Twee Soorten Assays voor het detecteren van Kikker Sperma chemoattractie

Summary

Eieren en de extracellulaire coatings rond eieren vaak los peptiden, eiwitten en kleine moleculen die communiceren met sperma om hen te begeleiden naar het ei daarbij het bevorderen van de bevruchting. Met behulp van kikker sperma beschrijven we en vergelijking van twee klassen van assays gebruikt om sperma chemoattractie detecteren - sperma accumulatie assays en sperma tracking assays.

Abstract

Sperma chemoattractie in ongewervelden kan voldoende robuust dat men een pipet met de aantrekkelijke peptide in een zaadcel schorsing plaats en microscopisch visualiseren sperma ophoping rond de pipet ^1. Sperma chemoattractie in gewervelde dieren zoals kikkers, knaagdieren en de mens is moeilijker op te sporen en vereist kwantitatieve bepalingen. Dergelijke tests zijn twee belangrijke soorten - testen die sperma beweging kwantificeren tot een bron van chemoattractant, de zogenaamde sperma accumulatie assays, en assays die daadwerkelijk volgen het zwemmen trajecten van individuele sperma.

Sperma accumulatie tests zijn relatief snel waardoor tientallen of honderden testen gedaan worden in een enkele dag, waardoor dosis-respons curves en tijd cursussen worden uitgevoerd relatief snel. Deze types van testen uitgebreid zijn gebruikt om vele gevestigde chemoattractie systemen karakteriseren - bijvoorbeeld neutrofielen chemotaxis naar bacriaal peptiden en sperma chemotaxis naar follikelvocht. Sperma tracking testen kunnen meer arbeidsintensief zijn, maar bieden aanvullende gegevens over hoe chemoattractancts daadwerkelijk veranderen het zwembad paden die sperma te nemen. Dit type test is nodig om de oriëntatie van het sperma beweging ten opzichte van de chemoattrractant gradiënt as te tonen en karakteristieke bochten of veranderingen in de oriëntatie die de zaadcellen dichter bij het ei te visualiseren.

Hier beschrijven we methoden die worden gebruikt voor elk van deze twee soorten testen. Het sperma gebruikte accumulatie assay is een zogenaamde "twee-kamer" assay. Amfibie sperma worden geplaatst in een weefselkweek bord plaatsen met een polycarbonaat filter vloer met 12 micrometer diameter poriën. Wisselplaten met sperma worden geplaatst in weefselkweek putjes met buffer en een chemoatttractant zorgvuldig gepipetteerd in de bodem goed waar de vloer voldoet aan de muur (zie afb. 1.). Na de incubatie, de top plaatst met daarin het sperma reservoir wordt zorgvuldig removed, en sperma in de onderste kamer die zijn gepasseerd door het membraan worden verwijderd, gepelletiseerd en vervolgens geteld door hemocytometer of flowcytometer.

Het sperma tracking test maakt gebruik van een Zigmond kamer oorspronkelijk ontwikkeld voor het waarnemen van neutrofielen chemotaxis en aangepast voor observatie van sperma door Giojalas en collega's ^2,3. De kamer bestaat uit een dikke glazen dia in die twee verticale troggen zijn bewerkt. Deze worden gescheiden door een 1 mm brede observatie platform. Na het aanbrengen van een afdekglas, sperma worden geladen in een trog, de chemoattractant-agent in de andere en de beweging van de individuele sperma gevisualiseerd door video microscopie. Videomateriaal wordt vervolgens geanalyseerd met behulp van software voor het twee-dimensionale cel bewegingen in het xy-vlak als een functie van de tijd (xyt data sets) dat het traject van elk sperma vorm te identificeren.

Protocol

1. Gebruikte materialen en buffers

1. Oöcyt Ringer-Buffer (1,5 x OR2) bevat 124 mM NaCl, 3,75 mM KCl, 1,5 mM _CaCl2, 1,5 mM _MgCl2, 1,5 mM Na ₂ HPO _4, 10 mM Hepes, pH 7,8. Bevruchting Buffer (F-1) bevat 41,25 mM NaCl, 1,25 mM KCl, 0,25 mM _CaCl2, 0,06 mM _MgCl2, 0,5 mM Na ₂ HPO _4, 2,5 mM Hepes, pH 7,8.
2. Xenopus laevis ei water wordt bereid volgens Sugiyama et al.. ^4. Kort beschreven, zijn vers voortgebracht gelei kikker eieren dwarrelden in een klein volume van de F-1 buffer gedurende 30 minuten en het geconditioneerde medium verwijderd door micropipet. Dit medium, aangeduid als "ei water", kan ook gebruikt worden om gezuiverd allurin, de belangrijkste chemoattractant in deze gelei extract te bereiden. Sperma worden verkregen uit commercieel gekweekt Xenopus laevis of Xenopus tropicalis.
3. Zie de tabel van materialen voor specifieke items die nodig zijn in tHij test.

2. Een twee-kamer-test voor de kikker sperma chemotaxis

1. Verdoven de kikker door onderdompeling in water met 0,07% benzocaine, onthoofden met behulp van een paar van carborundum scherpe schaar, en dubbele merg te euthanasie te verzekeren. Weggesneden buikhuid om spieren bloot te leggen. Maak middellijn en de laterale bezuinigingen op de buikspieren en intrekken. Zachtjes trekken darmen en vet naar wit, boonvormige testes te onthullen. Trim weg bindweefsel met een fijne schaar en voorzichtig om de bloedvaten te voorkomen. Verwijderen van een testis, weg te wassen geen bloed met behulp van 1,5 x OR2 buffer, dan rollen de testis op filtreerpapier om overtollig buffer en kleine aanhanger bloedvaten te verwijderen, en daarna de testis in een plastic pitre schotel in 0,2 ml van 1,5 x OR2 buffer. Vul een 5 ml spuit met 2 ml van 1,5 x OR2 buffer, zachtjes poke 10-20 gaten in de testis over het grootste deel van het oppervlak aan de ene kant, steek de naald aan de andere kant en voorzichtig injecteren buffer te spoelen sperma. Alternatief, eenkan injecteren buffer, terwijl porren de afslag gaten te spoelen sperma. Overdracht van het sperma suspensie op met een micropipet met een cut-off tip (het vermijden van afschuiving van het sperma) om een ​​microcentrifugebuis en plaats op ijs.
2. Schatting van het aantal zaadcellen kikker, verkregen door verdunning 1:100 sperma in 1,5 x OR-2 en het nemen van een 20 ul monster van het mengsel van sperma schorsing en tellen van het aantal cellen met behulp van een hemocytometer en de grote 1 mm ^2-gebied. Met behulp van de hemocytometer tellen en sampling-ratio te berekenen sperma dichtheid en het totaal aantal geoogste sperma. Dit totaal is meestal 2 - 6 x 10 ⁷ sperma in een volume van ongeveer 2 ml wanneer beide testes worden gebruikt. Verdun de voorraad sperma suspensie met 1,5 x OR2 buffer tot een zaadcel dichtheid van 2 x 10 ⁷ / ml te verkrijgen. Gebruik het sperma voor de test binnen 2 tot 3 uur na bereiding. Beoordeel beweeglijkheid van de zaadcellen door het verdunnen van 5 ul van het sperma 1:10 met F-1 buffer en visualiseren van bewegingen met behulp van fase-contrast optiek. Ten minste 40% tot 50% van het spermamoet beweeglijk zijn. Zelfs geschikt voorbereidingen bevatten een groot aantal van de immotile zaadcellen waarvan de meeste zijn onvolwassen.
3. Bereid een nieuwe 24-well plastic weefselkweek plaat door micropipetting 700 ul van F1 buffer in elk putje. Elk putje moet ongeveer 15 mm in diameter aan de onderkant.
4. Beginnen met een serie van testen door het verdunnen van 100 ui van het sperma opschorting met 900 pi F1 buffer bij kamertemperatuur (ongeveer 21 tot 23 ° C) in een microcentrifugebuis om spermamotiliteit activeren door osmotische shock. Elke keer vers sperma wordt geactiveerd op deze manier, moet het sperma worden gebruikt binnen 1-2 minuten.
5. Plaats een 12 urn porositeit te voegen (12 mm OD) in een buffer vol goed, zorg ervoor dat de insert plaatsing wordt niet in het midden en laat een ruimte aan een kant. Direct in 400 ul van motiliteit geactiveerd sperma in de put door een micropipet met een cut-off tip. Breng het sperma schorsing aan de wand van het filter plaatsen en laat het naar beneden lopen op de filter aan de onderkant van ee plaats, het sperma suspensie moet niet direct worden gepipetteerd op het filter.
6. Zorgvuldig micropipet 50 pl van chemoattractant middel in de put in de ruimte tussen de put en de off-center filter in te voegen. Men moet voorzichtig zijn om de daling waar de zij-en onderkant van de goed te voldoen en de pipet terug te trekken, zonder verstoring van het systeem storting. In het bijzonder moet de zuiger op de micropipet worden geduwd alleen aan de eerste stop om zo volledig de steekproef, maar geen luchtbellen te verwijderen.
7. Herhaal de stappen 2.5 en 2.6 hierboven om zo veel testen beginnen als nodig is, dan broeden de plaat tot aan de start eerste test heeft geïncubeerd 50 minuten. Normaal gesproken, kan men beginnen met een test om de 45 tot 60 seconden. Merk op dat de test kan worden gestroomlijnd door een ervaren persoon of door twee personen samen te werken. In dit geval, een of twee rijen van testen kan worden gestart met een grotere voorraad van beweeglijk sperma en sneller pipetteren op voorwaarde dat het sperma worden altijd gebruikt binnen 1 tot 2 minutenactivering.
8. Stop elke test in de reeks begonnen. De eerste, voorzichtig gestage het filterelement met een hand en met de andere verwijder zorgvuldig de meeste of alle van het sperma suspensie in de bovenste kamer van micropipet of door afzuigen met een pasteur pipet. Onmiddellijk, met een fijne pincet, trek de filter plaatsen en gooi deze weg. Zorg moet worden gebruikt bij deze stap, althans de resterende sperma worden geveegd door het filter artifactually het verhogen van de waarden voor sperma passage.
9. Van elke plaat goed, de overdracht van de gehele sperma suspensie naar een microcentrifugebuis. Het is belangrijk om het sperma schorsing mix in de goed voorafgaand aan de herroeping, omdat het sperma hebben de neiging om zich te vestigen op de bodem. Voeg 15 ul van 25% formaldehyde tot een uiteindelijke concentratie van 0,5% v / v en in de koelkast als het aantal zaadcellen zijn niet hetzelfde gedaan dagen.
10. Pellet het sperma in elke buis met behulp van een 10 seconden drukknop draaien op een persoonlijke microcentrifuge met een maximale snelheid van 2000 x g. Verwijder alle maar 100 ul van supernatant van elke buis, dan resuspendeer de pellet in dat volume. Neem 20 ul van sperma schorsing, verdunnen 1:10 met gedestilleerd water, en rekenen sperma op een hemocytometer met behulp van een 40x objectief op een rechtop microscoop. Gebruik de graven en verdunningsfactoren het totale aantal zaadcellen dat door het filter gepasseerd in elke test te berekenen.

3. Frog sperma tracking test met behulp van een Zigmond kamer

1. Bereid de omgekeerde microscoop werkstation voor video-opnamen. We maken gebruik van een Nikon Elipse TE300 omgekeerde microscoop uitgerust met een Sony DXC-390 3-chip kleuren analoge videocamera of een Hamamatsu ORCA-03G monochrome digitale camera. De Zigmond kamer slide moet rusten op het podium up-side-down met een voldoende opening in het podium plaat om een ​​22x40 mm afdekglas tegemoet te komen. Dit arrangement is noodzakelijk door het feit dat de kikker zaadcellen niet in staat zijn om te zwemmen tegen de zwaartekracht in. Focus ofwel een 4x of 10x objectief op de observatie-platform loopt tussen de tweetroggen.
2. Testen om ervoor te zorgen dat de camera is gericht en gericht op de observatie-platform. Als de Sony camera wordt gebruikt, wordt de uitvoer naar een video-monitor en een A / D converter (frame grabber) die in staat van digitalisering van 7 beelden per seconde van de video-signaal. De digitale stream wordt verwerkt met behulp van een computer draait op 3 GHz of hoger bij voorkeur met 4 GB of meer RAM-geheugen. Hoewel we gebruik van Scion Image software (een aangepaste Windows-versie van NIH Image) controleren van een Scion CG-7 framegrabber, deze producten zijn niet langer beschikbaar. Een huidige oplossing is om Image J-software te gebruiken met een VirtualDub Plug-in voor analoge videocamera vast te leggen. Als de Hamamatsu camera wordt gebruikt, is de digitale uitgang verwerkt door Olympus cellSens software en weergegeven op het computerscherm. In beide gevallen wordt de data opgeslagen op een interne of externe harde schijf als een 8-bit tiff stack. Gebruik van de Scion Image software vereist omzetting van de TIFF-afbeeldingen volgorde om een ​​stapel met Image J.
3. Bereid de chemoattractant op een juiste concentratie in de Formule 1 buffer. Bereid Xenopus laevis sperma zoals eerder beschreven en op te slaan in 1,5 x OR2 buffer op ijs tot gebruik.
4. Monteer de Zigmond kamer. Begin met een droge, schone kamer. Met behulp van een micropipet plaats een lijn van siliconenolie (4 pl) ongeveer 5 mm van en evenwijdig aan de buitenste rand van elke trog. Plaats een 22x40 mm dekking van glas op de kamer zodat de siliconenolie gelijkmatig verspreiden naar de buitenste rand van elk trog. Als voorlopige experimenten tonen aan dat sperma plakken een probleem is, kan men de vacht van de dekking van glas nodig hebben met nitrocellulose zoals voorgesteld door Fabro et al.. ^3. Alternatively kunnen opnemen van eiwit in de buffers gebruikt (bijvoorbeeld 1% BSA) ook verminderen sperma plakken.
5. Omkeren van de kamer en plaats over de ronde uitsparing in de microscoop stadium worden Zorg ervoor dat de dekking van glas niet contact maken met het podium. Deze omgekeerde configuratie is nodig om Xenopus sperma te brengen van de trog op het platform. In tegenstelling tot zoogdieren sperma, Xenopus sperma zijn niet sterk genoeg om te zwemmen tegen de zwaartekracht in naar het platform te bereiken.
6. Activeer 20 ul van Xenopus sperma in 1.5 x OR2 buffer door het mengen van 1:10 met F1 buffer bij kamertemperatuur. Met behulp van een micropipet met een cut tip, direct in 70 ul van motiliteit-geactiveerde sperma in de trog. Dit wordt bereikt door houden van de micropipet bij een lage hoek en het plaatsen van de tip aan de zijkant opening van de trog. De uitgeworpen celsuspensie vult de trog en de brug door capillaire werking. Vervolgens vult u het tegenovergestelde dieptepunt op dezelfde manier met behulp van een chemoatttractant oplossing.
7. Begin video-opnamen binnen 3 minuten (Xenopus sperma hebben een beperkte beweeglijkheid levensduur) en verder gedurende 5 minuten. Aan het eind van video-opnamen, demonteer de kamer en was de troggen en observatie platform met een onder druk staande stroom van water en vervolgens ethanol uit een spuit fles. Verwijder de siliconen olie uit de bovenste oppervlak met papieren doekjes en let niet op de observatie-platform en dalen besmetten.
8. Indien nodig, zetten de video data opgeslagen op een TIFF-afbeelding sequentie of stack met Image J-software. Open het bestand in Image J en in de eerste 21 frames (3 seconden) ervoor kiezen maximaal 50 sperma te worden gevolgd. Om te voorkomen dat bias, koos sperma uit alle regio's van de waarneming veld en zonder kennis van hun traject gegevens. Leg twee-dimensionale cel trajecten in het xy vlak als een functie van de tijd (xyt data sets) voor elk sperma door de point and click van de muis met behulp van de MtrackJ plug-in module voor Image J. Visualiseer trajecten en bereken trajectafstanden, as componenten en snelheden binnen de MtrackJ. U kunt ook het uitvoeren van deze operaties en de verdere numerieke analyse (bijvoorbeeld gerichtheid, chemotaxis parameters en parameter histogrammen), door het importeren van xyt datasets in Microsoft Excel.
9. Plot trajecten voor elk sperma in Excel om de algemene patronen van de beweging zoals lineaire, kromlijnige en cirkelvormige patronen en functies zoals bochten te detecteren. Gebruik maken van xyt data sets te berekenen gemiddelde kromlijnige snelheid, net langs de X (gradiënt) - en Y-as, en oriëntatie parameters zoals de gemiddelde hoek van reizen ten opzichte van de gradiënt as.

4. Representatieve resultaten:

Belangrijke technische parameters in de twee kamer assay zijn grootte en vorm van de kamer, de porositeit van het membraan, en de lengte van incubatie. De grootte van de bovenste kamer die de zaadcellen moeten niet zo groot in diameter om een ​​groot volume van de zaadcellen (pre nodigferably 0,5 ml of minder), noch moet de bovenste kamer zo diep als een hoge kolom van celsuspensie (<1 cm) te creëren. Het volume van de tweede kamer buffer rond de bovenste kamer insert moet exact overeenkomen met het niveau van de cel suspensie in de steek, zodat er geen een transmembraan hydrostatische druk die artifactually zou sperma dwingen door het membraan te creëren. Plaatsing van de lege plaatsen in de bodem goed eerst, gevolgd door sperma laden resulteert in een initiële opwaartse hydrostatische druk die sperma voorkomt gaan door het membraan tijdens het laden. Keuze van membraan poriegrootte wordt bepaald door de grootte van het sperma, en de commerciële beschikbaarheid van poreus membraan inserts. We vinden dat de assays met kikker sperma of kunnen 8 of 12 micrometer diameter poriën te gebruiken, hoewel 12 um porie voor passage van hogere aantallen zaadcellen waardoor meer nauwkeurige telling. Poriegrootten groter dan 12 micrometer lijken niet commercieel verkrijgbaar zijn. Een alternatief voor het gebruik tissue cultuur inserts is het gebruik van de neuroprobe membranen ontworpen voor chemotaxis assays in 96-well platen. Deze bieden een potentieel grotere verwerkingscapaciteit en een breder scala aan poriediameters. Hoewel de grotere zoogdieren sperma lijkt een grotere poriën met een diameter nodig is, hebben we met succes getest muis sperma chemotaxis met behulp van inzetstukken met 12 um poriën (Burnett, ongepubliceerde waarnemingen). In tegenstelling, zouden kleinere poriën afmetingen geschikt zijn voor kleinere sperma (bijv. zee-egel), hoewel we nog niet getest deze mogelijkheid.

Een nadeel van de beschreven twee-kamer-test is dat zaadcellen worden geplaatst in de bovenste kamer dus onvermijdelijk in een aantal zaadcellen passage door de zwaartekracht, waardoor het verminderen van de signaal-achtergrond ratio. Dit is noodzakelijk door het feit dat Xenopus sperma niet krachtig genoeg in hun beweeglijkheid te zwemmen tegen de zwaartekracht net als zoogdieren sperma. Een andere moeilijkheid in het testen van Xenopus sperma is het feit dat hun beweeglijkheid lIFE de tijd is kort - 5 tot 15 minuten na activering. Deze beperking is de basis voor nodig om een ​​nieuwe batch van sperma om de 2 à 3 minuten bij de uitvoering van meerdere testen te activeren. Als gevolg hiervan hebben tijdsverloop studies aangetoond dat de meeste sperma passage plaatsvindt binnen de eerste 20 minuten van de analyse ^5. Hoewel we gebruik van een 50 minuten incubatietijd, kan deze termijn waarschijnlijk worden kortgesloten naar 20 of 30 minuten. In tegenstelling tot, bijvoorbeeld muis zaadcellen die beweeglijk blijven voor uren, hebben we gebruikt tot een periode van 2 uur test met goede resultaten (Burnett, ongepubliceerde waarnemingen).

In de twee-kamer-test met behulp van kikker sperma, het totale aantal zaadcellen dat door de poreuze membraan is normaliter 10 tot 20 duizend of ongeveer 1 tot 2% van het sperma geplaatst in de bovenste kamer in te voegen. Aanwezigheid van een chemoattractant gradiënt in de Tweede Kamer kan toenemen sperma passage zo veel 4 tot 10-voudige. Figuur 2 illustreert een typische dosis-respons curve uitgevoerd met deze test. Een Buitengewoonhandeling van het Xenopus ei jelly ("ei water") met de bekende chemoattractant eiwit allurin (rode cirkels), werd geplaatst in de onderste kamer in een reeks van verdunningen. De totale ei-water-eiwit in elke test wordt gegeven in microgram / test - het bedrag geleverd in de originele 50 ul volume. Sinds de geleverde eiwit zal een diffusie gradiënt vormen, is de feitelijke concentratie bereik van eiwit dat sperma reageren niet bekend, maar kan worden geschat op 5 tot 10 keer lager dan de eiwitconcentratie van de geleverde de druppel. Om deze reden, noteren we de hoeveelheid eiwitten geïntroduceerd, niet de concentratie. Meestal voeren we twee-of drievoud assays voor elke dosis en het gemiddelde van de resultaten; we dan repliceren het hele experiment 3 of 4 keer met behulp van sperma van verschillende mannen in elk experiment. Het gemiddelde en de standaardfout van het gemiddelde wordt berekend voor elke dosis met de standaard error van het gemiddelde meestal wordt 5 tot 10% van het gemiddelde. Merk op dat eiwitten zonder known chemoattractant activiteiten zoals bovine serum albumine (open cirkels, Fig. 2) kan leiden tot een laag niveau, niet-specifieke toename van de zaadcellen doorgang door het membraan. Een interessante observatie is dat de dosis-respons curve voor ei water multifasische is - een stijgende fase en een dalende fase. Dit type multifasische relatie is normaal voor sperma chemoattractants, de reactie van het menselijk sperma om follikelvocht toont een soortgelijke bifasische relatie ⁶ waarvan wordt gedacht dat nuttig zijn, dat hoge concentraties van chemoattractant gevonden in de omgeving van een ei kan dienen om verder te zoeken reacties afnemen van de kant van het sperma.

Af en toe vinden we dat de controle-waarden voor deze test zijn hoger dan normaal, waardoor de voudige toename geproduceerd door een chemoattractant. Meestal kan dit terug te voeren op de mechanische verstoring van het filterelement tijdens de test. Het is dus belangrijk dat de inzetstukken niet gestoord worden tijdens het laden van de sperma of chemoattractant, tijdens de test incubatie of wanneer de insert wordt verwijderd. Bijzonder belang is dat het sperma reservoir in de insert is verwijderd door micropipet of zuiging voor het opheffen van de insert uit de put. Dit zorgt ervoor dat het sperma worden niet geveegd door de poreuze membraan in de onderste kamer als de insert is verwijderd.

Belangrijke technische parameters in de kamer Zigmond test onder meer de afstand tussen het dekglaasje en observatie-platform, de vergroting van de video-observatie, het type van de gebruikte optica, en de frame rate. Afstand tussen de observatie platform is normaliter 10 tot 15 micrometer, hoewel deze afstand kan worden gevarieerd door de hoeveelheid siliconenolie gebruikt als interface tussen de dekking van glas en de kamer schuif - hoe meer olie, hoe groter de afstand. Een dun vlak van vocht verhoogt de hoeveelheid tijd die nodig is voor een gradiënt te vormen, alsook de levensduur van het verloop ooit gevormd. Een dikkere vlak van vloeistof maakt een snellere gradient formatie, maar de helling heeft een kortere levensduur en minder stabiliteit. De dynamiek van de gradiënt vorming kan gevisualiseerd worden met behulp van een fluorescerende kleurstof of een fluorescerend dextran in de chemoattractant goed en met behulp van fluorescentie microscopie om de dynamiek te geven. De test reagens moet worden afgestemd in moleculair gewicht aan de chemoattractant wordt gebruikt en de dynamiek vastbesloten gebruikt om te beoordelen hoeveel minuten moeten worden toegestaan ​​voor de gradiënt de vorming en opname van sperma bewegingen.

De gebruikte vergroting moet lage totale (4x of 10x objectief) zijn als de gehele observatie-platform wordt gevisualiseerd als in de test voorwaarden die wij hebben beschreven. Aan de andere kant kan een hogere vergroting (40x of 63x objectief) handig zijn als men van plan is op relatief korte traject segmenten of wenst monitor flagellaire bewegingen op te lossen. Tracking kan worden uitgevoerd door semi-handmatige methoden, zoals beschreven in dit artikel of door automatische tracking zoals die in meer sophisticated software pakketten zoals Metamorph of Imaris Track. In beide gevallen, het gemak van tracking is erg afhankelijk van het beeldcontrast of het door de exploitant of door software-ondersteunde objectherkenning. Hoewel helderveld optiek kan worden gebruikt in sommige gevallen gebruik van fasecontrast of donkerveld optiek optiek is vaak noodzakelijk. Ten slotte is de frame rate is afhankelijk van het gewenste tijdsresolutie in tracking. Als semi-handmatige methoden worden gebruikt als in onze procedure, is een waarschijnlijk beperkt tot relatief lage framerate - 4 tot 8 beelden per seconde - als gevolg van het arbeidsintensieve karakter van registratie van gegevens. Aan de andere kant kan video rate observaties nodig zijn voor een snelle reactie, zoals flagellaire golfvormen. Vaak zijn experimentele doelen het best gediend door het doen van lagere frame rate experimenten en snellere frame rate experimenten apart, omdat men ook wenst te wijzigen andere parameters, zoals vergroting, optica, of digitale beeldverwerking.

Typische resultaten voor de ZigmOND kamer tracking test bestaat uit een set van de trajecten zoals die gezien voor vijftig kikker sperma in de videoclip van Movie 1. Tegen een beeld van de observatie-platform, zijn de trajecten van de individuele sperma getraceerd in het rood voor een controle-experiment (geen chemoattractant gradiënt aanwezig). De twee-dimensionale cel trajecten in het xy vlak als een functie van de tijd voor elke sperma kunnen worden uitgezet en gelogd door MtrackJ en geïmporteerd in Microsoft Excel. Voor traject analyse, we wijzen de chemoattractant gradiënt-as als de X-as en de Y-as als de orthogonale-as, in overeenstemming met het verdrag oorspronkelijk ontwikkeld door Fabro et al.. ^3. Zoals weergegeven in het diagram van figuur 3, de genomen eigenlijke traject is opgebouwd uit stappen, waarvan de som van de lengte gelijk is aan de kromlijnige afgelegde afstand in het traject (blauw / goud pijlen). De netto-afstand en de oriëntatie van reizen door iedere zaadcel is een vector het verbinden van de eerste en laatste punt van het traject (rode diagonale pijl). Denetto-reizen kan worden gescheiden in de X-as-component en de Y-as component (rood gestippelde pijlen, ook wel netto delta-X en de netto delta-Y, respectievelijk).

Omdat de chemotaxis in gewervelde dieren sperma kan gaan om relatief subtiele verschuivingen in de richting van reizen, grote aantallen zaadcellen (100 tot 300), willekeurig gekozen, zijn meestal geanalyseerd voor elke aandoening waarvoor vaak gepoolde gegevens 4-6 onafhankelijke experimenten. Ter illustratie, echter, zullen we gebruik van gegevens uit slechts vijftig kikker sperma. Tabel 1 illustreert gemeenschappelijke parameters die worden gebruikt om veranderingen in het sperma reizen op te sporen. De gemiddelde netto-reizen langs de X-as sterk zal toenemen indien, in het bijzijn van een chemoattractant, het sperma bevolking als geheel volgt trajecten die beter af te stemmen met het verloop. In ons voorbeeld, de gemiddelde netto-X-as verplaatsing steeg meer dan drie keer in de aanwezigheid van ei water. Men kan een histogram van de netto-X-as verplaatsing ook plot voor het sperma bevolking, die de voordelen heeft tage dat kleinere subpopulaties van responsieve sperma kan worden gedetecteerd. Twee parameters ontwikkeld door Fabro et al.. ³ kan ook helpen bij het ​​opsporen dergelijke populaties. Zowel het percentage van de zaadcellen met een positieve netto X-as (% ΔX> 0) en het percentage van de zaadcellen met netto-lineaire reizen niet meer dan 45 graden van de gradiënt-as (% ΔX / | ΔY |> 1) kan drastisch toenemen als de hele sperma bevolking is gevoelig voor de chemoattractant of door kleinere maar wel significante hoeveelheden als subpopulaties van sperma zijn gevoelig. Ons voorbeeld in Tabel 1 toont toename van zowel de parameters voor vijftig kikker sperma blootgesteld aan een ei water verloop. Merk op dat willekeurige niet-georiënteerde beweging zal niet-nul waarden geven voor beide parameters van 50% respectievelijk 25%, controle waarden hoger zijn dan dit (zoals die in tabel 1) vormen een achtergrond als gevolg van hetzij een lage monster nummer of tot een scheeftrekking in het sperma richting het bijzonder voor de experimentele opzet.

content "> Directionaliteit van sperma reizen in reactie op chemoattractant agents kunnen direct worden beoordeeld door theta, de hoek tussen de vector van de netto-reizen voor elke sperma en de gradiënt (X)-as. Ons voorbeeld in tabel 1 blijkt dat de gemiddelde theta afgenomen voor de zaadcellen zwemmen in een ei water gradiënt geeft aan dat sperma trajecten als een bevolking beter werden afgestemd met het verloop. Net als bij de netto X-as (zie hierboven), kan thetas voor het sperma bevolking worden uitgedrukt als een distributie, een aanpak ook gevoelig tot subpopulaties van responsieve sperma en een die onlangs is onderzocht door Gakamsky et al. ^7.

Ten slotte kunnen kromlijnige en ogenblikkelijke snelheden voor individuele sperma ook worden gehaald uit de gegevens die twee-dimensionale cel trajecten in het xy vlak als een functie van de tijd. Men zou vinden dat er een toename van de snelheid en een verschuiving in de richting van de reis, wat erop wijst een chemokinetische reactie alseen chemotactische respons.

Deze gegevens vormen een uitgangspunt voor de analyse van sperma trajecten. Verdere analyse kan onder meer metingen van het traject lineariteit en kromming op een moment tot moment basis zoals uitgevoerd door Böhmer et al.. ⁸ en Shiba et al.. ^9, de geautomatiseerde detectie van bochten zoals uitgevoerd door Burnett et al.. ^10, en de niet-lineariteit als gemeten door fractal-analyse ^11,12. Op voorwaarde dat zaadcellen zwemmen deze trajecten worden gecontroleerd bij hogere vergroting, kan men ook foto flagellaire moties en real-time calcium signalen die door verschillende laboratoria ^{8,9,13,14,15,16.} Dergelijke studies hebben aangetoond dat zowel ongewervelde dieren en zoogdieren sperma om chemoattractants reageren door scherpe bochten van het sperma omhoog gradient de richting van de chemoattractant bron. Deze bochten worden begeleid door flagellaire bochten dat sperma oriëntatie veranderen veel als een roer zou bochten die lijken te geïnitieerd door gedefinieerd, golf like calcium signalen verspreiden via het flagellum. Zo, het uiteindelijke doel van sperma tracking is te correleren signaleringssysteem dynamiek met veranderingen in flagellaire voortstuwing, dat als de basis van sperma oriëntatie dienen in een chemotactische gradiënt. Deze doelen moeten nog worden bereikt in Xenopus sperma die reizen in een spiraalvormige beweging ^17, vertonen een lage kromming in hun trajecten ^10, en waarvan de calcium-signalen moeten nog worden gecontroleerd.

Hoewel we hier gericht op details van de test methoden die wij gebruiken voor het Xenopus laevis sperma, zowel de twee kamer sperma accumulatie test en de Zigmond kamer tracking test kan gebruikt worden voor zoogdieren zaadcellen als bepaalde wijzigingen worden aangebracht. Beide testen kunnen worden uitgevoerd bij 37 ° C indien gewenst, door middel van een dia warmer en in de Zigmond kamer assay, een microscoop podium warmer. Typisch zal zoogdieren sperma worden geïsoleerd, capacitated en geïncubeerd met geschikte zoogdier buffers eend chemoattractants, maar data-analyse zullen worden vergelijkbaar met wat hier beschreven wordt voor de amfibiesoorten. Een ander verschil is dat de Zigmond kamer meestal rechtop gezet op het podium van een rechtopstaande microscoop sinds zoogdieren sperma, in tegenstelling tot Xenopus sperma, kan zwemmen op de observatie-platform. Nog niet getest, kunnen deze twee testen te zien toepassing op sperma van een aantal soorten in de toekomst te werken.

Figuur 1. Schematische weergave van de twee-kamer-test. Sperma worden geplaatst in een insert de bodem van dat is een polycarbonaat filter met 12 um poriën. Een chemoattractant oplossing is zorgvuldig gepipetteerd in de put om de vorming van een concentratiegradiënt te starten.

Figuur 2. Representatieve gegevens voor kikker sperma met behulp van de twee-kamer sperma chemotaxis test. Ei water bereid uit X. laevis eieren vertoont een multifase dosis-activiteit curve die kenmerkend is voor sperma chemoattractants. Bovine serum albumine verhoogt sperma passage slechts iets - een niet-specifieke effect van eiwit. Figuur gewijzigd ten opzichte van Al-Anzi & Chandler ^5.

Film 1. Een videoclip toont kikker sperma trajecten uitgezet in het rood op de observatie platform van een Zigmond kamer. De breedte van het platform is 1 mm. Klik hier om de videoclip te bekijken.

Figuur 3. Axis conventies, een zaadcel kromlijnige traject en een vector voor de netto-lineaire reizen zijn uitgezet op de Zigmond kamer observatie platform. Verkregen gegevens zijn van drie types. Ten eerste kan het sperma trajecten zelf (blauw / gouden pijlen) onthullen specifieke patronen such als cirkels en draait (sterretjes). Kromlijnige afstand en kromlijnige snelheden gemeten kunnen worden voor het traject pad. Ten tweede, de netto-lineaire afgelegde afstand over het gehele traject, van de netto-X (gradiënt) as onderdeel van de reis kan de netto-Y-as onderdeel van reis-en de hoek theta tussen de X-as en de vector van de netto-reizen worden berekend voor elk traject en vergeleken als een verdeling over opgespoord alle sperma. Ten derde, onmiddellijke veranderingen in de snelheid en richting van de reizen voor segmenten binnen de individuele trajecten kunnen bestudeerd worden individueel of als een populatie. Hierboven is een zijaanzicht van de kamer die in een diagram.

Tabel 1. Parameters vaak gebruikt in het analyseren van gegevens uit de Zigmond kamer.

Discussion

Chemotaxis van cellen verplaatsen door een van beide amoeboid beweging of flagella-powered zwemmen is te vinden in vele biologische contexten en de studie van dit fenomeen vereist de beschikbaarheid van praktische en betrouwbare testen. Enkele voorbeelden van het fenomeen, zoals de aantrekkingskracht van sperma naar een zee-egel ei of het verzamelen van de slijmzwam cellen aan een vruchtlichaam vormen, hebben directe visuele impact. Kwantificering van dit fenomeen is uitgevoerd in een verschillende manieren, zoals beschreven door Eisenbach ^18. Deze testen omvatten het gebruik van chemoattractant gevuld haarvaten om sperma te trekken, het gebruik van haarvaten verbinden reservoirs tot een gradiënt en het gebruik van een Makler kamer met putten voor sperma en chemoattractant te creëren. Dit artikel beschrijft twee "tweede generatie" testen die nu worden steeds vaker gebruikt. Hoewel deze tests nog steeds rekenen op de noodzaak om een ​​gradiënt zij zijn gebaseerd op verschillende nieuwe functies te creëren. Ten eerste, de twee kamer test heeft als voordeel dat een groot aantal poriën sample sperma passage over het verloop in plaats van een capillair opening waardoor meer sperma om de gradiënt te testen in een enkele assay.

Patronen van gerichte cel beweging zijn een belangrijk onderdeel in de chemotaxis en het is logisch dat nieuwe formaten voor tracking-cellen zijn ontwikkeld. Een nieuw formaat, is de drie-dimensionale scan van het sperma trajecten bij het naderen van een ei. Met behulp van een bewegend vlak van infra-rood licht om sperma posities te detecteren, hebben Zimmer en zijn collega's die sperma traject van gegevens in een kamer met het ei het midden - een apparaat dat de natuurlijke chemoattractant bron gebruikt en heeft een relatief verre muren die anders zouden kunnen verstoren natuurlijke sperma beweging ^19. Als alternatief, Corkidi et al.. ontwikkelde een systeem combineert snelle bewegingen van een lange werkafstand objectief met een hoge frame rates te vangen drie-dimensionale trajecten ^20. Analyse van de sperma bewegingen in deze apparaten is onlangs vergemakkelijkt door het gebruik van polaire coördinatietes ²¹ en Guerrero et al.. hebben onlangs nog gewezen op de noodzaak voor drie-dimensionale observaties van sperma chemotaxis in toekomstige studies ^13.

In tegenstelling, is het gebruik van cartesiaanse coördinaten vergemakkelijkt door de Zigmond kamer, een apparaat dat werd door Sally Zigmond ontwikkeld voor de studie van de neutrofielen-oriëntatie en chemotaxis en het eerst getoond aan nuttig zijn in de studie van het sperma chemotaxis door Giojalas en collega's ^2,3. Het gebruik van een lineaire dieptepunt van chemoattractant in plaats van een puntbron van chemoattractant kan een chemische gradiënt op te richten in een XY-coördinaten systeem in plaats van een radiale coördinaat systeem. Giojalas heeft aangevraagd deze test op de studie van chemotaxis in sperma van mensen, muizen, konijnen en stuurt en bevestigde de bevinding dat de vloeistof uit follikels in de eierstokken een chemoattractant ^2,3,22 bevat. Meer recent hebben Giojalas en Eisenbach aangetoond dat progesteron afgegeven door cumulus cellen rond het ei ookfungeert als een zaadcel chemoattractant ^23-26. Inderdaad, progesteron is onlangs aangetoond dat de opening van Catsper kanalen in sperma trigger om de calcium-signalen te starten dacht dat sperma flagellaire buigen en daarmee de richting van de zaadcellen zwemmen ^27,28 te wijzigen.

De Zigmond kamer heeft zowel voordelen als nadelen. Een voordeel is optisch eenvoud in dat sperma worden onderhouden in een set focal plane en geen scannen van de Z-dimensie is noodzakelijk. Een ander voordeel is het gebruik van cartesiaanse coördinaten die meer vertrouwd zijn voor de meeste onderzoekers en aan te moedigen het testen van nieuwe parameters ontwikkeld, met een relatief vaak voor wiskunde. Aan de andere kant, de Zigmond kamer zorgt voor een situatie in tegenstelling tot die in de natuur gevonden. De zaadcellen worden gemaakt om te zwemmen tussen twee muren van dichtbij die waarschijnlijk hun repertoire van flagellaire golfvormen evenals de uitkomst van de resulterende krachten beïnvloeden. Ook de gebruikte chemoattractant is meestal chemischeen verspreid anders dan zou het gevolg zijn van een ei. Tot slot, sperma plakken aan muren is een potentieel probleem dat niet aanwezig zou zijn in een drie-dimensionale ruimte.

Terwijl sommige onderzoekers suggereren dat sperma tracking is de enige betrouwbare manier om sperma chemotaxis studeren, kunnen deze assays worden arbeidsintensief, zowel de experimentele en data-analyse stadia kan ontwikkelen als semi-handmatig in plaats van geautomatiseerde methodes worden gebruikt. Om deze reden, assays zoals de twee-kamer-test hier beschreven zijn gebruikt om de kwantitatieve en reproduceerbare gegevens die bewijs voor chemotaxis kunnen geven. Dit type test is ontstaan ​​met de Boyden kamer, waarin een neutrofielen suspensie werd in contact gelegd met het oppervlak van een poreus filter barrière ^29. Een chemoattractant oplossing werd in contact gebracht met de andere kant van het filter waardoor een chemische gradiënt te vormen binnen de filter zelf. Cellen het invoeren van de filter matrix kan ofwel worden gekleurd en geteld microscopically of, indien radioactief gemerkt, geteld in een scintillatieteller. Deze aanpak werd verder ontwikkeld door het gebruik van grote poriën polycarbonaat filters waardoor de chemotaxing cellen daadwerkelijk kon passeren als in de twee kamer test hier beschreven ^5.

Eerder we hebben gekeken naar de twee-kamer-test als een maat voor de kikker sperma chemotaxis. De eerste, met behulp van ei water als lokstof, hebben we aangetoond dat stimulatie van de zaadcellen doorgang door de filter vereist dat een concentratie gradiënt worden gecreëerd door afzetting van een enkele druppel van chemoattractant in de onderste kamer. Als de chemoattractant is verspreid over de onderste kamer buffer door het mengen, is het sperma beweging niet gestimuleerd ^5. Ten tweede, de oprichting van een 'omgekeerde gradiënt "door toevoeging van de chemoattractant naar de bovenste kamer niet het stimuleren van de doorgang van het sperma. Tot slot vinden we dat in het sperma volgen van experimenten in de Zigmond kamer, sperma beweeglijkheid en snelheid isniet verminderd of ongeacht de richting van het sperma reizen ten opzichte van de gradiënt (Burnett, ongepubliceerde waarnemingen) veranderd. Deze laatste constatering is belangrijk omdat het is op gewezen dat remmers van beweeglijkheid van de zaadcellen in feite zou kunnen vertragen of sperma stoppen in de buurt van de chemische bron dus de presentatie van een kunstmatig opeenstapeling van sperma dat kan worden verward als chemotaxis ^18.

Ondanks deze beperkingen, hebben sperma accumulatie assays zoals de twee-kamer-test bleek zeer nuttig arbeidsbesparende instrumenten die behulpzaam waren bij het ​​karakteriseren van neutrofielen chemotaxis om bacteriële peptiden ^29,30, in de eerste ontdekking van zoogdieren sperma chemoattractie om follikelvocht en progesteron ^6,31,32, en in de zuivering en karakterisering van de kikker sperma chemoattractant allurin ^4,5,33.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plates	BD Biosciences	35/1147
12 mm outer diameter inserts with 12 μm pore membrane	EMD Millipore	PIXP01250	We previously used Costar-Corning transwell plate #3403 -now discontinued
Zigmond chamber	Neuroprobe	Z02
Silicone oil	GE Healthcare	SF1154	Equivalent to Dow Corning 550 Fluid
Image J software	Wayne Rasband, Research Services Branch, National Institute of Mental Health	Free download at http://rsbweb.nih.gov/ij	Java program that runs on Windows, Linux and Mac
MtrackJ software	Biomedical Imaging Group	Free download at http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/	Java program that runs on Windows, Linux and Mac
Virtual Dub software	GNU General Public Licensed	Free download via http://www.virtualdub.org/index.html	Setup instructions at the Image J website under plugins; for Windows only
cellSens software	Olympus Corporation	See website: http://www.olympusamerica.com/seg_section/product.asp?product=1070	Controls and acquires images from a variety of cameras. Also has image processing capability