Summary
Células desempenham um papel fundamental e crescente na pesquisa e na descoberta e desenvolvimento de novas terapêuticas. Com esta crescente necessidade de maior número de células que precisam de maneiras mais eficientes e eficazes para o cultivo e colheita de células apego dependente. Um frasco de múltiplas camadas com as características certas pode servir a esse propósito.
Abstract
Um número crescente de aplicações baseadas em células requerem um grande número de células. Utilização de camada única T-frascos, que são adequados durante a pequena escala de expansão, pode tornar-se complicado, trabalhoso e demorado quando um grande número de células são obrigatórios. Para atender a essa necessidade, o desempenho de um novo navio cultura multi-camadas de células para facilitar escala fácil de células da camada única T-frascos serão discutidos. Os frascos testados estão disponíveis em 3 - e 5-camada formato e permitir que a cultura ea recuperação completa de três e cinco vezes o número de células, respectivamente, em comparação com T-175 frascos. Uma característica chave do BD Flask Multi-é uma porta de mix / equilíbrio que permite rápida em recipiente de mistura, bem como distribuição uniforme de células e reagentes dentro e entre as camadas de cada navio e consistentemente produzem células que podem ser cultivadas em um ambiente que é congruente a T-175 frascos.
O projeto destes frascos Multi-também permite cacesso pipeta onvenient para adicionar reagentes e células diretamente no frasco, bem como a recuperação eficiente de células valiosas e reagentes e reduz o risco de contaminação devido a vazamento. Para aplicações onde o vazamento é preferível a pipetagem, o projeto permite a retenção de líquido residual mínima, de modo a reduzir o desperdício de valiosas células e reagentes.
Protocol
1. Protocolo a ser usado Multi-Frascos para cultura de células
- Preparação dos vasos e adição de suspensão de células
- Prepare meio de crescimento celular, conforme necessário.
- Line up multi-Flask verticalmente em seu lado com a tampa virada para cima na superfície de trabalho (capela de fluxo laminar estéril).
- Estes estão disponíveis em frascos de 3 e 5 camadas formatos e usar um padrão de fluxo de trabalho semelhante a um balão de T-175.
- Solte e remova as tampas. Adicionar a quantidade necessária de pré-aquecido médio em frasco utilizando uma pipeta de 50 ou 100 mL ou por vazamento.
- Pipetas que são ≤ 10 ml pode chegar ao fundo do vaso quando Multi-Frascos são colocados verticalmente, com tampa virada para cima. Pipetas ≥ 10ml possa chegar até o navio imediatamente após o logotipo no Flask Multi-, proporcionando assim um portal conveniente para adicionar maiores volumes de mídia para navio.
- Para evitar bolhas de meio, permitir fluxo de líquido para flow ao longo da parede interna da tampa multi-Flask (logo-side).
- Adicionar suspensão celular a partir de um estoque de células concentrados em meio de crescimento através da camada superior usando uma pipeta de 10 mL e frascos cap.
Dicas:
- Transporte Multi-Frascos em um carrinho para o site incubadora e executar as etapas restantes.
- A densidade de semeadura de células irá variar dependendo do tipo de célula, médio e precisam duração cultura. Comece com a densidade de semeadura e volume de mídia ao usado no padrão T-175 frascos e multiplicar por 3 ou 5, dependendo do Flask Multi-formato utilizado.
- Mistura de células
- Mix posição: Segure o Flask Multi-ereto com o logotipo voltado para você e vire anti-horário para um ângulo de 45 ° com a porta mix voltado para você.
- Exploração no mesmo ângulo, incline ligeiramente Multi-Flask da frente para trás (pescoço longe de você) até que o líquido na camada superior drena totalmente downwards através da porta mix. Pivot no mix porta lateral.
- Da mesma forma, agite levemente Flask Multi-de trás para frente (pescoço para você) até meio ralos plenamente da camada inferior para a parte superior através da porta mix. Repita os passos 1.2.2 e 1.2.3 mais uma vez para assegurar a mistura adequada.
- Traga Multi-Flask de volta à posição mix (Passo 1.2.1) e prossiga para a Etapa 1,3
- Alternativamente, suspensão de células podem ser preparados externamente a partir do Flask Multi-e suspensão de células pode ser adicionado ao recipiente utilizando uma pipeta ou por gentil vazamento.
- Porta permite misturar em recipiente de mistura de células com a mídia e elimina a necessidade de grandes volumes de células em suspensão externamente.
- Ele também permite equalização de mídia em todas as camadas da Flask Multi-
- Equilíbrio de fluidos
- Depois de misturar / adição de suspensão de células, coloque Flask Multi-verticalmente sobre uma superfície de trabalho plana para equalizar o volume de líquido equally em todas as camadas.
- Líquido partição em cada camada
- Segure o frasco Multi-com o logotipo voltado para você e gire no sentido horário para um ângulo de 45 ° para particionar o líquido para cada uma das camadas.
Dica:
- Para melhores resultados, é importante o uso de uma superfície de trabalho apartamento em Passos 1,3-1,4
- Segure o frasco Multi-com o logotipo voltado para você e gire no sentido horário para um ângulo de 45 ° para particionar o líquido para cada uma das camadas.
- Transporte
- Uma vez que a mídia contendo suspensão de células é particionado, transporte Flask Multi-na mesma 45 ° de ângulo (sentido horário) como no Passo 1.4.1 com a mídia longe do porto mix em incubadora. Esta posição também é adequado ao remover frascos de incubadora para a visualização de um microscópio.
- Colocando Multi-Flask em incubadora prateleira
- Segurando Multi-Flask no ângulo de 45 ° (sentido horário, longe da porta-mix), gentilmente gire-o para baixo horizontalmente na superfície incubadora (usando o canto longe do porto como um mixpivot). Lay Multi-Frasco com logotipo voltado para cima.
- Falcon design Multi-Flask permite que navios a serem empilhados e os mantém no lugar por uma costela resistente empilhamento.
- Segurando Multi-Flask no ângulo de 45 ° (sentido horário, longe da porta-mix), gentilmente gire-o para baixo horizontalmente na superfície incubadora (usando o canto longe do porto como um mixpivot). Lay Multi-Frasco com logotipo voltado para cima.
- Distribuição das células e reagentes
- Depois de colocar Multi-Flask sobre uma superfície plana de trabalho, gentilmente rock e para trás e para os lados para distribuir uniformemente as células em superfícies de cultura de tomar cuidado para não derramar líquido de cada camada. Pilha de frascos.
- Este balão é feito de material translúcido e células sobre a última camada pode ser facilmente visualizado em um microscópio.
- Depois de colocar Multi-Flask sobre uma superfície plana de trabalho, gentilmente rock e para trás e para os lados para distribuir uniformemente as células em superfícies de cultura de tomar cuidado para não derramar líquido de cada camada. Pilha de frascos.
- Media Exchange
- Aspirar enquanto inclinando Flask Multi-o para a esquerda (mistura de porta-side) com o logotipo voltado para você.
- Em seguida, incline o frasco Multi-à direita, continuando a aspirar todos os meios de comunicação residual.
- Adicionar a quantidade apropriada de mídia e siga as etapas 1,3-1,7
2.Colheita de células multi-Frascos
- Dissociar células, line up Multi-Frascos verticalmente e levar cada um a posição Mix (Passo 1.2.1). Inverta suavemente frascos com pescoço de frente para você, de modo a permitir que a media de drenagem para a camada superior da Multi-Flask.
- Inserir um 5 ou 10 mL ponta de aspiração através do pescoço até chegar a nível de líquido perto do porto mix. Aspirar meio esgotado.
- Adicionar dissociação tampão reagente / lavar e trazer para Mix posição como no Passo 1.2.1, então prossiga e siga os passos de 1,3-1,7. Neutralize com meio de crescimento / agente neutralizante e despeje suspensão de células em um tubo de receber ou inverter frasco de modo que as células de drenagem para a camada superior do navio e recolher as células usando uma pipeta de 10 mL.
Dica: Para aumentar a recuperação de células ou reagentes, trazer Multi-Flask para misturar posição (Passo 1.2.1), inverta com o pescoço para operador para permitir a drenagem completa de mídia da Al l camadas para a camada superior. Então, Flask Multi-inclinação no sentido horário para ângulo de 45 ° (longe da porta mix) enquanto o Flask Multi-permanece invertida. Use uma pipeta (10-10 mL) para coletar os reagentes restantes.
3. Recomenda volume de trabalho na Falcon Multi-Frascos
Meio de crescimento
3-Layer: 75-150 mL por Multi-Flask
5-Layer: 125-250 mL por Multi-Flask
Dissociação agente
Layer-3: ≥ 15 mL por Multi-Flask
5-Layer: ≥ 25 mL por Multi-Flask
Dica: Comece com um volume de meio utilizado no padrão T-175 frascos e multiplicar por 3 ou 5 vezes, dependendo do Flask multi-formato avaliados para que mL por unidade de superfície continua a mesma.
4. Resultados representativos:
1. Projeto de Falcon Flask Multi-
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. Figura 1: Flask Multi-Cultura de Células embarcações estão disponíveis em uma 3 - e 5-camada formato empilhável para scale-up de células fornecendo 525 e 875 cm 2 de superfície de crescimento, respectivamente. Pipeta de acesso facilita a adição e remoção de células e reagentes em e fora do navio. Presença de port-mix permite rápida em recipiente de mistura e equalização de media em todas as camadas da Multi-Flask.
2. Rendimento das células usando multi-Flask:
Estas embarcações estão disponíveis em 3 camadas e 5 camadas formatos que correspondem a 3 e 5 vezes a área da superfície da T-175 frascos. Assim, ≥ 3 e 5 vezes (130 ± 6,8 x 10 6 e 218 ± 23,6 x 10 6 células, respectivamente) o número de BHK-21 (baby hamster kidney), as células foram cultivadas e se recuperou de Multi-Flask comparado a T-175 frascos (43,2 ± 3,5 x 10 6 células; Fig.2A). Rendimento celular por unit área de superfície era equivalente em 3 - e 5-Multi-camada de frascos e T-175 frascos para BHK-21, LNCaP (humanas da próstata linhagem celular de adenocarcinoma), Hep-G2 (linha celular humana hepatocarcinoma), Ecopack 2-293 (humanos linhagem de células renais) cultivadas por um período de 48-96h (Fig.2B) em meio de crescimento (35 ml por camada), como recomendado pelo fornecedor de células (ATCC, Sigma e / ou Clontech). As células foram enumeradas em um contador de Vi-CELL automatizado (1).
Figura 2A: três e cinco vezes o número de células BHK-21 foram cultivadas e se recuperou de 3 - e 5-layer Multi-Frascos em relação ao T-175 frascos. Rendimento esperado foi determinado utilizando rendimento celular média do controle T-175 frascos multiplicado por três e cinco vezes para a 3 - e 5-layer Multi-Frascos, respectivamente (n = 4 frascos / formato).
Figura 2B: rendimento das células por cm 2 foi equivalente em 3 - e 5-Multi-camada de frascos e T-175 frascos para BHK-21, LNCaP, HepG2 e EcoPack2-293 células. Cada barra representa média de 4-6 frascos. Células BHK-21 (11.000 cells/cm2) foram cultivadas por 72 horas, as células LNCaP (20.000 cells/cm2) e EcoPack2-293 células (~ 35.000 cells/cm2) foram cultivadas por 96 horas e HepG2 células (25.000 células / cm 2 ) foram cultivadas por 48 horas antes da colheita.
3. Distribuição de mídia entre camadas de Multi-Flask
Meio de cultura de células (DMEM; Invitrogen) foi adicionado em 5 camadas Multi-Frascos (250 mL/5-layer navio) e dividida em camadas de acordo com protocolo descrito acima. Distribuição de mídia foi medido por furos em cada camada e mídia bombeado para fora de camadas individuais. Peso de líquido recuperado de cada camada foi encontrado para ser relativamente uniforme de camada a camada, como mostrado na Figura 3. Eles são os seguintes: 510,8 ± 0,73, 50,3 ± 0,58, 50,21 ± 0,13, 49,88 ± 0,35, 49,45 ± 0,37 (gm).
Figura 3. Uniform distribuição de mídia em cada uma das cinco camadas de uma camada de 5-Multi-Flask. Meio de cultura celular foi adicionado em Multi-Frascos (250 navio ml/5-layer), equilibrada e dividida em camadas individuais. A mídia foi bombeado para fora através de buracos perfurados em camadas individuais e peso líquido foi gravado a partir de cada camada (n = 6 frascos).
4. Distribuição celular entre as camadas de Multi-Flask
As células podem ser adicionados e misturados dentro da Multi-Flask. Nós distribuição simulada de células entre as camadas de Multi-Flask usando pérolas (10μm; PolySciences Inc.), semelhante em tamanho às células. Suspensão de esferas foi adicionado em Multi-Flask navio utilizando uma pipeta de 10 mL através da camada superior e misturado com a mídia no vaso como described no protocolo acima. Distribuição de talão foi medido por furos em cada camada e fluido contendo suspensão de esferas foi bombeado para fora de camadas individuais. Concentração talão recuperado de cada camada foi lido em um contador Coulter e registrados. Mostrado a seguir são equivalentes inter-layer distribuições talão em 3 camadas Multi-Frascos (Fig.4A). A mistura de porta-permite a distribuição homogênea de células e reagentes entre Flask Multi-camadas.
Figura 4A: distribuição do grânulo em cada uma das três camadas de uma camada de 3-Multi-Flask. Uma suspensão de grânulos (3,6 x10 6 / ml) foi adicionado ao meio dispensada em Multi-Frascos (suspensão de esferas: volume de mídia é 1:10, vol: vol) e mistos, seguido pelo equilíbrio e as etapas de partição utilizando o protocolo descrito. Concentração talão recuperado de cada camada (meio bombeado através de furos em cada camada) foi lido em uma contagem Coulterer e registrados. Mostrado a seguir são equivalentes inter-layer distribuições talão em 3 - Multi-layer Frascos (n = 5 frascos)
Mostrados abaixo são imagens representativas de Ecopack 2-293 padrões de coloração de células cultivadas em> confluência de 80% em 3 camadas de Multi-Frascos em meios de crescimento suplementado. Monocamadas de células foram fixadas e coradas com cristal violeta e Multi-camadas Flask foram então cortadas e imagens digitalizadas (2). Nota padronização celular, foi homogênea em todas as camadas da Flask-Multi (Fig.4B). Resultados semelhantes foram obtidos com vários tipos de células avaliados (dados não mostrados).
Figura 4B: Esta figura ilustra o crescimento de células homogêneas entre as camadas de Multi-Frascos. Ecopack-2-293 células cultivadas a> confluência de 80% em 3-Multi-camada de frascos e T-175 foram fixados e corados com violeta de cristal. Multi-Flask vasos foram cortados e cada camada manchada foi digitalizada.
5 Air oferta em Flask-Multi.:
Análise de media gasto com BioProfile FLEX analisador (3,4) (Nova Biomedical) de EcoPack2-293 células cultivadas por 96 horas não revelou nenhuma diferença na saturação do ar de células cultivadas em 5 camadas Multi-Frascos vs T-175 frascos (81,03 ± 1,9 vs 83,4 ± 5,8% ambiente O 2).
Figura 5: Air saturação (% ambiente O 2) dos meios de comunicação passaram foram semelhantes em pré-mixed media de 5 camadas Multi-Frascos vs T-175 frascos. EcoPack2-293 células foram semeadas a uma densidade de 35.000 células / cm 2 e cultivadas por 96 horas antes da análise de media (n = 3 frascos).
Discussion
O presente estudo demonstra o aumento da produtividade que a concepção Flask Multi-oferece aos pesquisadores. Embora seja importante seguir as etapas descritas anteriormente para desempenho otimizado ao usar Multi-Frascos, há poucos passos críticos neste protocolo que são considerados mais essenciais. Estes incluem: (i) mistura de células e reagentes usando a porta mix dentro do vaso (ii) o transporte de Multi-Flask em um ângulo de 45 ° no sentido horário após particionamento líquido para cada uma das camadas (iii) que Flask-Multi pós plano de particionamento para o incubadora.
Uso adequado de Multi-Flask leva à produção de uma população de células homogêneas dentro de cada navio que é cultivada em um ambiente que é congruente a T-175 frascos (5). Estas embarcações fornecer células 3 e 5 vezes mais em um espaço semelhante ao do frasco T-175. O navio 3 e 5 camadas fornece 525 e 875 centímetros 2 de área de crescimento, respectivamente, e oferecem espaço e trabalho savings para os usuários. Tratamento de superfície de tecido Cultura é comparável ao padrão frascos permitindo scale-up, sem a necessidade de re-otimização das condições de cultura existente ou comprometer a homogeneidade, qualidade ou desempenho de células (6, 7). Isto também prevê a comparabilidade com os dados coletados anteriormente. Esses vasos podem ser também revestido com reagentes tais como colágeno, fibronectina, poli-D-lisina para fornecer um substrato para o crescimento especializados apego e diferenciação de certos tipos de células, tais como hepatócitos 8, 9 kertainocytes, células-tronco cultivadas em soro de mídia livre formulações. Soluções de revestimento pode ser removido com a retenção de líquido residual mínima, de modo a reduzir o desperdício de reagentes valiosos, bem como a remoção eficaz de solução de revestimento antes de a cultura de células. O recomendado volume de mídia ideal para células de cultura em frascos multi-faixa ,142-0,287 ml / cm 2, que se traduzem em 25-50 ml por camada. Ao contrário de um outro frasco de múltiplas camadas, tseu produto oferece uma combinação porta-in que permite que a embarcação rápida no vaso de mistura, bem como distribuição uniforme de células e reagentes dentro e entre as camadas de cada navio. Linhagens de células diversas, culturas primárias e células-tronco foram ampliados de forma eficiente usando Multi-Frascos. Estes navios são particularmente vantajoso em aplicações que exigem um grande número de células, como no alto throughput screening, a produção de vacinas, transfections vetor viral e terapia celular.
Economia de tempo, espaço, trabalho e geração de resíduos são reduzidos ganhos chave do Flask multi-versus culturas convencionais em vasos de camada única. Podemos cultura cerca de três vezes o número de células colhidas de 5, T-175 frascos no mesmo espaço, com 3, 5 camadas Multi-Frascos. Esta vantagem na economia de espaço não se limita apenas a T-175, mas também pode ser estendido para outros navios: um aparelho de garrafa padrão rolo que se encaixa em incubadoras de casas comuns de laboratório rol ~ 4garrafas de Ler (2200 ml) cada um dos quais fornece 850 centímetros 2 de superfície. Na mesma área, ~ 20, 5 camadas Multi-Frascos podem ser alojados proporcionando assim cinco vezes a superfície de crescimento para células de cultura. Além disso, com um aumento do "Go-Green" consciência, opções para reduzir a geração de resíduos é altamente desejável. A esse respeito, há um 38% (5, T-175 frascos pesam ~ 640g enquanto que uma, Flask Multi-5 camadas pesa ~ 400g) diminuição da geração de resíduos utilizando Multi-Frascos em relação ao T-175 frascos e levar essas vantagens a diminuir em armazenamento dos resíduos e custos de eliminação e resultar em economia de custos para o usuário.
Disclosures
Todos os autores são funcionários da Becton Dickinson, Segmento de Biociências, Discovery Unidade Labware.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-layer Tissue Culture-treated 525cm2 | BD Biosciences | 353143 | |
| 5-layer Tissue Culture-treated 875cm2 | BD Biosciences | 353144 | |
| 100ml pipette | BD Biosciences | 357600 | |
| 10 ml pipette | BD Biosciences | 357551 | |
| 5 ml aspirating pipette | BD Biosciences | 357501 | |
| 50 ml Polypropylene conical tube | BD Biosciences | 352070 | |
| T-175 flask Tissue Culture-treated | BD Biosciences | 353028 | |
| Gram Crystal Violet | BD Biosciences | 212525 | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| GMEM | Sigma-Aldrich | G5154 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| MEM | ATCC | 30-2003 | |
| Trypsin-EDTA | Lonza Inc. | CC-5012 | |
| Fetal Bovine serum | Invitrogen | 16000-044 | |
| Tryptose Phosphate Broth | Sigma-Aldrich | T8159 | |
| BHK-21 cells | Sigma-Aldrich | 85011433 | |
| Hep-G2, LnCAP | ATCC | ||
| Ecopack 2-293 | Clontech Laboratories | ||
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Polystyrene Bead | Polysciences, Inc. | 24628-20 | |
| Bio-Profile Flex Analyzer | Nova BioMedical |
References
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