Summary
Uncoating er et væsentligt skridt i den tidlige fase af HIV-1 livscyklus og er defineret som demonteringen af kapsid skallen og frigivelsen af den virale ribonucleoprotein kompleks (vRNP). Her vil vi demonstrere teknikker til at isolere intakte kerner fra HIV-1 virioner og til at kvantificere deres uncoating
Abstract
Genomet i retrovira er indkapslet i en kapsid omgivet af en lipid kuvert. For lentiviruses, såsom HIV-1, er den koniske kapsid skallen består af CA protein arrangeret som et gitter af sekskant. Den kapsid er lukket med 7 pentamers ved den brede ende og 5 på den smalle ende af keglen 1, 2. Indkapslet i denne kapsid Shell er den virale ribonucleoprotein komplekse, og sammen udgør de kernen.
Efter fusion af det virale membran med målet cellemembranen, er HIV-1 frigives til cytoplasma. Den kapsid Derefter disassembles slippe fri CA i opløselig form 3 i en proces kaldet uncoating. Den intracellulære placering og timing af HIV-1 uncoating er dårligt forstået. Single amino-syre udskiftninger i CA, der ændrer den stabilitet kapsid også gøre det sværere for HIV-1 til at inficere celler 4. Dette indikerer, at stabiliteten af kapsid er kritisk for HIV-1 infektion. HIV-1 uncoating har det været vanskeligt at studere på grund af manglende adgang til følsomme og pålidelige assays til denne proces. Her beskriver vi en kvantitativ metode til at studere uncoating in vitro med kerner isoleret fra smitsom HIV-1-partikler. Den tilgang indebærer isolering af kerner ved sedimentation af koncentreret virioner gennem et lag af vaskemiddel og ind i en lineær saccharose gradient, i kulden. For at kvantificere uncoating, er den isolerede kerner inkuberes ved 37 ° C for forskellige timede intervaller og efterfølgende piller ved ultracentrifugering. Omfanget af uncoating analyseres ved at kvantificere den fraktion af CA i supernatant. Denne tilgang har været ansat til at analysere effekten af viral mutationer på HIV-1 kapsid stabilitet 4, 5, 6. Det bør også være nyttigt for undersøgelser af betydningen af cellulære faktorer i HIV-1 uncoating.
Protocol
1. Produktion af HIV-1-partikler
Før du fortsætter, skal du have tilladelse og følger retningslinjerne fra biosikkerhed kontor din institution for at arbejde i et biosikkerhed, der er godkendt for smitsomme hiv. Du skal sikre, at ordentlig pleje og sikkerhedsforanstaltninger følges i arbejdstiden i biosikkerhed laboratoriet.
Produktion af HIV-1-partikler er typisk udføres af transient transfektion af 293T celler med HIV-1 proviralt DNA ved hjælp af en calciumphosphat transfektion metode 7, 8. Høj titer virus lagre vokset ved dyrkning af inficerede T-celler er også velegnede.
- Kultur 293T celler i Dulbecco ændrede Eagle Medium (DMEM) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) og suppleret med antibiotika [penicillin (100 IU / ml) og streptomycin (100 mg / ml)] ved 37 ° C, 5% CO 2 .
- Frigør celler fra næsten sammenflydende retter med 0,25% trypsin-EDTA og frø 2x10 6
- På den næste dag, bør den celle monolag være omkring 25% sammenflydende og klar til transfektion. For seks retter af celler, der skal transficeret, at 120 mikrogram proviralt DNA op til et volumen på 2,7 ml med sterilt vand. Til denne blanding tilsættes 0,3 ml af 2,5 M CaCl 2 og 3 ml 2XBBS, og bland korrekt ved pipettering op og ned flere gange. Lad blandingen stå ved stuetemperatur i 10-20 minutter.
- Tilsæt 1 ml af blandingen dråbevis til midten af hver tallerken, mens hvirvlende forsigtigt for at blande. Placer retter natten (~ 16 timer) i en inkubator indstillet på 35 ° C og 3% CO 2.
- Aspirer dyrkningsmediet og forsigtigt tilsættes 5 ml PBS.
- Aspirér PBS og der tilsættes 5 ml frisk medium. Kultur cellerne i inkubator ved 37 &grader, C og 5% CO 2 for yderligere 24-48 timer.
- Saml kultur supernatant, der indeholder viruspartikler, overføre det til en 50 ml konisk centrifugeglas. Kombiner supernatanter fra alle retter, og der centrifugeres ved 1500 xg i 5 min til pellet celler og snavs. Filtrer supernatanten med 0,45 μm pore-størrelse sprøjte filtre. Der skal tages forholdsregler for at minimere aerosoldannelse, mens du arbejder med levende virus. Dette omfatter brug af koniske rør med O-ringe eller rotor spand dækker under centrifugering. Hvis dette ikke er muligt, bør skruepropper af rørene pakkes med parafilm.
2. Koncentration af HIV-1 virioner ved ultracentrifugering
- Placer kultur supernatant (30 ml) i en 38,5 ml polyallomer centrifugeglas (for Beckman SW32Ti rotor eller tilsvarende). Forsigtigt underlag virus indeholdende supernatanten med 5 ml opløsning af 20% saccharose i PBS ved hjælp af en 5 ml pipette.
- Centrifuger i 3 timer ved32.000 rpm ved 4 ° C (175.000 xg ved r max) for at pellet viruspartikler.
- Fjern supernatanten ved aspiration, pas på ikke at forstyrre pellet i bunden af røret. Tilsæt 0,5 ml 1XSTE buffer (10 mM Tris-HCl [pH 7,4], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) til røret og den anbringes ved 4 ° C i 1 time for at løsne pellet. Ved hjælp af en bred boring 1 ml pipette spids blidt pipette op og ned et par gange for at frigøre pellet fra bunden af røret. Dernæst overfører den løsnede pille til et 1,5 ml mikrocentrifugerør, idet man undgår skumning. Der inkuberes ved 4 ° C for en anden 1-3 timer at lade de små klumper af virus til at sprede. I denne periode, forberede saccharose gradient som beskrevet i trin 3.1.
- Forsigtigt pipette de virussuspension op og ned flere gange og centrifugeres ved 8.000 rpm (6.000 xg) ved 4 ° C i et nedkølet mikrofuger i 1 min for at fjerne resterende klumper. Hold prøven kold under denne proces.
3. Saccharose gradientcentrifugering for at isolere kerner
HIV-1-kerner er isoleret ved hjælp af en "spin-thru" metode 9, der er en ændring af de tidligere beskrevne metode til rensning af HIV-2 kerner 10.
- Forbered en 12 ml lineær 30% til 70% saccharose gradient i 1XSTE buffer i en 14,5 ml polyallomer centrifugeglas for SW32.1Ti rotor. At forberede gradient, brug en 20 ml gradient tidligere; sted 6 ml 70% saccharose løsning på den nærmeste side (tæt på udgangsporten) og 6 ml 30% rørsukkeropløsning på den anden side. Sørg for, at luftbobler ikke er fanget i den kanal, der forbinder de to kamre. Brug Auto Densi-Flow gradient tidligere at pumpe gradient fra bunden til toppen af røret indeholder 1 ml 85% rørsukkeropløsning nederst. Anbring forsigtigt gradient ved 4 ° C, indtil afkølet (2-4 timer).
- Ved hjælp af en bred boring 1 ml pipette spids blidt overlejre gradient med 0,25 ml af 15% rørsukkeropløsning i STE indeholdende 1% Triton X-100. Forsigtigt overlay med 0,25 ml på 7,5% rørsukkeropløsning i STE ved hjælp af en bred boring 1 ml pipette spids. Vær omhyggelig med ikke at blande lagene.
- Forsigtigt overlay med 0,5 ml virussuspension fra trin 2.4. Dette trin bør udføres omhyggeligt for at undgå enhver forstyrrelse i gradient og blanding af underlaid saccharose lag.
- Placer rør i pre-kølet SW32.1Ti spand og centrifuger ved 32.000 rpm (187.000 xg ved r max) natten over (16-20 timer) ved 4 ° C. For at undgå pause af centrifugen, skal du ikke starte centrifugering før vakuum i centrifugen når 250 μm
- Indsaml 1 ml fraktioner fra top til bunden af gradient ved hjælp af Auto-Densi-Flow gradient fraktioneringskolonnerest. Placer rørene på is straks efter indsamlingen. Bland indholdet af de rør ved at vende nogle gange, og trække 50 μl af hver fraktion for kvantificering ved hjælp af ELISA eller reverse transkriptase aktivitet analysen.
4. Lokalisering af HIV-1 kernerog opbevaring af kerner
- Før du udfører uncoating assays, er det vigtigt at afgøre, hvilke fraktioner der indeholder intakt HIV-1-kerner. Dette kan bestemmes ved p24 ELISA eller reverse transkriptase aktivitet assay ved hjælp af de 50 μl alikvoter fra trin 3.6.
- Genopretningen af CA er forbundet med kerner er ofte relateret til stabiliteten af lederne. Mål kernen tilhørende CA ved p24 ELISA 9 Brug en prøve fra hver fraktion. Alternativt kan måle revers transkriptase aktivitet af hver fraktion. Brug begge metoder i toppen skal være omkring brøkdel 10.
- Pool de fraktioner, der indeholder kerner. Hvis kernerne ikke skal bruges til uncoating assay øjeblikkeligt, alikvot den poolede kerner til 0,2 til 0,3 ml alikvoter, flash-freeze i flydende N2 og opbevares ved -80 ° C. Cores frosne på denne måde er egnet til uncoating analysen. Udbyttet af de centrale-associerede CA er typisk 1-2 mikrogram p24 per milliliter eller cirka 15% af den samlede virion-associeredep24.
5. Kinetisk analyse af HIV-1 uncoating
- Mængden af HIV-1 kerner kræves pr uncoating reaktion er ca 50 ng. For at udføre in vitro uncoating assay, predilute den alikvote af kerner med en tilsvarende mængde kulden 1XSTE buffer til at reducere viskositeten af suspensionen, og for at minimere pipettering fejl.
- Fortynd 100 μl af kernerne i 0,15 ml koldt 1XSTE buffer indeholdende 10 mikrog / ml BSA i en 1,5 ml mikrocentrifugerør. Vi supplerer STE buffer med BSA (10 mg / ml) for at minimere adsorption af CA til væggene i røret. Bland ved at vende røret flere gange. Undlad at slynge prøverne. Inkubér rørene i et vandbad ved 37 ° C i timede intervaller (15, 30, 60 og 120 min). Rørene skal være nedsænket i vandbad i det mindste op til niveauet for den interne prøve for at sikre endnu opvarmning.
- Under inkubation, bland forsigtigt indholdet af røret med jævne mellemrum (som regel 5 -10 min) ved at svirpe røret. For en nul minutter kontrol, fortyndes 100 μl af kerner til 0,15 ml koldt 1XSTE buffer og inkuber på is i hele længden af eksperimentet (120 min). Den nul minutter kontrol giver basal uncoating værdi og bruges til at bestemme stigningen i uncoating af kerner inkuberet ved 37 ° C for forskellige timede intervaller.
- Ved slutningen af inkubationstiden, stoppe uncoating processen ved at placere rør i isen i 10 minutter.
- Centrifuger rørene ved 45.000 rpm (TLA-55 rotor; 125.000 xg ved r max) i 20 minutter ved 4 ° C. Dette vil pellet det intakte kerner og den frie CA frigivet som følge af uncoating af kerner forbliver i supernatanten. Rotoren skal precooled ved 4 ° C forud for lastning af prøverne.
- Overfør supernatanten til nye precooled mikrofuger rør helst ved hjælp af gel-loading tips opbevares ved stuetemperatur. Bemærk venligst, at pillen ikke vil være synlig med det blotte øje, så tager ekstrem omhu while pipettering ud supernatant. Resuspendér træpiller i 250 μl af ELISA-prøven fortyndingsmiddel (0,5% Triton X-100 og 5% Donor kalveserum i PBS). For at sikre en effektiv opløsning af bundfaldet, vortex efter tilsætning af ELISA prøvefortynder. Kvantificere CA indholdet af pellet og supernatanten ved hjælp af p24 ELISA, som beskrevet i det følgende afsnit.
- Omfanget af uncoating opnås ved at beregne den del af CA til stede i supernatant.
6. Assay for CA ved p24 ELISA
- Mange kommercielle ELISA kits er tilgængelige og kan bruges til at kvantificere CA. Brug enhver kommerciel eller "in-house" ELISA og omfatter p24 standarder for at bestemme lineariteten af analysen. Fortyndinger af prøverne skal analyseres for at sikre nøjagtigheden.
- Vi har udviklet en hjemmelavet ELISA, som vi rutinemæssigt bruger til analyse for CA. Proceduren er tilpasset fra en tidligere rapport 11, og udføres ved hjælp af opsamling og detektor antistoffer til rådighed fra NIH AIDS Forskning og Reference Reagens Program.
7. Repræsentative resultater:
Et eksempel på et resultat fra ELISA til bestemmelse af fraktioner, der indeholder kerne er vist i figur 1. Efter indsamling af brøker (1 ml hver) blev 50 μl af prøven fra hver brøk, der anvendes til at gøre seriefortyndinger og analyseres ved hjælp af ELISA. Den samlede p24 opnået ved at lægge værdierne for tolv fraktioner var 14,5 mikrogram. Som vist i figuren fraktioner fra 8 til 10 indeholdt kerner. Den p24 værdi for kerne-holdige fraktioner var 2,17 mikrogram. Den procentvise andel af kerne-associerede p24 (14,97%) blev bestemt ved at tage forholdet mellem p24 værdi for kernen fraktioner (2,17 mg) til den samlede p24 værdi (14,5 mikrogram). Fraktion 1 eller 2, vil altid indeholde højeste beløb af p24, hvilket repræsenterer gratis CA som ikke er forbundet med kerner. Dette er efterfulgt af en gradvis reduktion i p24-værdier med hver efterfølgende fraktion, så en kraftig stigning, og endelig et kraftigt fald i p24værdier. Hvis der tages behørigt hensyn under indlæsning af gradient så toppen af kerne-associerede CA er fundet rundt omkring brøkdel 10.
Et typisk resultat er opnået ved analysering kinetik uncoating af HIV-1 kerner er vist i figur 2. Grafen viser en tidsafhængig stigning i uncoating af vildtype HIV-1 kerner. Den procent uncoating værdi blev opnået ved at beregne den brøkdel af CA til stede i supernatant. Med praksis, er analysen meget reproducerbar og er nyttig til at bestemme stabiliteten af virale kerner in vitro. Bemærk venligst, at reproducerbarheden af analysen er meget afhængig af korrekt håndtering af prøverne under proceduren. Da kernerne er varme labil, skal prøverne holdes på 4 ° C under hele analysen, undtagen i inkubationstiden.
Figur 1 Equilibrium densitetsgradient centrifugering afHIV-1-kerner. Et koncentreret virussuspension blev anvendt til toppen af en 30 til 70% lineær saccharose gradient overlejret med 1% Triton-X-100. Efter overnatning centrifugering ved 187.000 xg og 4 ° C, var 1 ml fraktioner indsamlet fra toppen (Fraktion 1) til bund (Fraktion 12) og p24 blev kvantificeret ved ELISA.
Figur 2 Tid løbet af HIV-1 uncoating in vitro. Renset HIV-1-kerner blev fortyndet og inkuberes ved 37 ° C i den angivne tidsintervaller. Nul min Prøven blev inkuberet på is til hele længden af eksperimentet. Efter inkubation blev prøverne ultracentrifuged på 125.000 xgi 20 minutter ved 4 ° C. Supernatant og pellets blev adskilt og analyseret af p24 ELISA. Omfanget af uncoating blev bestemt som beskrevet i protokollen teksten. Hver uncoating reaktion blev udført i to eksemplarer; fejllinjer span rækken af de to værdier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metode, der beskrives her for at rense HIV-1-kerner for at studere uncoating in vitro er nyttigt til at studere denne fase af HIV-1 livscyklus, især på grund af manglende adgang til en valideret metode til at analysere HIV-1 uncoating i target-cellerne. Selv om denne metode bruger ligevægt ultracentrifugering at rense kerner, andre har brugt direkte pelletering efter korte lyse med 1% Triton-X-100 12, 13 eller pelletering gennem et saccharose pude overlejret med 0,1% Triton-X-100 14, 15.
Inddrivelse af kerner opnået ved denne metode er underkastet eksperimentel variation. En variabel for succesen af denne protokol er den transfektion effektivitet. Typisk indlæser vi en mængde af virus, der svarer til mindst 7 mikrogram p24 på gradient. Vores laboratorium benytter en calciumphosphat transfektion metode til virus-produktion. Mens andre transfektion metoder også kan være egnet, har vi ikke vurderet dem til isolering af kerner. Andre vigtige variables der påvirker kernen udbyttet er omhyggelig anvendelse af lag til gradient og i at holde prøverne kolde. Yderste forsigtighed skal udvises ved udarbejdelse saccharose gradienter for at undgå sammenblanding af gradient. Enhver forstyrrelse under anvendelse af de koncentrerede virussuspension kan føre til uønskede og tidlig kontakt mellem virioner med opvaskemiddel under barrieren saccharose lag; sådan langvarig kontakt kan bryde ud den skrøbelige kerner og føre til nedsat kapsid forening. Det er også lige så vigtigt at holde saccharose densitetsgradient og virussuspension kolde under hele proceduren. Proceduren er blevet mestret og med succes brugt af mange forskellige forskere i vores laboratorium.
HIV-1-kerner er varmelabile 4, derfor er det meget vigtigt at fractionate af saccharose gradient, mens det er koldt, og at placere de indsamlede fraktioner straks på is. Siden uncoating af kerner er også afhængig af pH og salt koncentration af buffer4, er det yderst tilrådeligt at måle pH i STE buffer før man går videre med analysen. Satsen for uncoating kan afvige lidt med hver batch af kerner. Uncoating reaktioner skal udføres i to eksemplarer, og hvis de værdier, der afviger med mere end 15%, så reaktionerne skal udføres i tre eksemplarer, indtil konsistens er opnået. Gratis CA protein har en tendens til at holde sig til den indvendige vægge af rørene, og derfor er det bydende nødvendigt at inkludere BSA i en endelig koncentration på 10 mg / ml i reaktionsblandingen for at minimere adsorption af CA til væggene i rørene.
Som nævnt tidligere, uncoating assay beskrevet her kan bruges til at identificere og undersøge cellulære faktorer, der påvirker uncoating. Det kan også bruges til at undersøge effekten af kapsid målrette forbindelser og cellulære faktorer på reverse transskription med kerner bruger et endogent reverse transkription assay. Isolation af hiv-1-kerner i tilstrækkelige mængder kan også tillade analysepå interaktioner af de kapsid med cellulære faktorer ved immunogold elektronmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
HIV-1 uncoating studier i Aiken laboratoriet blev støttet af NIH tilskud AI40364, AI50423 og AI076121. Flere vigtige materialer, herunder reagenser, der anvendes i p24 ELISA, blev tilvejebragt af NIH aids-forskning og referenceprogram, division af aids, NIAID, NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| PBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| Triton-X-100 | Mallinckrodt Baker Inc. | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | Acros Organics | 9005-64-5 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Cellgro | 25-053-CI | |
| 2XBBS | Composition: 50mM BES [pH 6.95], 280 mM NaCl and 1.5 mM Na2HPO4. Adjust pH to 6.95 at room temperature. Filter sterilize & store in aliquots at -20°C. | ||
| Coating antibody: Monoclonal antibody to p24 (183-H12-5C) | National Institutes of Health | 3537 | |
| Primary antibody: HIV-Ig (hyperimmune human patient serum) | National Institutes of Health | 3957 | |
Secondary antibody: Goat anti-human IgG, peroxidase conjugated |
Pierce, Thermo Scientific | 31130 | |
| HRP substrate | KPL Inc | 50-76-11 | |
| Immulon 2HB 96 well plates | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3455 | |
| SW32Ti and SW32.1 Ti rotors and compatible ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| TLA-55 rotor and tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| High speed microfuge tubes | Beckman Coulter Inc. | 326823, 358123, 357448 | |
| Auto-Densi Flow density gradient fractionator | Labconco Corp. | 4517000 | |
| Gradient Former | CBS Scientific Co. Inc. | GM-20 | |
References
- Ganser, B. K., Li, S., Klishko, V. Y., Finch, J. T., Sundquist, W. I. Assembly and analysis of conical models for the HIV-1 core. Science. 283, 80-83 (1999).
- Li, S., Hill, C. P., Sundquist, W. I., Finch, J. T. Image reconstructions of helical assemblies of the HIV-1 CA protein. Nature. 407, 409-413 (2000).
- Aiken, C. Viral and cellular factors that regulate HIV-1 uncoating. Curr. Opin. HIV. AIDS. 1, 194-199 (2006).
- Forshey, B. M., Schwedler, U. von, Sundquist, W. I., Aiken, C. Formation of a human immunodeficiency virus type 1 core of optimal stability is crucial for viral replication. J. Virol. 76, 5667-5677 (2002).
- Forshey, B. M., Aiken, C. Disassembly of human immunodeficiency virus type 1 cores in vitro reveals association of Nef with the subviral ribonucleoprotein complex. J. Virol. 77, 4409-4414 (2003).
- Wacharapornin, P., Lauhakirti, D., Auewarakul, P. The effect of capsid mutations on HIV-1 uncoating. Virology. 358, 48-54 (2007).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).
- Aiken, C. Methods in Molecular Biology. Prasad, V. R., Ganjam, K. V. 485, 41-53 (2009).
- Kotov, A., Zhou, J., Flicker, P., Aiken, C. Association of Nef with the human immunodeficiency virus type 1 core. J. Virol. 73, 8824-8830 (1999).
- Kewalramani, V. N., Emerman, M. Vpx association with mature core structures of HIV-2. Virology. 218, 159-168 (1996).
- Wehrly, K., Chesebro, B. p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents. Methods. 12, 288-293 (1997).
- Welker, R., Hohenberg, H., Tessmer, U., Huckhagel, C., Kräusslich, H. G. Biochemical and structural analysis of isolated mature cores of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 74, 1168-1177 (2000).
- Briggs, J. A., Wilk, T., Welker, R., Kräusslich, H. G., Fuller, S. D. Structural organization of authentic, mature HIV-1 virions and cores. EMBO J. 22, 1707-1715 (2003).
- Auewarakul, P., Wacharapornin, P., Srichatrapimuk, S., Chutipongtanate, S., Puthavathana, P. Uncoating of HIV-1 requires cellular activation. Virology. 337, 93-101 (2005).
- Accola, M. A., Ohagen, A., Göttlinger, H. G. Isolation of human immunodeficiency virus type 1 cores: retention of Vpr in the absence of p6(gag. J. Virol. 74, 6198-6202 (2000).
