Summary
Uncoating एचआईवी -1 जीवन चक्र के प्रारंभिक चरण में एक आवश्यक कदम है और capsid खोल के disassembly और वायरल ribonucleoprotein जटिल (vRNP) की रिहाई के रूप में परिभाषित है. यहाँ, हम एचआईवी-1 virions से बरकरार कोर अलग करने के लिए और उनके uncoating बढ़ाता लिए तकनीक का प्रदर्शन
Abstract
रेट्रोवायरस के जीनोम एक लिपिड लिफाफा से घिरा capsid में encased है. Lentiviruses, जैसे एचआईवी -1 के लिए, शंक्वाकार capsid खोल सीए षट्भुज का एक जाली के रूप में व्यवस्थित प्रोटीन से बना है. capsid व्यापक अंत में 7 pentamers और कोन 1, 2 की संकीर्ण अंत में 5 द्वारा बंद कर दिया है. इस capsid खोल में encased वायरल ribonucleoprotein जटिल है, और एक साथ वे कोर शामिल है.
लक्ष्य कोशिका झिल्ली के साथ वायरल झिल्ली के विलय के बाद, एचआईवी -1 cytoplasm में जारी है. capsid तो एक uncoating के रूप में संदर्भित प्रक्रिया में घुलनशील रूप में 3 मुक्त सीए रिहा disassembles. intracellular और एचआईवी-1 uncoating के स्थान और समय खराब समझ रहे हैं. सीए में एकल एमिनो एसिड substitutions है कि capsid की स्थिरता में परिवर्तन भी 4 कोशिकाओं को संक्रमित एचआईवी -1 की क्षमता क्षीण है. यह इंगित करता है कि capsid की स्थिरता एचआईवी -1 संक्रमण के लिए महत्वपूर्ण है. एचआईवी-1 uncoating मुश्किल हो गया है इस प्रक्रिया के लिए संवेदनशील और विश्वसनीय assays की उपलब्धता की कमी के कारण अध्ययन. यहाँ हम संक्रामक एचआईवी-1 कणों से अलग कोर का उपयोग कर इन विट्रो में uncoating के अध्ययन के लिए एक मात्रात्मक विधि का वर्णन . दृष्टिकोण डिटर्जेंट की एक परत के माध्यम से और एक रैखिक sucrose ढाल में केंद्रित virions के अवसादन द्वारा कोर के अलगाव, ठंड में शामिल है. Uncoating यों, पृथक कोर 37 पर incubated हैं ° सी के विभिन्न समय के अंतराल बाद ultracentrifugation द्वारा pelleted के लिए. uncoating की हद तक सतह पर तैरनेवाला में सीए के अंश बढ़ाता द्वारा विश्लेषण किया है. यह दृष्टिकोण एचआईवी-1 capsid 4 स्थिरता, 5, 6 पर वायरल परिवर्तन के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए नियोजित किया गया है. यह भी एचआईवी-1 uncoating में सेलुलर कारकों की भूमिका का अध्ययन करने के लिए उपयोगी होना चाहिए.
Protocol
1. एचआईवी -1 कणों का उत्पादन
आगे बढ़ने से पहले, आप अनुमति प्राप्त और अपनी संस्था के जैवसुरक्षा कार्यालय एक जैव सुरक्षा संक्रामक एचआईवी के लिए अनुमोदित सुविधा में काम करने से दिशा निर्देशों का पालन करना चाहिए. आप कि उचित देखभाल सुनिश्चित करने और जैव सुरक्षा प्रयोगशाला में काम के दौरान सुरक्षा सावधानियों का पालन कर रहे हैं चाहिए.
एचआईवी-1 कणों के उत्पादन आम तौर पर एचआईवी-1 proviral कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक 7 विधि, 8 का उपयोग डीएनए के साथ 293T कोशिकाओं के क्षणिक अभिकर्मक द्वारा किया जाता है. उच्च टिटर वायरस संक्रमित टी कोशिकाओं की संस्कृति से हो शेयरों को भी उपयुक्त हैं.
- संस्कृति है Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में 293T कोशिकाओं 10% भ्रूण गोजातीय (FBS) सीरम और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक युक्त [(100 आइयू / मिलीलीटर) पेनिसिलीन और (100 μg / मिलीलीटर) स्ट्रेप्टोमाइसिन] 37 2 ° सी, 5% सीओ .
- लगभग सहधारा व्यंजन से 0.25% trypsin EDTA और बीज 6 2x10 का उपयोग कोशिकाओं अलग
- अगले दिन पर, सेल monolayers के बारे में 25% सहधारा और अभिकर्मक के लिए तैयार होना चाहिए. ट्रांसफ़ेक्ट किया जा कोशिकाओं के छह व्यंजन के लिए, बाँझ पानी के साथ 2.7 मिलीलीटर की एक मात्रा के लिए proviral डीएनए के 120 μg लाने. इस मिश्रण को 2.5 एम 2 CaCl के 0.3 मिलीग्राम और 2XBBS के 3 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, और ऊपर और नीचे pipetting कई बार ठीक से मिश्रण . मिश्रण कमरे के तापमान पर 10-20 मिनट के लिए खड़े करने के लिए अनुमति दें.
- हर डिश के केंद्र के लिए जिसके परिणामस्वरूप मिश्रण dropwise के 1 मिलीलीटर जोड़ें जबकि धीरे घूमता है मिश्रण करने के लिए. 35 डिग्री सेल्सियस और 3% सीओ 2 पर एक मशीन सेट में रातोंरात व्यंजन (~ 16 घंटे) रखें.
- संस्कृति के माध्यम महाप्राण (व्यंजन) और धीरे से जोड़ने के 5 मिलीलीटर पीबीएस.
- पीबीएस महाप्राण (व्यंजन) और ताजा माध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ने. संस्कृति 37 और इनक्यूबेटर में कोशिकाओंडिग्री; सी और 5% अतिरिक्त 24-48 घंटे के लिए सीओ 2 .
- लीजिए संस्कृति सतह पर तैरनेवाला वायरल कणों से युक्त, यह एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब को हस्तांतरण. सभी व्यंजनों से supernatants का मिश्रण है और 5 मिनट के लिए गोली कोशिकाओं और मलबे को +१५०० XG अपकेंद्रित्र. 0.45 सुक्ष्ममापी ताकना आकार सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला फ़िल्टर. सावधानियों एयरोसोल गठन जीवित वायरस के साथ काम करते हुए कम से कम करने के लिए लिया जाना चाहिए. यह शंक्वाकार ट्यूबों के centrifugation चरण के दौरान या O-अंगूठी रोटर बाल्टी कवर के साथ उपयोग भी शामिल है. यदि यह संभव नहीं है, ट्यूबों के पेंच टोपी parafilm के साथ लिपटे होना चाहिए.
2. Ultracentrifugation द्वारा एचआईवी -1 virions की एकाग्रता
- 38.5 मिलीलीटर polyallomer अपकेंद्रित्र ट्यूब के Beckman SW32Ti रोटर या समकक्ष के लिए () में संस्कृति सतह पर तैरनेवाला प्लेस (30 मिलीलीटर). धीरे पीबीएस में 20% sucrose के एक 5 मिलीलीटर pipet का उपयोग 5 मिलीलीटर समाधान के साथ वायरस युक्त सतह पर तैरनेवाला बुनियाद.
- पर 3 घंटे के लिए अपकेंद्रित्र4 पर 32,000 rpm ° गोली वायरस कणों के लिए सी (r अधिकतम पर 175.000 XG).
- आकांक्षा से सतह पर तैरनेवाला निकालें, देखभाल लेने ट्यूब के नीचे गोली परेशान नहीं है. ट्यूब और 4 में जगह 1XSTE बफर (10 मिमी Tris - एचसीएल [पीएच 7.4], 100 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA) 0.5 मिलीलीटर जोड़ें ° सी 1 घंटे के लिए गोली ढीला करने के लिए. एक विस्तृत बोर 1 मिलीलीटर pipet टिप धीरे से ऊपर pipet और नीचे कुछ समय गोली ट्यूब के नीचे से अलग का उपयोग करना. अगले, एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब गोली ढीला हस्तांतरण, देखभाल लेने के लिए foaming से बचने. एक और 1-3 घंटे के लिए 4 ° C पर वायरस के छोटे clumps फैलाने के लिए अनुमति देने के सेते हैं. इस अवधि के दौरान, sucrose के ढाल के रूप में 3.1 चरण में वर्णित तैयार करते हैं.
- धीरे pipet वायरस निलंबन ऊपर और नीचे 4 में 8,000 rpm (6000 XG) ° सी में 1 मिनट के लिए प्रशीतित microfuge पर कई बार और अपकेंद्रित्र अवशिष्ट clumps को हटाने के लिए. इस प्रक्रिया के दौरान नमूना ठंडा रखें.
3. Sucrose ढालकोर अलग centrifugation
एचआईवी - एक कोर का उपयोग कर अलग कर रहे हैं एक "स्पिन होना" 9 पद्धति है जो एचआईवी -2 10 कोर के शुद्धिकरण के लिए पहले से वर्णित विधि के एक संशोधन है.
- SW32.1Ti रोटर के लिए 14.5 मिलीलीटर polyallomer अपकेंद्रित्र ट्यूब में एक 12 मिलीलीटर रैखिक 1XSTE बफर में 30% से 70% sucrose ढाल तैयार करें. ढाल तैयार करने के लिए, एक 20 मिलीलीटर पूर्व ढाल का उपयोग करें; जगह 70% sucrose के समाधान के निकट तरफ 6 मिलीलीटर (आउटलेट बंदरगाह के पास) और 30% को दूर तरफ sucrose के समाधान के 6 मिलीलीटर. यकीन है कि हवा बुलबुले दो कक्षों को जोड़ने चैनल में नहीं फंस रहे हैं. Densi फ्लो ऑटो पूर्व ढाल नीचे से 85% के नीचे sucrose के समाधान के 1 मिलीलीटर युक्त ट्यूब के ऊपर ढाल पंप का उपयोग करें. धीरे 4 में ढाल जगह ° सी ठंडा जब तक (2-4 घंटे).
- एक विस्तृत बोर 1 मिलीलीटर pipet टिप का उपयोग धीरे STE में 15% sucrose के समाधान के 0.25 मिलीलीटर के साथ ढाल% 1 Triton एक्स 100 युक्त उपरिशायी. Ste में 7.5% sucrose के एक विस्तृत बोर 1 मिलीलीटर pipet टिप समाधान का उपयोग कर के 0.25 मिलीलीटर के साथ धीरे उपरिशायी. परतों मिश्रण नहीं सावधान रहो.
- 2.4 कदम से 0.5 मिलीलीटर वायरस के निलंबन के साथ धीरे उपरिशायी. यह कदम सावधानी से किया जाना चाहिए ढाल में किसी भी गड़बड़ी और underlaid sucrose परतों के मिश्रण से बचने के.
- पूर्व ठंडा SW32.1Ti बाल्टी और 32,000 (r अधिकतम पर 187.000 XG) रातोंरात rpm (16-20 घंटे) पर अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस में ट्यूबों रखें अपकेंद्रित्र की रोक से बचने के लिए, centrifugation शुरू नहीं जब तक अपकेंद्रित्र में वैक्यूम 250 सुक्ष्ममापी तक पहुँचता है
- ढाल ऑटो Densi फ्लो fractionator का उपयोग ढाल के ऊपर से नीचे 1 मिलीलीटर भिन्न लीजिए. बर्फ पर ट्यूबों संग्रह पर तुरंत प्लेस. Inverting कुछ समय के द्वारा ट्यूब की सामग्री मिक्स, और वापस लेने एलिसा या रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस गतिविधि परख मात्रा का ठहराव के लिए प्रत्येक अंश के 50 μl.
4. एचआईवी-1 कोर का स्थानीयकरणऔर कोर के भंडारण
- Uncoating assays के प्रदर्शन से पहले, यह महत्वपूर्ण है निर्धारित करने के लिए है जो भिन्न बरकरार एचआईवी-1 कोर होते हैं. यह p24 एलिसा या रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस गतिविधि 3.6 कदम से 50 μl aliquots का उपयोग परख द्वारा निर्धारित किया जा सकता है.
- सीए की वसूली कोर के साथ जुड़े अक्सर कोर की स्थिरता से संबंधित है. कोर जुड़े सीए p24 9 एलिसा प्रत्येक अंश से एक नमूने का उपयोग कर उपाय. वैकल्पिक रूप से, प्रत्येक अंश रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस गतिविधि को मापने. दोनों विधियों का प्रयोग चोटी के 10 अंश के आसपास होना चाहिए.
- पूल कोर युक्त भिन्न. यदि कोर करने के लिए परख तुरंत uncoating, 0,2 0,3 मिलीलीटर aliquots -80 में तरल N2 और दुकान में फ्लैश फ्रीज डिग्री सेल्सियस में विभाज्य जमा कोर के लिए इस्तेमाल किया जा नहीं कर रहे हैं इस तरीके में जमे हुए कोर uncoating परख के लिए उपयुक्त हैं. कोर जुड़े सीए की उपज आमतौर पर p24 प्रति मिली लीटर की 1-2 μg या कुल virion जुड़े के बारे में 15% हैp24.
5. एचआईवी-1 uncoating की काइनेटिक परख
- एचआईवी 1-कोर प्रति uncoating प्रतिक्रिया की आवश्यकता की राशि लगभग 50 एनजी है. इन विट्रो uncoating परख में प्रदर्शन करने के लिए, ठंड 1XSTE बफर के एक बराबर मात्रा के साथ कोर के विभाज्य predilute निलंबन का चिपचिपापन कम और pipetting त्रुटियों को कम.
- इसके अलावा ठंड 1XSTE एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 10 μg / BSA के मिलीलीटर वाले बफर के 0.15 मिलीलीटर में कोर के 100 μl पतला. हम BSA (10 μg / एमएल) के साथ STE बफर पूरक ट्यूब की दीवारों के लिए सीए के सोखना कम से कम. Inverting ट्यूब कई बार द्वारा मिक्स. भंवर नमूने मत करो. 37 पर एक पानी के स्नान में ट्यूब सेते डिग्री सेल्सियस समय पर अंतराल के लिए (15, 30, 60, और 120 मिनट). ट्यूब पानी के स्नान में डूब जाना चाहिए आंतरिक नमूना के स्तर पर कम से कम क्रम में वार्मिंग भी सुनिश्चित.
- ऊष्मायन के दौरान, धीरे ट्यूब की सामग्री को समय - समय पर मिश्रण (आमतौर पर 5 -ट्यूब flicking द्वारा 10) मिनट. एक शून्य मिनट के नियंत्रण के लिए, ठंड 1XSTE बफर के 0.15 मिलीलीटर में कोर के 100 μl पतला और बर्फ पर प्रयोग की पूरी लंबाई (120 मिनट) के लिए सेते हैं. शून्य मिनट बेसल uncoating मूल्य नियंत्रण देता है और ° अलग समय अंतराल के लिए सी 37 पर incubated कोर के uncoating में वृद्धि का निर्धारण किया है.
- ऊष्मायन अवधि के अंत में, बर्फ में 10 मिनट के लिए ट्यूबों रखकर uncoating प्रक्रिया बंद करो.
- 45,000 rpm (रोटर TLA 55, आर अधिकतम पर 125.000 XG) ट्यूबों अपकेंद्रित्र 4 बजे 20 मिनट के लिए डिग्री सेल्सियस यह गोली बरकरार कोर और मुक्त सीए कोर के uncoating का एक परिणाम के के रूप में सतह पर तैरनेवाला में जारी रहेगा. रोटर 4 पर precooled में होना चाहिए ° सी के पहले नमूने लोड हो रहा है.
- नए precooled microfuge अधिमानतः जेल लोडिंग कमरे के तापमान पर संग्रहित सुझावों का उपयोग ट्यूबों के लिए सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण. कृपया ध्यान दें कि गोली नग्न आंखों को दिखाई नहीं होगा, तो अत्यधिक ध्यान w लेसतह पर तैरनेवाला pipetting hile. एलिसा नमूना मंदक के 250 μl में (0.5% ट्राइटन X-100 और 5% पीबीएस में दाता बछड़ा सीरम) छर्रों Resuspend. एलिसा नमूना मंदक जोड़ने के बाद गोली के कुशल विघटन, भंवर सुनिश्चित करते हैं. गोली और सतह पर तैरनेवाला सीए p24 एलिसा के रूप में निम्न खंड में वर्णित सामग्री का उपयोग यों.
- uncoating की हद तक सीए के सतह पर तैरनेवाला में मौजूद अंश की गणना के द्वारा प्राप्त की है.
6. सीए के लिए p24 एलिसा द्वारा परख
- कई वाणिज्यिक एलिसा किट उपलब्ध हैं और सीए यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. किसी भी व्यावसायिक या "घर में" एलिसा का प्रयोग करें और p24 मानकों को शामिल करने के लिए परख की linearity निर्धारित है. नमूने के dilutions की शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए assayed किया जाना चाहिए.
- हम एक घर एलिसा जो हम नियमित रूप से CA के लिये परख का उपयोग करने के लिए विकसित किया है. प्रक्रिया पिछले एक रिपोर्ट 11 से अनुकूलित है और एनआईएच सहायता से कब्जा और डिटेक्टर उपलब्ध एंटीबॉडी का उपयोग किया हैएस शोध और संदर्भ अभिकर्मक कार्यक्रम.
7. प्रतिनिधि परिणाम:
कोर युक्त भिन्न निर्धारण के लिए एलिसा से एक परिणाम का एक उदाहरण चित्र 1 में दिखाया गया है. भिन्न (1 मिलीलीटर प्रत्येक) को इकट्ठा करने के बाद, प्रत्येक अंश से 50 नमूने के μl धारावाहिक dilutions बनाने में इस्तेमाल किया गया था और एलिसा द्वारा विश्लेषण. कुल बारह भागों के लिए मूल्यों को जोड़कर प्राप्त p24 14.5 μg था. आंकड़ा भिन्न के रूप में 8 से 10 कोर निहित दिखाया. कोर युक्त भिन्नों के लिए p24 मूल्य 2.17 μg था. कोर जुड़े p24 प्रतिशत (14.97%) कुल p24 मूल्य (14.5 μg) के मुख्य भागों के लिए p24 मूल्य के अनुपात (2.17 μg) लेने के द्वारा निर्धारित किया गया था. भिन्न 1 या 2 हमेशा p24 के सर्वोच्च राशि शामिल होंगे, इस मुफ्त सीए का प्रतिनिधित्व करता है जो कोर के साथ संबद्ध नहीं है. यह प्रत्येक बाद के अंश के साथ p24 मूल्यों में एक क्रमिक कमी, फिर एक तेज वृद्धि और अंत में p24 में एक तेज ड्रॉप द्वारा पीछा किया जाता हैमूल्यों. यदि उचित देखभाल जबकि ढाल लोड हो रहा है के लिए लिया जाता है तो कोर जुड़े सीए के चोटी के चारों ओर 10 अंश पाया जाता है.
एक ठेठ एचआईवी-1 कोर के uncoating के कैनेटीक्स परख करने की क्रिया द्वारा प्राप्त परिणाम चित्रा 2 में दिखाया गया है. ग्राफ जंगली प्रकार एचआईवी-1 कोर के uncoating में एक समय पर निर्भर वृद्धि दिखाता है. मूल्य uncoating प्रतिशत सीए के सतह पर तैरनेवाला में मौजूद अंश की गणना के द्वारा प्राप्त किया गया था. अभ्यास के साथ, परख अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और इन विट्रो में वायरल कोर की स्थिरता को निर्धारित करने के लिए उपयोगी है. कृपया ध्यान दें कि परख के reproducibility प्रक्रिया के दौरान नमूने के समुचित से निपटने पर अत्यधिक निर्भर है. चूंकि कोर गर्मी अस्थिर कर रहे हैं, नमूने छोड़कर ° सी परख भर ऊष्मायन अवधि के दौरान 4 में रखा होना चाहिए.
1 संतुलन घनत्व ढाल के centrifugation चित्राएचआईवी कोर 1. एक केंद्रित वायरस निलंबन 30 से 70% रैखिक sucrose 1% Triton एक्स 100 से मढ़ा ढाल के शीर्ष करने के लिए लागू किया गया था. 187.000 XG और 4 में रात भर centrifugation के बाद ° सी, 1 मिलीलीटर भिन्न (1 भिन्न) नीचे ऊपर (12 भिन्न) से एकत्र किए गए थे और एलिसा द्वारा p24 मात्रा निर्धारित किया गया था.
2 इन विट्रो में एचआईवी -1 uncoating के समय पाठ्यक्रम चित्रा. शुद्ध एचआईवी-1 कोर पतला थे और 37 में incubated डिग्री सेल्सियस संकेत समय अंतराल के लिए. शून्य मिनट नमूना प्रयोग की पूरी लंबाई के लिए बर्फ पर incubated था. ऊष्मायन के बाद, नमूने 125.000 XG पर 20 मिनट के लिए डिग्री सेल्सियस 4 ultracentrifuged थे सतह पर तैरनेवाला और छर्रों अलग थे और p24 एलिसा द्वारा विश्लेषण. uncoating की हद तक प्रोटोकॉल पाठ में वर्णित के रूप में निर्धारित किया गया था. प्रत्येक uncoating प्रतिक्रिया दो प्रतियों में प्रदर्शन किया था, त्रुटि सलाखों दो मानों की सीमा अवधि.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
विधि यहाँ वर्णित करने के लिए एचआईवी - एक कोर को शुद्ध करने के लिए इन विट्रो में uncoating एचआईवी -1 जीवन चक्र के इस चरण में, विशेष रूप से एक मान्य पद्धति की अनुपलब्धता के कारण लक्ष्य कोशिकाओं में एचआईवी -1 uncoating विश्लेषण का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है अध्ययन. हालांकि इस पद्धति का संतुलन ultracentrifugation का उपयोग करता है कोर शुद्ध है, दूसरों को संक्षिप्त lysis के बाद के साथ प्रत्यक्ष pelleting का इस्तेमाल किया है 1% ट्राइटन एक्स 100 13 12, या एक sucrose के 0.1% Triton एक्स 100 14 15, के साथ मढ़ा तकिया के माध्यम से pelleting.
इस विधि द्वारा प्राप्त कोर की वसूली प्रयोगात्मक भिन्नता के अधीन है. इस प्रोटोकॉल की सफलता में एक चर अभिकर्मक दक्षता है. आमतौर पर हम वायरस के एक ढाल पर कम से कम 7 p24 के μg बराबर मात्रा लोड. हमारी प्रयोगशाला वायरस के उत्पादन के लिए एक कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक विधि का उपयोग करता है. जबकि अन्य अभिकर्मक तरीके भी उपयुक्त हो सकता है है, हम उन्हें कोर के अलगाव के लिए मूल्यांकन नहीं है. अन्य महत्वपूर्ण variables कि कोर उपज को प्रभावित ढाल करने के लिए परतों को लागू करने में और नमूने ठंड को ध्यान में रखते हुए लिया देखभाल कर रहे हैं. अत्यंत सावधानी जब sucrose gradients की तैयारी के लिए ढाल के मिश्रण से बचने लिया जाना चाहिए. कोई अशांति जबकि केंद्रित वायरस निलंबन आवेदन बाधा sucrose के परत के नीचे डिटर्जेंट के साथ virions की अवांछित और जल्दी से संपर्क करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, जैसे लंबे समय तक संपर्क के अलावा नाजुक कोर तोड़ कर सकते हैं और कम capsid संघ नेतृत्व करने के लिए. यह भी उतना ही महत्वपूर्ण प्रक्रिया भर में sucrose के घनत्व ढाल और वायरस निलंबन ठंड रख. प्रक्रिया में महारत हासिल किया गया है और हमारी प्रयोगशाला में कई अलग अलग वैज्ञानिकों द्वारा सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया.
एचआईवी -1 कोर गर्मी अस्थिर कर रहे हैं 4, इसलिए, यह fractionate sucrose ढाल करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है जब यह ठंडा है और एकत्र भिन्न बर्फ पर तुरंत जगह है. चूंकि कोर के uncoating भी पीएच और बफर के नमक एकाग्रता पर निर्भर है4, यह अत्यधिक की परख के साथ आगे बढ़ने से पहले STE बफर के पीएच उपाय करने के लिए सलाह दी जाती है. uncoating की दर थोड़ी कोर के प्रत्येक बैच के साथ भिन्न हो सकते हैं. Uncoating प्रतिक्रियाओं दो प्रतियों में प्रदर्शन किया जाना चाहिए, और अगर मान से अधिक 15% द्वारा अलग है, तो प्रतिक्रियाओं तीन प्रतियों में प्रदर्शन किया जाना चाहिए जब तक स्थिरता हासिल की है. मुफ्त सीए प्रोटीन एक ट्यूब के अंदर की दीवारों के लिए छड़ी की प्रवृत्ति है, इसलिए यह प्रतिक्रिया मिश्रण में एक 10 μg / मिलीलीटर के अंतिम एकाग्रता नलियों की दीवारों के लिए सीए के सोखना कम से कम पर BSA शामिल करने के लिए जरूरी है.
जैसा कि पहले उल्लेख किया है, uncoating परख यहाँ वर्णित की पहचान करने और सेलुलर uncoating प्रभावित कारकों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह भी capsid लक्ष्यीकरण एक अंतर्जात रिवर्स प्रतिलेखन परख का उपयोग कोर में रिवर्स प्रतिलेखन पर यौगिकों और सेलुलर कारकों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. पर्याप्त मात्रा में एचआईवी -1 कोर के अलगाव भी विश्लेषण की अनुज्ञा दे सकेगाimmunogold इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा सेलुलर कारकों के साथ capsid के बातचीत की.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
एचआईवी 1 Aiken प्रयोगशाला में uncoating अध्ययन एनआईएच AI40364 अनुदान, AI50423 और AI076121 द्वारा समर्थित थे. P24 एलिसा में इस्तेमाल किया अभिकर्मकों सहित कई महत्वपूर्ण सामग्री, NIH एड्स अनुसंधान और संदर्भ प्रोग्राम, एड्स के प्रभाग, NIAID, एनआईएच द्वारा प्रदान किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| PBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| Triton-X-100 | Mallinckrodt Baker Inc. | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | Acros Organics | 9005-64-5 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Cellgro | 25-053-CI | |
| 2XBBS | Composition: 50mM BES [pH 6.95], 280 mM NaCl and 1.5 mM Na2HPO4. Adjust pH to 6.95 at room temperature. Filter sterilize & store in aliquots at -20°C. | ||
| Coating antibody: Monoclonal antibody to p24 (183-H12-5C) | National Institutes of Health | 3537 | |
| Primary antibody: HIV-Ig (hyperimmune human patient serum) | National Institutes of Health | 3957 | |
Secondary antibody: Goat anti-human IgG, peroxidase conjugated |
Pierce, Thermo Scientific | 31130 | |
| HRP substrate | KPL Inc | 50-76-11 | |
| Immulon 2HB 96 well plates | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3455 | |
| SW32Ti and SW32.1 Ti rotors and compatible ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| TLA-55 rotor and tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| High speed microfuge tubes | Beckman Coulter Inc. | 326823, 358123, 357448 | |
| Auto-Densi Flow density gradient fractionator | Labconco Corp. | 4517000 | |
| Gradient Former | CBS Scientific Co. Inc. | GM-20 | |
References
- Ganser, B. K., Li, S., Klishko, V. Y., Finch, J. T., Sundquist, W. I. Assembly and analysis of conical models for the HIV-1 core. Science. 283, 80-83 (1999).
- Li, S., Hill, C. P., Sundquist, W. I., Finch, J. T. Image reconstructions of helical assemblies of the HIV-1 CA protein. Nature. 407, 409-413 (2000).
- Aiken, C. Viral and cellular factors that regulate HIV-1 uncoating. Curr. Opin. HIV. AIDS. 1, 194-199 (2006).
- Forshey, B. M., Schwedler, U. von, Sundquist, W. I., Aiken, C. Formation of a human immunodeficiency virus type 1 core of optimal stability is crucial for viral replication. J. Virol. 76, 5667-5677 (2002).
- Forshey, B. M., Aiken, C. Disassembly of human immunodeficiency virus type 1 cores in vitro reveals association of Nef with the subviral ribonucleoprotein complex. J. Virol. 77, 4409-4414 (2003).
- Wacharapornin, P., Lauhakirti, D., Auewarakul, P. The effect of capsid mutations on HIV-1 uncoating. Virology. 358, 48-54 (2007).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).
- Aiken, C. Methods in Molecular Biology. Prasad, V. R., Ganjam, K. V. 485, 41-53 (2009).
- Kotov, A., Zhou, J., Flicker, P., Aiken, C. Association of Nef with the human immunodeficiency virus type 1 core. J. Virol. 73, 8824-8830 (1999).
- Kewalramani, V. N., Emerman, M. Vpx association with mature core structures of HIV-2. Virology. 218, 159-168 (1996).
- Wehrly, K., Chesebro, B. p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents. Methods. 12, 288-293 (1997).
- Welker, R., Hohenberg, H., Tessmer, U., Huckhagel, C., Kräusslich, H. G. Biochemical and structural analysis of isolated mature cores of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 74, 1168-1177 (2000).
- Briggs, J. A., Wilk, T., Welker, R., Kräusslich, H. G., Fuller, S. D. Structural organization of authentic, mature HIV-1 virions and cores. EMBO J. 22, 1707-1715 (2003).
- Auewarakul, P., Wacharapornin, P., Srichatrapimuk, S., Chutipongtanate, S., Puthavathana, P. Uncoating of HIV-1 requires cellular activation. Virology. 337, 93-101 (2005).
- Accola, M. A., Ohagen, A., Göttlinger, H. G. Isolation of human immunodeficiency virus type 1 cores: retention of Vpr in the absence of p6(gag. J. Virol. 74, 6198-6202 (2000).
