Summary
Pinzette plasmoniche e nanostrutture a cristalli fotonici sono mostrati utili per produrre miglioramenti nel controllo efficienza e l'orientamento ottico cattura micro-e nano-particelle.
Abstract
Un metodo per manipolare la posizione e l'orientamento delle particelle inferiori al micron non distruttivo sarebbe uno strumento incredibilmente utile per la ricerca biologica di base. Forse la forza più utilizzato per raggiungere la manipolazione fisica non invasiva di piccole particelle è stato dielettroforesi (DEP). 1 Tuttavia, DEP da sola non ha la versatilità e la precisione che si desidera quando manipolare le cellule in quanto è tradizionalmente fatto con elettrodi fissi. Pinzette ottiche, che utilizzano un tridimensionale gradiente di campo elettromagnetico a esercitano delle forze sulle piccole particelle, ottenere questa versatilità e precisione desiderata. 2 Tuttavia, un grave inconveniente di questo approccio è l'intensità della radiazione di alta richiesti per raggiungere la forza necessaria per intrappolare una particella che possono danneggiare i campioni biologici 3 Una soluzione che permette di cattura e di smistamento con minore intensità ottici sono optoelettronici pinzette (OET) ma OET hanno limitazioni con la manipolazione multa di piccole particelle;.. essere DEP tecnologia basata mette anche vincolo sulla proprietà della soluzione 4 , 5
Questo articolo video descrivono due metodi che diminuire l'intensità della radiazione necessaria per manipolazione ottica di cellule viventi e anche descrivere un metodo per il controllo di orientamento. Il primo metodo è pinzette plasmoniche che utilizzano un casuale nanoparticelle d'oro (AuNP) array come substrato per il campione, come mostrato nella Figura 1. L'array AuNP converte i fotoni incidenti in plasmoni di superficie localizzata (LSP) che consistono in risonanza momenti di dipolo che irradia e generare un campo di radiazione fantasia con un gradiente di grandi dimensioni nella soluzione delle cellule. Il lavoro iniziale sulla cattura plasmonica di superficie maggiore di Righini et al modeling e la nostra stessa hanno mostrato i campi generati dal substrato plasmoniche ridurre l'intensità iniziale necessario, migliorando il gradiente di campo che intrappola le particelle. 6,7,8 L'approccio plasmoniche permette di multa controllo l'orientamento delle particelle ellissoidali e cellule con una bassa intensità ottico a causa di una conversione più efficiente l'energia ottica in energia meccanica e un dipolo dipendente dal campo di radiazione. Questi campi sono mostrati in figura 2 e la cattura a bassa intensità sono dettagliati nelle figure 4 e 5. I principali problemi con le pinzette plasmoniche sono che il LSP's generano una considerevole quantità di calore e la cattura è solo bidimensionale. Questo calore genera flussi convettivi e thermophoresis che può essere abbastanza potente da espellere particelle inferiori al micron dalla trappola. 9,10 Il secondo approccio che descriveremo è l'utilizzo di nanostrutture dielettrico periodici per diffondere la luce incidente in modo molto efficiente nelle modalità di diffrazione, come mostrato in figura 6 11. Idealmente, si potrebbe rendere questa struttura di un materiale dielettrico per evitare i problemi di riscaldamento stessa esperienza con la plasmoniche le pinzette, ma nel nostro approccio di alluminio rivestita reticolo di diffrazione viene utilizzato come unidimensionale nanostruttura dielettrica periodica. Anche se non è un semiconduttore, non ha subito un riscaldamento significativo ed efficace intrappolato piccole particelle con intensità di cattura basso, come mostrato in figura 7. L'allineamento delle particelle con il substrato grata convalida concettualmente l'idea che un 2-D cristalli fotonici potrebbe consentire la rotazione precisa di non sferiche micron di dimensioni. 10 L'efficienza di queste trappole ottiche sono aumentati a causa della maggiore campi prodotti dalle nanostrutture descritto nella questo documento.
Protocol
1. Array casuale Au Fabrication nanoparticelle 8,10,12,14
- L'array nanoparticelle Au è formata creando prima un modello che è fatto di un denso strato di lattice in modo casuale assorbito sfere con diametro medio di 454 nm. Questo risultato è ottenuto dal primo oro evaporazione su un vetrino di vetro per uno spessore di 20 nm usando cromo come il livello di adesione.
- Il monostrato sfera di polistirolo è poi auto-assemblati esponendo l'oro rivestite substrato ad una miscela di 1-etil-3-(3-dimetilamminopropil) carbodiimmide cloridrato (EDC), la sospensione sfera lattice e acqua deionizzata.
- Il processo di adsorbimento è consentito a durare per circa un'ora e non assorbita sfere vengono lavate via con abbondante acqua.
- Il monostrato formato è lasciati asciugare all'aria.
- Infine, un altro 20 nm di oro è evaporato in monostrato sfera di lattice per formare la serie casuale nanoparticelle d'oro.
- Se un SEM è disponibile, l'array AuNP può essere visto sotto il SEM a guardare come figura 1 e un diagramma del processo è mostrato in figura 8.
2. Preparazione del campione biologico 9,11
- Preparazione dei campioni per i nuclei del mouse ottico cattura cella è ora mostrato.
- 3T3 nuclei delle cellule del mouse taggati con acridina arancio colorante sono stati ottenuti dal gruppo Tewari presso il Fred Hutchinson Cancer Research Center.
- 10% di albumina di siero bovino (BSA) in tampone fosfato (PBS) si aggiunge ai nuclei delle cellule del mouse in una concentrazione di circa 1: 10 (BSA: Cell Nuclei mouse). La BSA aiuta a prevenire i nuclei di attaccarsi al substrato.
- Mescolare la soluzione utilizzando sonicazione.
- 5 ul della nostra soluzione si deposita sul vetrino serie alluminio grata. E 'preferibile eseguire questo passaggio con la grata di alluminio sul palco microscopio in modo che non c'è bisogno di trasporto del campione dopo la soluzione è depositato.
- Due pile di due 1 "1" coprioggetto vengono utilizzati per supportare un coprioggetto quinte attraverso il quale è visto il campione.
- Posizionare il campione al microscopio per la visualizzazione.
3. Metodo di trapping
- Le pinzette ottiche sono costruite inviando un 35 mW laser elio neon attraverso un Axio Imager.D1M Zeiss dotata di un set di 17 GFP filtro che viene modificato per consentire la radiazione laser 633 nm per raggiungere il campione.
- Un Zeiss LD CE Epiplan - Neofluar obiettivo 50x è usato per l'immagine del nucleo delle cellule, che sono circa 5 micron di diametro.
- Dopo che il campione è posto sotto l'obiettivo, l'attenzione al microscopio sulla matrice nanoparticelle d'oro o reticolo di diffrazione.
- Traduci microscopio verticalmente fino a fuoco l'immagine sui nuclei che si desidera trappola.
- Laser posto sulla posizione trappola particella e la particella dovrebbe mantenere la sua posizione nel punto laser anche quando il palco è tradotto.
4. Rappresentante dei risultati:
Il caso delle nanoparticelle d'oro procedure di serie dovrebbe depositare un monostrato di AuNP che può essere visto sotto un SEM ad assomigliare Figura 1. La forza di cattura creato da questi pinzette plasmoniche possono essere 10-20 volte la forza generata dalla norma pinzette ottiche. L'intensità minimo richiesto dalla pinzetta plasmoniche per raggiungere confinamento delle particelle sono mostrate per particelle di diverse dimensioni in Figura 4. 9,10 Il reticolo di diffrazione ottenuto l'allineamento e la cattura di 20 volte maggiore efficienza rispetto alla cattura nanodots oro e potrebbe raggiungere cattura con il poco a 17 uW / um 2 (Figura 7) 11.
Figura 1 10 (a) Micrografia SEM della auto-assemblati nanoparticelle di oro. Il diametro delle nanoparticelle d'oro individuale è di circa 450 nm. (B) immagine NSOM del substrato plasmoniche dove la distribuzione delle nanoparticelle è scarsa, dimostrando la quasi-campo di radiazione. La lunghezza d'onda del laser eccitazione è 633 nm. (C) vista Alto ingrandimento: la zona contrassegnata con il quadrato rosso in (b). (D) efficienza dello spettro Scattering del substrato plasmoniche, che mostra il picco a 624 nm. (E) efficienza dello spettro di assorbimento del substrato plasmoniche, che mostra il picco a 668 nm.
Figura 2 13 (a) Au nanosfere distribuiti casualmente su un dominio 2D 1 x 1 micron 2. Ogni puntino blu rappresentano il centro del nanosfere (a = 60 nm). Distribuzioni di campo dispersione su piani di osservazione che sono parallele alla matrice casuale nanosfere sono mostrati in (b) - (e). L'array nanosfere è uniformemente illuminato da un'onda piana alla lunghezza d'onda di 540 nm. L'indice di rifrazione del mezzo circostante è 1,33. La poladirezione rizzazione dei punti d'onda il piano lungo l'asse X (orizzontale in (a)). L'ampiezza del campo elettrico incidente è considerato uguale a 1 nel calcolo. La separazione tra il piano di osservazione e l'array è definito come nanosfere h. b) h = a. c) h = 2 bis. d), h = λ. e), h = 2λ.
Figura 3 9 Schema di configurazione personalizzata microscopio a fluorescenza tra cui un filtro di eccitazione bypassato e una dicroica sostituito beam-splitter. Questa è la configurazione utilizzata per la cattura simultanea e imaging di fluorescenza.
Figura 4 10 L'intensità del laser minima per mantenere la trappola in funzione della portata del fluido circostante utilizzando cattura plasmoniche. Tutte le intensità ottica sono misurati sul piano di campionamento nell'ambito dell'obiettivo microscopio. (A) - (f), mostrano i risultati di misura per perle di polistirene singolo con diametro 7.3, 6.3 (non sferica), 5,0, 3,9, 2,5 e 1,1 micron, rispettivamente. I riquadri mostrano le immagini corrispondenti di particelle microscopiche. Le barre di scala in tutte le immagini rappresentano il 5 micron di lunghezza.
Figura 5 10 La pendenza della retta con origine in fig. 4 rispetto alle dimensioni delle particelle per la cattura plasmoniche. Le barre di errore mostrano le deviazioni standard del adatta lineare. La pendenza della retta (rapporto tra la soglia di intensità ottica e portata) in fig. 4 ha una relazione approssimativamente lineare con la dimensione delle particelle, come mostrato in questa figura, indicando il vantaggio di cattura plasmoniche soprattutto per le particelle più piccole.
Figura 6 11 (a) Schema del intrappolamento ottico potenziato utilizzando nanostrutture periodici 1-D. Il fascio incidente è diffratto dalla nanostruttura periodici a campo lontano. (B) La distribuzione dell'intensità della luce con due polarizzazioni ortogonali nanostruttura in campo lontano. (B) La distribuzione dell'intensità della luce con due polarizzazioni ortogonali alla superficie di un reticolo di alluminio con un periodo di 417 nm ottenuti utilizzando simulazioni FDTD. La distribuzione è normalizzata sulla intensità su una superficie piatta in alluminio. (C) e (d) potenziale cattura per particelle direttamente sopra la superficie del reticolo rispetto a posizione della particella per (c) un polistirolo 350 nm tallone e (d) un polistirolo 1 micron tallone. I cerchi bianchi illustrano le dimensioni delle particelle. Riquadri mostrano il potenziale cattura di sopra di una superficie piatta in alluminio per la dimensione delle particelle stesse confronti. I valori sono normalizzati per ogni dimensione delle particelle. Per tutte le figure di simulazione FDTD il campo visivo è di 10 x 8 micron 2.
Figura 7 11 (a) l'efficienza e l'intensità Trappola cattura minima misurata per perle di polistirolo di varie dimensioni, con polarizzazione del fascio perpendicolare alle linee di griglia. Inserto trappola mostra asimmetria in termini di efficienza di cattura per tradurre una perpendicolare 3,87 um polistirolo tallone e in parallelo alle regole della griglia. La linea continua (grande asimmetria) è ottenuta con luce polarizzata incidente perpendicolarmente alla grata, e la linea trattino (piccola asimmetria) è ottenuta con luce polarizzata incidente parallelo al reticolo. L'unità è in (pN [mW / micron 2] -1). (B) - (d) dimostrazione cattura di una fluorescente 590 nm perline di polistirene. Il cerchio rosso indica la posizione del punto laser come la luce del laser era troppo debole per essere visto. In un primo momento la particella è intrappolata all'interno del punto di maggiore potenza, come il potere si abbassa il moto browniano della particella supera la forza cattura, permettendo la particella di scappare. (E) - (g) dimostrazione cattura di un nucleo cellulare fluorescente cancro ovarico. L'intensità minima necessaria per avviare cattura di 16 μW / micron 2, ottenuti utilizzando un obiettivo 20x.
Figura 8 14 procedimento di fabbricazione del tappo a forma di nanoparticelle d'oro: a) evaporazione dello strato di Cr e Au sottili sul vetro coprioggetti. b) L'esposizione alla sospensione sfera di polistirolo e di adsorbimento di sfere per 1 ora. c) eliminazione delle materie non adsorbito sfere di polistirolo e l'asciugatura della superficie. d) evaporazione di un altro strato di Au sulla parte superiore delle sfere modello. e) Schema del tappo a forma di array di nanoparticelle Au, dove Au copre solo la parte superiore delle sfere modello.
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Discussion
Il significato di questi metodi di cattura è che diminuire l'intensità ottica necessaria per la cattura sostenuta da qualche parte dell'ordine di 10 3 μW / 2 micron a qualche parte dell'ordine di 10 μW / micron 2. 10,11 I limiti su queste tecniche sono che la matrice di nanoparticelle d'oro esperienze problemi di riscaldamento che deve essere superato. Per ovviare a questo problema, una struttura a cristallo fotonico 2D che è composto di un materiale dielettrico può essere utilizzato. Tale struttura potrebbe teoricamente produrre trappole a bassa intensità di ottica e di controllo micro-e nano-particelle di rotazione e la posizione in modo preciso attraverso il controllo della polarizzazione di ingresso. I risultati grata nelle figure 6 e 7 mostrano che questo è vero per il caso 1D. Il passo successivo sarebbe quello di creare un cristallo fotonico 2D e dimostrare una serie di cristallo fotonico pinzette che avrebbe facilitato molte applicazioni di ricerca biologica.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Vorremmo anche ringraziare Xiaoyu Miao e Ben Wilson per lo sviluppo della maggior parte dei metodi descritti all'interno. Questo lavoro è stato finanziato dalla National Science Foundation (DBI 0454324) e l'Istituto Nazionale della Salute (R21 EB005183) e da PHS NRSA T32 GM07270 da NIGMS a ECK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | Company | Catalog Number | Comment |
| Axio Imager Microscope (D1M) | Carl Zeiss, Inc. | D1M | Zeiss Axio Imager.D1M |
| Microscope Objective (50x/0.55) | Carl Zeiss, Inc. | LD EC Epiplan - NEOFLUAR 50x/0.55 HD DIC | |
| Zeiss Microscope Camera (AxioCam MRc) | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Helium Neon Laser (35 mW) | Research Electro-Optics | ||
| Continuously Variable Attenuator | Thorlabs Inc. | NDC-100C-4M | For adjusting microscope intensity |
| Zeiss Filter Set #17 | Carl Zeiss, Inc. | 488017-9901-000 | Filter Set #17 |
| Microscope Slides, 0.5 mm thickness | VWR international | ||
| 3T3 mouse cell nuclei | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Store as cold as possible | |
| Acridine Orange dye | Fred Hutchinson Cancer Research Center | ||
| Bovine Serum Albumin, 1 to 10 ration in PBS | Fred Hutchinson Cancer Research Center | ||
| 454 nm polystyrene latex spheres | Polysciences, Inc. | ||
| carbodiimide hydrochloride (EDC) - 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) | G-Biosciences | BC25-1 | |
| gold (for deposition) | |||
| Reflective ruled diffraction grating | Edmund Scientific | ||
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X) | Invitrogen | 14190-144 |
References
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