistensen er oppnådd. Gratis CA protein har en tendens til å holde seg til innsiden av veggene rørene, derfor er det viktig å inkludere BSA på en endelig konsentrasjon på 10 mikrogram / ml i reaksjonsblandingen å minimalisere adsorpsjon av CA til veggene i rørene.
Som nevnt tidligere, beskrev uncoating analysen her kan brukes til å identifisere og studere cellulære faktorer som påvirker uncoating. Det kan også brukes til å studere effekten av kapsid rettet forbindelser og cellulære faktorer på revers transkripsjon i kjerner med en endogen revers transkripsjon analysen. Isolering av HIV-1 kjerner i tilstrekkelige mengder kan også tillate analysenav interaksjoner av kapsid med cellulære faktorer ved immunogold elektronmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
HIV-1 uncoating studier i Aiken laboratoriet ble støttet av NIH stipend AI40364, AI50423 og AI076121. Flere viktige materialer, inkludert reagenser brukt i p24 ELISA, ble gitt av NIH AIDS Research and Reference Program, Division of AIDS, NIAID, NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| PBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| Triton-X-100 | Mallinckrodt Baker Inc. | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | Acros Organics | 9005-64-5 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Cellgro | 25-053-CI | |
| 2XBBS | Composition: 50mM BES [pH 6.95], 280 mM NaCl and 1.5 mM Na2HPO4. Adjust pH to 6.95 at room temperature. Filter sterilize & store in aliquots at -20°C. | ||
| Coating antibody: Monoclonal antibody to p24 (183-H12-5C) | National Institutes of Health | 3537 | |
| Primary antibody: HIV-Ig (hyperimmune human patient serum) | National Institutes of Health | 3957 | |
Secondary antibody: Goat anti-human IgG, peroxidase conjugated |
Pierce, Thermo Scientific | 31130 | |
| HRP substrate | KPL Inc | 50-76-11 | |
| Immulon 2HB 96 well plates | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3455 | |
| SW32Ti and SW32.1 Ti rotors and compatible ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| TLA-55 rotor and tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| High speed microfuge tubes | Beckman Coulter Inc. | 326823, 358123, 357448 | |
| Auto-Densi Flow density gradient fractionator | Labconco Corp. | 4517000 | |
| Gradient Former | CBS Scientific Co. Inc. | GM-20 | |
References
- Ganser, B. K., Li, S., Klishko, V. Y., Finch, J. T., Sundquist, W. I. Assembly and analysis of conical models for the HIV-1 core. Science. 283, 80-83 (1999).
- Li, S., Hill, C. P., Sundquist, W. I., Finch, J. T. Image reconstructions of helical assemblies of the HIV-1 CA protein. Nature. 407, 409-413 (2000).
- Aiken, C. Viral and cellular factors that regulate HIV-1 uncoating. Curr. Opin. HIV. AIDS. 1, 194-199 (2006).
- Forshey, B. M., Schwedler, U. von, Sundquist, W. I., Aiken, C. Formation of a human immunodeficiency virus type 1 core of optimal stability is crucial for viral replication. J. Virol. 76, 5667-5677 (2002).
- Forshey, B. M., Aiken, C. Disassembly of human immunodeficiency virus type 1 cores in vitro reveals association of Nef with the subviral ribonucleoprotein complex. J. Virol. 77, 4409-4414 (2003).
- Wacharapornin, P., Lauhakirti, D., Auewarakul, P. The effect of capsid mutations on HIV-1 uncoating. Virology. 358, 48-54 (2007).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).
- Aiken, C. Methods in Molecular Biology. Prasad, V. R., Ganjam, K. V. 485, 41-53 (2009).
- Kotov, A., Zhou, J., Flicker, P., Aiken, C. Association of Nef with the human immunodeficiency virus type 1 core. J. Virol. 73, 8824-8830 (1999).
- Kewalramani, V. N., Emerman, M. Vpx association with mature core structures of HIV-2. Virology. 218, 159-168 (1996).
- Wehrly, K., Chesebro, B. p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents. Methods. 12, 288-293 (1997).
- Welker, R., Hohenberg, H., Tessmer, U., Huckhagel, C., Kräusslich, H. G. Biochemical and structural analysis of isolated mature cores of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 74, 1168-1177 (2000).
- Briggs, J. A., Wilk, T., Welker, R., Kräusslich, H. G., Fuller, S. D. Structural organization of authentic, mature HIV-1 virions and cores. EMBO J. 22, 1707-1715 (2003).
- Auewarakul, P., Wacharapornin, P., Srichatrapimuk, S., Chutipongtanate, S., Puthavathana, P. Uncoating of HIV-1 requires cellular activation. Virology. 337, 93-101 (2005).
- Accola, M. A., Ohagen, A., Göttlinger, H. G. Isolation of human immunodeficiency virus type 1 cores: retention of Vpr in the absence of p6(gag. J. Virol. 74, 6198-6202 (2000).
