Summary
हम मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं के साथ (hiPSC) रेट्रोवायरल Oct3 / 4, Sox2, Klf4 और ग Myc (OSKM) एन्कोडिंग वैक्टर और जीना धुंधला द्वारा सही ढंग से reprogrammed किया hiPSC की पहचान का उपयोग कर में कुशल मानव दैहिक कोशिकाओं के reprogramming के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान Tra 1-81 एंटीबॉडी.
Abstract
यहाँ हम मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं (hiPSC) रेट्रोवायरल सोडियम 1-3 butyrate की उपस्थिति में Oct3 / 4, Sox2, Klf4 और ग Myc (OSKM) एन्कोडिंग वैक्टर का उपयोग में मानव वयस्क fibroblasts के reprogramming की एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. हम इस विधि का इस्तेमाल करने के लिए reprogram करने के लिए देर बीतने के (> p10) मानव वयस्क है Friedreich गतिभंग रोगी से प्राप्त fibroblasts (GM03665, Coriell भंडार). reprogramming के दृष्टिकोण अत्यधिक कुशल पारगमन वायरस युक्त मीडिया की उपस्थिति में fibroblasts की दोहराव centrifugation प्रोटोकॉल का उपयोग भी शामिल है. reprogrammed किया hiPSC कालोनियों Tra-1-81 के लिए जी Immunostaining का उपयोग पहचान की गई, pluripotent कोशिकाओं की सतह मार्कर, गैर reprogrammed किया fibroblasts से अलग और मैन्युअल 4,5 passaged है. ये hiPSC तो Matrigel प्लेटों को हस्तांतरित किया गया और फीडर से मुक्त परिस्थितियों में reprogramming की थाली से सीधे हो गई. पारित होने से पहले शुरू, hiPSC कालोनियों HES-एल विशेषता दिखाना हैike आकारिकी. इस प्रोटोकॉल का प्रयोग चयनित कालोनियों के 70% से अधिक सफलतापूर्वक और विस्तार कर सकते हैं सेल लाइनों में स्थापित है. स्थापित hiPSC लाइनों सतह टीआरए-1-60 मार्करों और SSEA-4, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से परमाणु / 4 Oct3 मार्करों, Sox2 और Nanog सहित विशेषता pluripotency मार्कर प्रदर्शित. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल स्थापित किया गया है और वयस्क है Friedreich गतिभंग रोगियों और नियंत्रण व्यक्तियों 6, मानव नवजात fibroblasts, के रूप में अच्छी तरह से मानव keratinocytes से प्राप्त fibroblasts का उपयोग कर परीक्षण किया.
Protocol
1. वायरस उत्पादन और पारगमन
- ~ 7 - 8x10 6 प्रति 10 DMEM मध्यम उच्च ग्लूकोज DMEM, 10% FBS निष्क्रिय गर्मी, 2 मिमी एल glutamine, कोई एंटीबायोटिक दवाओं के 10 मिलीलीटर में सेमी थाली के घनत्व पर थाली फीनिक्स Ampho कोशिकाओं. इनक्यूबेटर संस्कृति और रात भर में 37 पर जगह डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2.
- अगले दिन transfect फीनिक्स कोशिकाओं का उपयोग कर एक सदिश एन्कोडिंग का 12 μg या तो Oct3 / 4, Sox2, Klf4, सी Myc, या GFP जीन (Addgene प्लास्मिड 17,217, 17,218, +१७२१९, 17,220) और 35 μl Fugene 6. DMEM मध्यम (DMEM उच्च ग्लूकोज, 2 मिमी एल glutamine, कोई FBS और एंटीबायोटिक दवाओं) के 500 μl में अभिकर्मक मिश्रण तैयार करें. 20 मिनट सेते हैं. धीरे से 10 सेमी प्लेटों में 70-80% संगामी फीनिक्स कोशिकाओं से युक्त डीएनए परिसरों विंदुक.
- 8 घंटे के बाद DMEM मध्यम (DMEM उच्च ग्लूकोज, 10% FBS निष्क्रिय गर्मी, 2 मिमी एल glutamine) युक्त पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ अभिकर्मक मीडिया की जगह - 6.
- इसके बाद एकत्र वायरस युक्त मीडिया 12 में 4 बार जअंतराल, सब भाग गठबंधन और एक .45 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करने के लिए अलग कोशिकाओं और मलबे (मीडिया वायरल कणों से युक्त संक्रामक गतिविधि को खोने के बिना 2 सप्ताह के लिए फ्रिज में रखा जा सकता है, लेकिन ठंड नहीं की सिफारिश की है) को हटाने फ़िल्टर.
- लिए रेट्रोवायरल एक जमे हुए शेयर 24 घंटे से, पारगमन प्लेट मानव वयस्क (10 बीतने, Coriell प्रयोगशालाओं) fibroblasts रेट्रोवायरल मीडिया संग्रह के आखिरी दिन से पहले. बीज घनत्व 1x10 5 DMEM उच्च ग्लूकोज में अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं में 6 जिलेटिन अच्छी तरह से कवर प्लेट पर कोशिकाओं, 10% FBS, 2 मिमी एल glutamine, पेनिसिलिन, स्ट्रेप्टोमाइसिन और गैर आवश्यक अमीनो एसिड.
- वायरल फीनिक्स कोशिकाओं से प्राप्त कणों से युक्त मीडिया के साथ अगले दिन स्थानापन्न DMEM मीडिया. वायरल (Oct4 प्रत्येक के 1 मिलीग्राम, Sox2, Klf4, और सी Myc मीडिया, 4 मिली कुल) मीडिया fibroblast संस्कृतियों और अपकेंद्रित्र के 6 अच्छी तरह से थाली की हर अच्छी तरह से में 6 μg / polybrene का मिलीलीटर के साथ पूरक के लिए 1600g पर जोड़ें 20 ° सी. 1 लगभग 12 घंटे वायुसेनाआतंकवाद पारगमन, fibroblast संस्कृति माध्यम के साथ वायरल मीडिया की जगह. वायरल संक्रमण प्रदर्शन करना और 24 घंटे के अंतराल में 3 बार centrifugation.
- संस्कृति fibroblasts DMEM मीडिया में अंतिम संक्रमण के बाद 48 घंटे के लिए. रेट्रोवायरल GFP व्यक्त मीडिया साथ समानांतर transductions के द्वारा संक्रमण की क्षमता की जाँच करें. चित्रा 1 centrifugation मानव fibroblast की सुविधा रेट्रोवायरल संक्रमण की दक्षता दिखाता है.
2. Reprogramming की
- Γ विकिरणित MEF फीडर परतों के साथ ~ 2x10 5 कोशिकाओं के घनत्व में जेलाटीन के प्रति MEF कोशिकाओं के बीज बोने की क्रिया द्वारा 6 से अच्छी तरह प्लेटें तैयार 6 fibroblast वृद्धि मध्यम में अच्छी तरह से थाली का इलाज किया. अगले दिन संक्रमित मानव fibroblasts विभाजित 0.05% का उपयोग करते हुए से trypsin / EDTA और उन्हें बीज fibroblasts ~ के घनत्व में वृद्धि मध्यम 4 1.2x10 अच्छी तरह से प्रति.
- अगले दिन HES (DMEM/F12, 20% नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट, गैर आवश्यक अमीनो एसिड, penicilli मीडिया के साथ मीडिया की जगहn / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 2 मिमी एल glutamine, 0.1 मिमी β mercaptoethanol, 20 एनजी / मिलीलीटर बेसल fibroblast वृद्धि फैक्टर (bFGF), reprogramming की प्रारंभिक 7 दिनों के लिए 0.5 मिमी सोडियम butyrate साथ पूरक. मीडिया दैनिक बदलें.
- हैं transduced कोशिकाओं में morphological परिवर्तन दैनिक मॉनिटर. के फीडर कोशिकाओं पर transduced fibroblasts स्थानांतरित करने के बाद 10 दिनों के कूल्हों की तरह कोशिकाओं की कालोनियों के लिए लगभग 5 उभरना शुरू कर देंगे. उन्हें MEF फीडर कोशिकाओं पर चढ़ाना के बाद 28 दिनों hiPSC कालोनियों के लगभग 14 अलग किया जा करने के लिए तैयार हैं.
3. HiPSC कालोनियों का अलगाव
- उठा hiPSC कालोनियों से एक दिन पहले 24 fibroblasts विकास मध्यम में γ - विकिरणित MEF फीडर कोशिकाओं (अच्छी तरह से प्रति ~ 4x10 4 कोशिकाओं) के साथ अच्छी तरह प्लेटें तैयार करते हैं. इस स्तर पर hiPSC कालोनियों को भी फीडर मुक्त Matrigel और mTeSR1 माध्यम का उपयोग करते हुए संस्कृति को हस्तांतरित किया जा सकता है.
- HiPSC कालोनियों के अलगाव से पहले हटाने के द्वारा fibroblasts विकास mediu MEF प्लेटें तैयारमीटर और पीबीएस के साथ MEFs rinsing के FBS का निशान हटाने. इसके बाद 10 माइक्रोन रॉक Y27632 अवरोध करनेवाला के साथ 0.5 मिलीलीटर HES मध्यम (है या Matrigel लेपित कुओं के मामले में mTeSR1 मध्यम) प्रत्येक अच्छी तरह से 7,8 को जोड़ने.
- यदि आवश्यक हो, लामिना का प्रवाह हुड (सी - चित्रा 2A) में घुड़सवार एक खुर्दबीन के नीचे एक 21 गेज सुई के साथ hiPSC कालोनियों के आसपास के fibroblasts हटा दें. पीबीएस के साथ प्लेट कुल्ला और ताजा HES Tra-1-81 StainAlive विशिष्ट एंटीबॉडी (1:200, Stemgent) युक्त मीडिया को जोड़ने. 30 मिनट के बाद, ताजा hes 10 माइक्रोन रॉक अवरोध करनेवाला के साथ पूरक मीडिया के साथ प्रतिरक्षी युक्त मीडिया की जगह. फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे प्लेटों की जांच करने और निशान Tra-1-81 सकारात्मक उद्देश्य मार्कर (चित्रा 2 डी) का उपयोग कर कालोनियों.
- कट Tra-1-81 एक लामिना हुड में सकारात्मक hiPSC एक खुर्दबीन के नीचे कालोनियों, कई छोटे टुकड़ों में एक 21 गेज सुई का उपयोग कर के रूप में चित्रा 2 ई और एफ में दिखाया गया
- इंडस्ट्रीज़ में एक स्वचालित विंदुक (P200) hiPSC कालोनियों के हस्तांतरण के टुकड़े का उपयोग24 अच्छी तरह से थाली के साथ MEFs या Matrigel ividual कुओं. गैर - कूल्हों कोशिकाओं को स्थानांतरित करने से बचें. एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में प्लेटें प्लेस और hiPSC कालोनियों 24-36 घंटे के लिए अनुमति देते हैं.
- बदलें HES या mTeSR1 (कालोनियों Matrigel पर हो के लिए) मीडिया दैनिक. सही आकारिकी HES की तरह साथ hiPSC कालोनियों 48 घंटे 24 अच्छी तरह से थाली पर प्रारंभिक स्थानांतरण के बाद दृश्य होगा.
- मैन्युअल रूप से पारित होने के hiPSC हर 6 कालोनियों एक 12 अच्छी तरह से और बाद में एक 6 अच्छी तरह से थाली पर पर 8 दिन.
- Clonal विस्तार और hiPSC लाइनों की स्थापना के बाद, pluripotency टीआरए-1-60, SSEA-4, / 4 Oct3, Sox2 और Nanog मार्करों immunocytochemistry का उपयोग के रूप में 3 चित्र में दिखाया गया की अभिव्यक्ति का विश्लेषण. जीनोमिक अखंडता और भेदभाव प्राप्त कुपोषण और teratoma गठन 6,9 विश्लेषण का उपयोग कर लाइनों की क्षमता का मूल्यांकन.
4. प्रतिनिधि परिणाम
Retrovirus युक्त मैं मीडिया के साथ कुशल पारगमनसफल reprogramming के लिए महत्वपूर्ण हैं. यह संपूर्ण प्रक्रिया / अभिकर्मक संक्रमण एक वायरस हर reprogramming के प्रयोग को व्यक्त करने के लिए क्षमता की निगरानी के रूप में चित्र 1 में दिखाया गया GFP का उपयोग आचरण की सिफारिश की है. GFP व्यक्त वायरस की अनुमापांक निर्धारित के रूप में 10 में वर्णित मानव fibroblasts की गैर केंद्रित वायरल मीडिया आम तौर पर 0.5 की रेंज में था का उपयोग पारगमन के माध्यम से - 5 एक्स 10 मिलीलीटर (वी.पी. / एमएल) प्रति 7 वायरल कणों.
Fibroblasts आकारिकी अंतिम संक्रमण के बाद के रूप में 2 दिन के रूप में जल्दी बदलना. Trypsinized मानव fibroblasts ध्यान से MEF फीडर कोशिकाओं पर उन्हें बोने के लिए पूर्व में गिना जाना चाहिए. यह 3 अलग अलग घनत्व (3 6x10, 1.2x10 4, 4 एकल प्रति अच्छी तरह से एक अच्छी तरह से थाली 6 2.5x10) में बीज कोशिकाओं के लिए सिफारिश की है के बाद से प्रत्येक कोशिका लाइन विभिन्न विकास विशेषता को दर्शाता है और बोने घनत्व reprogramming की दक्षता के लिए महत्वपूर्ण है. सोडियम के लिए इस्तेमाल किया butyrateप्रारंभिक 7 - 14 दिन reprogramming की लगभग 5 गुना hiPSC गठन की क्षमता बढ़ जाती है. अक्सर, खासकर जब संक्रमित fibroblasts उच्च घनत्व पर वरीयता प्राप्त थे, fibroblast कोशिकाओं की तरह एक संस्कृति डिश ऊंचा हो जाना और hiPSC कालोनियों को कवर चित्रा 2A में दिखाया के रूप में कर सकते हैं. इस मामले में, तंतुप्रसू परत ध्यान और उठाया hiPSC कालोनियों (चित्रा 2B) को उजागर कर सकते हैं हटा दिया. बाद में, hiPSC कालोनियों HES मीडिया के साथ rinsed होना चाहिए और Tra-1-81 एंटीबॉडी के साथ दाग. Fibroblast कोशिकाओं के आधार पर, लगभग 20 - 40% iPSC तरह आकारिकी साथ प्रदर्शन कालोनियों की Tra-1-81 प्रतिरक्षी साथ नहीं दाग नहीं है. 24 घंटों की पहचान की hiPSC कालोनियों 12 अगले भीतर एक थाली से स्थानांतरित किया जा सकता है. लंबे समय तक ऊष्मायन hiPSCs के तेजी से भेदभाव में परिणाम होगा. कालोनियों मैन्युअल रूप से या तो MEF फीडर कोशिकाओं या Matrigel - लेपित प्लेट पर passaged किया जा सकता है. बाद विस्तार स्थापित hiPSC का क्लोन (आईसीसी) immunocytochemistry pluripoten की अभिव्यक्ति के लिए का उपयोग कर परीक्षण किया जाना चाहिएcy मार्कर के रूप में चित्रा 3 में प्रदर्शन किया. Pluripotency जीन अभिव्यक्ति का उपयोग कर RT-पीसीआर, डीएनए demethylation के pluripotency 9 मुंह बंद transgenes के जीन के विश्लेषण के प्रमोटरों पर प्रदर्शन का विश्लेषण: इसके अतिरिक्त, उत्पन्न आईपीएस कोशिका लाइनों की एक विस्तृत आणविक लक्षण वर्णन शामिल करना चाहिए.
आकृति 1. वायरल पारगमन GFP रेट्रोवायरल मीडिया के साथ लगातार दो संक्रमण के बाद GFP व्यक्त retrovirus (ए, बी) मानव वयस्क है Friedreich गतिभंग रोगी से प्राप्त fibroblasts (GM03665, Coriell भंडार) कल्पना का उपयोग करके निर्धारित की दक्षता. (सी, डी) मानव fibroblasts GFP रेट्रोवायरल 1 के लिए 1600g पर 6 अच्छी तरह से प्लेट पर सीधे कोशिकाओं की centrifugation के बाद मीडिया के एक ही बैच के साथ. संक्रमित थे. छवियाँ संक्रमण के बाद 48h कब्जा कर लिया गया.
चित्रा 2. और hiPSC कालोनियों की पहचान और अलगाव (ए) चरण fibroblasts से घिरा hiPSCs युक्त थाली के विपरीत छवि. कोशिकाओं HES मीडिया पर 21 दिनों के लिए संवर्धित किया गया. (बी, सी) आसपास के तंतुप्रसू परत के हटाने के बाद ही hiPSC कॉलोनी. (डी) सही ढंग से reprogrammed किया hiPSC कालोनियों Tra-1-81 सतह मार्कर एंटीबॉडी के साथ जीना धुंधला द्वारा पहचाने जाते हैं, एक बाँझ सुई (ई, एफ) का उपयोग कर में कटौती और एक 24 - अच्छी तरह से थाली की अलग - अलग कुओं को हस्तांतरित.
चित्रा 3. Immunocytochemistry pluripotency विशिष्ट / 4 Oct3 मार्करों, Nanog, Sox2, SSEA4 और hiPSCs में Tra-1-60 की अभिव्यक्ति के द्वारा निर्धारित किया गया था.
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Discussion
मानव रोगों, विशेष रूप से तंत्रिका विज्ञान और neurodegenerative अध्ययन, विशेष रूप से किया गया है पर्याप्त मानव सेलुलर मॉडल की अप्राप्यता के कारण चुनौतीपूर्ण. प्रेरित pluripotent स्टेम सेल और क्षमता में आसानी से प्राप्य दैहिक कोशिकाओं reprogram करने के लिए उन्हें विविध प्रकार की कोशिकाओं में अंतर करने की क्षमता करने के लिए एक आनुवंशिक बीमारियों के सेलुलर मॉडल बनाने की संभावना खोला. इसके अलावा, IPSCs पुनर्योजी चिकित्सा के भविष्य में एक महान वादा पकड़. इसलिए, यह आवश्यक है pluripotency दैहिक कोशिकाओं reprogramming की विश्वसनीय, कुशल और सुरक्षित तरीके को विकसित करने और अनुकूलन.
चिकित्सीय अनुप्रयोगों के परिप्रेक्ष्य से, यह iPSC पीढ़ी के सुरक्षित दृष्टिकोण मेजबान जीनोम में पदचिह्न म्यूटेशनों की कमी को विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है. Episomal वैक्टर अभिकर्मक के रूप में reprogrammed किया कोशिकाओं के जीनोम में स्थायी परिवर्तन को शुरू करने के बिना reprogramming की दैहिक सेल के तरीके, उत्पाद शुल्क योग्य टीआरए का उपयोगnsposons, adenoviral संक्रमण, और mRNA के या प्रोटीन की प्रत्यक्ष वितरण पहले से ही 11-15 स्थापित किया गया है. इस प्रकार अब तक reprogramming की इन transgene मुक्त तरीकों का उपयोग दक्षता कम है और, चरित्र और reprogrammed किया दैहिक कोशिकाओं के प्रकार उम्र पर निर्भर करता है. इसलिए, इन प्रोटोकॉल देर बीतने के reprogramming के लिए उपयुक्त नहीं हैं, वयस्क दैहिक कोशिकाओं अक्सर सेल खजाने में जमा है. इसके अतिरिक्त, कई iPSC लाइनों की विस्तृत लक्षण वर्णन को सक्षम करने के लिए और मानव रोगों के नए मॉडल की स्थापना और उच्च throughput दवा स्क्रीन आचरण, दैहिक प्रतिलेखन कारकों के वायरल वितरण का उपयोग कोशिकाओं की reprogramming की एक पर्याप्त रणनीति है. 20 से अधिक अध्ययन की तारीख मॉडल मानव तंत्रिका विज्ञान और neuromuscular बीमारियों के रोगी विशेष IPSCs की पीढ़ी की सूचना दी. लेकिन सभी मामलों में IPSCs lentiviral या रेट्रोवायरल 16 पारगमन का उपयोग कर उत्पन्न किया गया.
हमारे डेटा को दिखाना है कि एक साधारण वें पर आधारित प्रोटोकॉलई रेट्रोवायरल वितरण OSKM प्रतिलेखन कारकों के लिए कुशलतापूर्वक एक उच्च मार्ग की भी वयस्क मानव fibroblasts, reprogram इस्तेमाल किया जा सकता है. 10 सेमी प्लेट पर फीनिक्स कोशिकाओं के एक अभिकर्मक से प्राप्त वायरस की राशि 10 से अधिक reprogramming के प्रयोगों के लिए पर्याप्त है. हमारे वयस्क fibroblasts की reprogramming के प्रोटोकॉल में तीन महत्वपूर्ण कदम हैं: (i) के अत्यधिक कुशल वायरल पारगमन पारगमन है जो नाटकीय रूप से पारगमन की क्षमता बढ़ जाती है के दौरान एक अतिरिक्त कदम centrifugation द्वारा सुविधा, (ii) transduced तंतुप्रसू के MEFs पर बोने और घनत्व ( iii) Tra-1-81 मार्कर एंटीबॉडी के साथ रहते धुंधला का उपयोग करने के लिए जो सीधे फीडर - मुफ्त संस्कृतियों के लिए हस्तांतरित किया जा सकता है संभवतः पूरी तरह से reprogrammed किया कालोनियों का चयन की सुविधा. reprogramming की दक्षता काफी reprogramming के दूसरे सप्ताह के दौरान सोडियम butyrate का उपयोग करके बढ़ाया है. इसके अलावा, हम ने कहा कि iPSC कालोनियों का एक बड़ा अंश में सुसंस्कृतदवा की उपस्थिति और विस्तारित किया जा सकता है पूरी तरह से reprogrammed किया iPSC पंक्तियों में स्थापित किया गया था.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
यह काम है Friedreich गतिभंग रिसर्च एलायंस और अर्नोल्ड परिवार फाउंडेशन और स्टेम सेल और एमडी एंडरसन कैंसर केंद्र में विकासात्मक जीवविज्ञान के लिए केंद्र से एक पायलट अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 | |
| KSR | Invitrogen | 10828 | |
| Non-essential aminoacids | Invitrogen | 11140 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| bFGF | Stemgent | 03-0002 | |
| Tra-1-81 antibody | Stemgent | 09-0069 | |
| Oct3/4 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-8628 | |
| Nanog antibody | Cell Signaling Technology | 4903S | |
| Tra-1-60 antibody | EMD Millipore | MAB4360 | |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579S | |
| SSEA4 | EMD Millipore | MAB4304 | |
| CF1 MEFs | Globalstem | GSC-6201G | |
| Objective marker | Nikon Instruments | MBW10010 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 05850 | |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| Fugene 6 | Roche Group | 11814443001 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Object marker | Nikon Instruments | MBW10010 |
References
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