Summary
식물의 휘발성 물질을 수집을위한 푸시풀 방식이 설명되어 있습니다. 방법은 herbivore 먹이, 외인성 메틸 jasmonate, 기계적 손상에 의해 유발되는 휘발성 물질의 비교를 허용합니다. 이 기술은 또한 블루베리 식물 이내 herbivore - 손상된 지점에서 휘발성 물질에 노출 피해가 가지의 휘발성 반응을 조사하는 데 사용됩니다.
Abstract
Herbivore 유도된 식물의 휘발성 물질 (HIPVs)은 일반적으로 herbivore 공격 1,2 후 식물에서 방출됩니다. 이러한 HIPVs은 주로 방어 식물 호르몬 jasmonic 산 (JA) 및 휘발성 메틸 유도체 jasmonate (MeJA) 3,4,5에 의해 규제됩니다. 지난 3 수십 연구자 이상 HIPVs이 격퇴하거나 유치 herbivores를 herbivores의 천적을 확보하고 경우에 그들은 이전 herbivore의 공격을 유발하거나 주요 공장 방어 수 수 문서화합니다. 최근 논문 6, 나는 다르게이라도, 블루베리 식물의 휘발성 물질의 배출을 유도 집시 나방의 유충, 외인성 MeJA 응용 프로그램, 그리고 기계적 손상에 의해 그 먹이를 발표했다. 또한, 블루베리 가지는 JA와 herbivores (즉, 직접 식물의 방어)에 저항의 수준을 증가하여 동일한 식물의 인접 지점에서 방출 HIPVs에 대응하고, 프라이밍 휘발성 배출하여 (즉, 간접 식물 방어). 찾을 유사ings는 쑥의 일종 7, 포플러 8, 리마 콩 9 최근에보고되었습니다 ..
자, 내가 herbivore (집시 나방) 먹이주기, 외인성 MeJA 응용 프로그램, 그리고 기계적 손상에 의해 유도된 블루베리 휘발성 물질을 수집을위한 푸시풀 방법을 설명합니다. 휘발성 수집 유닛은 4 L 휘발성 수집 챔버, 2 피스 단두대, 유입 공기를 정화 공기 공급 시스템 및 휘발성 물질 5,6,10를 수집하는 슈퍼 - Q 흡착제로 가득 함정에 연결된 진공 시스템으로 구성되어 있습니다 . 슈퍼 - Q 트랩에서 수집한 휘발성 물질은 dichloromethane과 eluted 후 분리 및 가스 크로마 토그래피 (GC)를 사용 계량입니다. 이 휘발성 징수 방법은 블루베리 식물 내에 herbivore - 손상된 지점에서 휘발성 물질에 노출 피해가 가지의 휘발성 반응을 조사하는 데 사용되는 N 제 연구 6되었습니다. 이러한 방법은 여기에 설명되어 있습니다. 간단히, 손상 블루베리 가지는 아프로 HIPVs에 노출되는같은 공장 내에서 m 근처 지점. 위에서 설명한 동일한 기술을 사용하여 HIPVs에 노출 후 지점에서 방출되는 휘발성 물질을 수집 분석하고 있습니다.
Protocol
1. 휘발성 물질의 유도 지역 : herbivore 손상
- 블루베리 식물의 두 가지가 잡아 늘인 폴리에스터 슬리브로 체포됩니다.
- 여섯 집시 나방의 유충은 (2 차 -3 층 instars) 가방 안에 사전 휘발성 컬렉션에 2 일간 식물에 피드를 사용할 수 있습니다. 제어 식물은 어떤 유충을받지 않습니다.
- 휘발성 배출량은 3 일 (그림 1)에서 (프로토콜 # 7) 아래에 설명된대로 수집하고 있습니다. 폴리에스터 슬리브 탈출에서 곤충을 방지하기 위해 식물에 남아 있습니다.
2. 휘발성 물질의 유도 지역 : 기계적 손상
- 식물 기계적 손상이 집시 나방에 의해 제거 잎 영역의 금액을 모방하기 위해 구멍을 펀칭 자국으로합니다.
- 공장마다 다섯 잎은 일 1과 2의 끝에 기지와 나뭇잎의 상단 부분에 위치한이 7 mm 구멍이 부상하고 있습니다. 제어 치료 기계적 손상을받지 않습니다.
3. 휘발성 물질의 유도 지역 : MeJA
- 블루베리 식물은 0.1 % 십대 초반 - 20 솔루션 MeJA 중 하나가 1 또는 1.5 MM 솔루션의 10 ML로 취급됩니다.
- MeJA는 2 온스 스프레이 병을 사용하여 적용됩니다. 제어 식물은 0.1 % 십대 초반 - 20 용액 10 ML과 함께 분무 있습니다.
- 식물은 16시 시간에 처리하고, 17 cm 직경 휘발성 컬렉션하기 전에 35 cm 높은 플렉시 챔버 내부에 15 시간을위한 온실에 보관됩니다.
- 아래에 설명된대로 휘발성 배출을 수집하고 있습니다.
4. 휘발성 물질의 체계적 유도 : 내부 신호
- 블루베리 식물의 낮은 지점은 스펀 폴리 에스테르 슬리브와 함께 체포와 가방 내부 육 (2 차 -3 층 instars) 집시 나방의 유충을 배치하여 손상되었습니다.
- 손상된 지점은 휘발성 수집 챔버 밖에서 남아있는 동안 branche손상된 지점 위의들 (그림 2) 챔버 내부에 배치됩니다.
- 쐐기 벌레는 2 일 동안 바닥 지점에 먹이를 사용할 수 있습니다.
- 일 3 시작, 휘발성 물질이 손상된 식물의 손상 부분에서 수집하고 있습니다.
- 휘발성 물질 7 연속 일 동안 수집하고 있습니다. 제어 식물은 유사한 방식으로 취급되지만 herbivore 손상을받지 못했습니다.
5. 혈관 연결
- 이 연구는 블루베리 공장 내의 서로 다른 지점 사이에 혈관 연결의 정도를 결정.
- 공장에서 낮은 지점의 최종 부분으로 Orians 외에 설명된 Rhodamine - B (시그마 - 올드 리치) 염색 (0.25 % W / V), 6 ML 솔루션을 포함하는 꽃의 물 선택을 지원하기 위해 절단됩니다. 11
- 식물을 통해 염료의 운동은 7 일 동안 매일 모니터링합니다.
- 7 일 후, 붉은 얼룩의 크기는 시각 식물의 다른 위치에서 평가됩니다.
6. HIPVs에 노출 : 외부 신호
- 공장 내에서 가지는 두 인접한 지점에서 HIPVs에 노출 또는 HIPVs에 전혀 노출을받지 않습니다.
- HIPVs에 지점을 노출 한 낮은 지점은 폴리 에스테르 슬리브 여섯 (2 차 -3 층 instars) 집시 나방의 유충이 봉지 (그림 3) 내부 배치와 함께 체포됩니다.
- 공장은 위에서 설명한 것과 유사한 플렉시 챔버 내부에 갇힌입니다. 곤충은 인접 가지는 유도 방출 지점에서 휘발성 물질에 노출되는 등, 2 일간 식물에 피드를 사용할 수 있습니다.
- 노출 후 (3 일), 노출된 지점은 곤충 부상에 지점 밖으로 (그림 2에서 볼 수)두고, 휘발성 수집 챔버 내부에 배치됩니다.
- HIPV 노출 가지의 휘발성 물질은 아래에 설명된대로 수집하고 있으며, 낮은 지점에서 소비 잎 영역의 크기는 귀공자 이미지 Softwa를 사용하여 측정다시.
7. HIPVs으로 노출 : 마중물
- 공장 HIPV 노출 후 "준비하는"여부를 확인하려면, 식물은 프로토콜 # 5에서와 같이 취급됩니다.
- 식물 중 절반은 유도 인접 지점에서 HIPVs에 노출되며, 나머지 절반은 손상되지 않은 지점에 노출되는 동안.
- 3 일, 맨투맨으로 초기 2 기 - instar의 집시 나방의 유충은 각 공장에 배치하고 아래에 설명된대로 휘발성 물질은 (그림 4) 수집하고 있습니다.
- 휘발성 컬렉션 후, 처음, 집시 나방의 유충뿐만 아니라 3 일에 손상되는 사람에 의해 손상된 잎을 excised 있으며, 잎 지역 소비의 금액이 측정됩니다.
8. 휘발성 물질의 수집
- HIPV 배출은 푸시풀 시스템을 사용하여 온실에서 샘플입니다. herbivore 손상 치료에 유충을 포함하여 화분에 심은 식물의 위 지상 부분 (줄기, 가지, 그리고 단풍이), 4 L vola 내부에 배치됩니다타일 수집 챔버. 2 조각의 단두대는 식물의 기반을 지원합니다. 정화 공기 2 L / 분 속도로 각 챔버의 상단에 들어갑니다.
- 휘발성 물질은 Alltech 슈퍼 - Q 1 L / 분 속도로 실에서 공기를 당겨 흡착제의 30 MG 가득 트랩으로 수집하고 있습니다.
- 휘발성 수집 장치는 네 가지 식물 (그림 1)에서 휘발성 물질의 동시 모음에 대한 허용, 넷 챔버로 구성되어 있습니다.
- 컬렉션은 오전 9 시부터 17시 H.으로 낮에는 실시
- 수집 후, 식물의 모든 잎은 수확되며, C ° 60 건조 오븐, 그리고 무게, 그리고 여왕님 수돗물과 70 % 에탄올로 씻어서 있습니다.
9. 휘발성 물질의 분석
- 슈퍼 - Q 트랩에서 수집한 휘발성 물질은 dichloromethane (150 μl) 400 N - 옥탄의 NG 내부 표준과 함께 추가됩니다 eluted 있습니다.
- 화합물의 분리 및 부량은 휴렛 팩커드 6890 시리즈 이루어집니다불꽃 이온화 검출기 (FID) 및 장착된 기체 크로마토 그래프 (GC) (그림 5), 애질런트 HP - 1 컬럼 (10 MX 0.53 mm X 2.65 μm의) 및 캐리어 가스로 사람을 사용 (일정한 흐름 = 5 ML / 분 , 속도 = 39cm / 초). 온도 프로그램이 40에서 시작 ° C 14에서 증가, 1 분 유지 ° 180 C / 분 ° C (2 분) 후, 40 ° 200 C / 분 ° C와 200 ° C에서 보관 2 분 .
- 화합물의 임시 신분증은 캐리어 가스로 Supelco MDN - 5 열 (30 MX 0.32 mm X 0.25 μm의)을 갖춘 Finnigan 매트 8,230 질량 분석기 (MS)에 결합 Varian 3400 GC,과 그가 함께 수행됩니다. MS는 250에서 전자 이온화 (조회) 및 총 이온 크로마토 그램 (TIC) 모드에서 운영 ° C (소스 온도). 이 프로그램은 35 ° C (1 분), ° C / 분, 170 ° C, 15 ° 그리고 280 C / 분 ° C. 4 증가에서 시작
- 화합물은 미정 NIST 라이브러리와 B의 기능과 스펙트럼 데이터의 비교에 의해 식별됩니다Y GC 보존 지수와 상용 화합물의 그 자신의 유지 시간을 비교하여.
10. 대표 결과 :
스물 둘 휘발성 물질은 블루베리 잎 (그림 6)에서 식별되었습니다. 그림 7은 손상되지 않은 블루베리 잎의 대표 크로마토 그래프를 보여줍 집시 나방에 의해 먹이에 의해 손상을 떠납니다. 집시 나방의 유충에 의해 기계적 손상과 수유 컨트롤 (그림 8)에 비해 블루베리 나뭇잎에서 로컬 휘발성 물질의 배출량을 증가시켰습니다. 애벌레의 먹이에 비해 MeJA 처리는 집시 나방 (그림 9)에 의해 유도된 17 화합물 밖으로 11 유도. 칠일 초기 먹이 손상 (즉, 내부 신호 부족) (그림 10) 이후 집시 나방 - 손상 식물의 잎 손상에서 휘발성 물질의 체계 유도의 증거는, 그러나,이 없었다. 또한, 일주일 뒤에, 매우 움직임을 느리게빨간 염료의 ment는 블루베리 식물의 지점 (그림 11) 사이에서 관찰되었다. 높은 혈관 연결은 단일 지점 사이 잎 사이가 발생했습니다. 그러나, 두 수직 촬영 이내에 정렬된 지점, 그리고 촬영의 반대편에서 두 가지 사이의 낮은 연결 사이 중급 - 투 - 낮은 연결이있었습니다.
HIPVs (그림 12)에 노출되지 않은 비교 HIPVs에 노출 지점에서 방출되는 휘발성 물질의 양의 차이가 없었다. 그러나, HIPVs은 블루베리의 외부 방어 신호로 작동. 나뭇잎을 먹이 집시 나방의 유충은 이전 unexposed 제어 단풍 (그림 13)에서 그 공급했던 것보다 71% 적은 잎 자료를 소비 HIPVs에 노출. 또한, HIPV 노출 지점에서 소비 잎 영역의 금액 당 방출 휘발성 물질의 금액 표시, unexposed 가지 (그림 14)에 비해 4 배 높은 것을 HIPV - 예에서 출발 포즈를 가지는 herbivory (즉, 그들이 준비하는 줄)에 더 반응했다.
그림 1. 푸시풀 시스템은 블루베리 식물의 휘발성 물질을 수집하는 데 사용됩니다. 식물은 유리 챔버 내부에 배치하고 깨끗한 공기는 그들을 통해 전달됩니다. 흡착제 자료를 포함하는 필터는 공장에서 배출 트랩 휘발성 물질 각 챔버의 측면에 붙어 있 었지. 진공은 필터를 통해 챔버 내부의 공기를 끌어하는 데 사용됩니다.
그림 2. 블루베리 식물의 체계적 휘발성 반응을 연구하기 위해, 낮은 블루베리 가지는 중 집시 나방의 유충 (오른쪽 챔버) 또는 왼쪽 손상 (왼쪽 챔버)에 의해 손상되었다. 이일 (3 일)를 후, 손상 및 손상되지 않은 식물에서 피해가 상위 지점에서 휘발성 물질이 수집되었다.
그림 3. 손상되지 않은 지점에서 낙엽이 손상된 지점에서 HIPVs에 응답할 수 있는지 여부를 테스트하려면, 난 블루베리 식물의 각 지점 중 하나를 체포. 나는 그 식물의 절반의 가방 내부 집시 나방의 유충을 배치. 내 안에서 가방의 외부로 휘발성 물질의 움직임을 허용 사용되는 가방. 식물은 HIPVs에 손상 지점을 폭로 플렉시 챔버 내부에 배치했다. 휘발성 물질은 다음 노출 지점에서 수집되었다.
그림 4. 손상되지 않은 지점에서 나뭇잎이 HIPVs에 노출 후 "준비하는"수 있는지 여부를 테스트하려면 실험은 그림 3에 설명되어 있지만 집시 나방의 유충은 각 휘발성 수집 챔버 내부 HIPV 노출과 unexposed 지점에 위치 것처럼 반복했다.
G "고도는 ="그림 5 "/>
그림 5. 휘발성 컬렉션 후, 샘플 블루베리 식물에서 방출되는 휘발성 물질을 확인하고 수치로 기체 크로마토 그래프 (GC)에 주입하고 있습니다.
그림 6. 적어도 22 화합물은 블루베리 잎에서 방출됩니다.
그림 7. 손상 블루베리에서 일반 chromatographs은 나뭇잎과 집시 나방의 유충에 의해 피해를 떠납니다. 휘발성 물질은 손상되지 않은 블루베리 잎에서 매우 낮은 금액에 방출하고 있습니다. 하지만, 단풍이 집시 나방의 유충에 의해 손상된 경우, 휘발성 물질의 배출이 급격히 증가했습니다.
그림 8. 그래프 손상 나뭇잎, M에서 방출되는 휘발성 물질 22 각각의 금액을 보여줍니다나뭇잎 echanically - 손상, 그리고 집시 나방의 유충에 의해 피해를 떠납니다. 쐐기 벌레에 의해 제거 잎 영역의 금액을 모방하는 인공 손상 블루베리 잎에서 휘발성 배출을 증가했지만 반응은 집시 나방의 먹이로 나뭇잎의 휘발성 응답과는 다른되었습니다.
그림 9. JA 경로는 블루베리 잎에서 휘발성 방출을 조절 여부를 테스트했습니다. 식물은 MeJA 다양한 양의와 함께 분무되었습니다. 나는 exogenously - 적용 MeJA의 증가 농도는 블루베리 잎에서 휘발성 물질의 배출을 증가 것으로 나타났습니다.
그림 10. 그래프 컨트롤 블루베리 지점에서와 집시 나방 손상 식물 (전신 반응)에서 손상되지 않은 지점에서 방출되는 휘발성 물질의 총 금액을 보여줍니다. 휘발성 물질이 위해 수집되었습니다7 연속 일 할거야. 나는 식물의 낮은 지점에 초기 손상 후에도 휘발성 물질 칠일에 대한 체계적 유도를 찾을 수 없습니다.
그림 11. 난 블루베리 식물 내에 지점 간의 연결 혈관에 노출된 정도를 확인 rhodamine - B (적색 염료)를 사용합니다. 그 약 발견했습니다. 80%, 20 %, 5 %와 염료를 포함하는 지점에서 나뭇잎 0 %, 직접 염료, 염료를 포함하는 지점에 걸쳐 지점, 그리고 블루베리 공장 내에서 다른 촬영에 위치한 지점을 포함하는 지점 위에 가지는 각각 있었다 완벽하게 색소로 얼룩진.
그림 12. 그래프 HIPVs와 unexposed 지점에 노출 지점에서 방출되는 휘발성 물질의 양을 보여줍니다. 나는 HIPVs에 노출이 울다에서 휘발성 배출에 영향을 미치지 않았 발견손상 블루베리 가지를 재미.
그림 13. 그래프 HIPVs와 unexposed 지점에 노출 블루베리 지점에서 집시 나방의 유충에 의해 먹이의 양을 보여줍니다. HIPV 노출 가지의 유충은 unexposed 지점에 그에 비해 단풍 적은 금액을 소비.
그림 14. 전 소비 영역 당 방출 속도를 계산, 나는 HIPV 노출 지점이 증가 휘발성 응답 블루베리 가지의 나뭇잎을 준비하는 HIPVs 해당 노출을 나타내는 unexposed 가지와 비교 휘발성 물질의 방출 속도를 증가했다는 사실을 발견했습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
푸시풀 휘발성 수집 장치는 식물 휘발성 물질의 헤드 스페이스 콜렉션을위한 표준 방법을 나타냅니다 여기서 설명했다. 이 장치는 집시 나방의 유충에 의해 herbivory에 블루베리 나뭇잎의 휘발성 응답을 결정하는 데 사용하며 나를 내부 식물 신호에 HIPVs의 역할에 대한 새로운 증거를 제공하기 위해 허용했다.
결과는 애벌레의 먹이 exogenously - 적용 MeJA를 보여 여기에 제시하고, 기계 지을만한 상처가 다르게 불구하고, 손상의 사이트에서 휘발성 방출을 증가했다. 이러한 결과는 JA의 통로가 블루베리에 HIPVs의 유도에 중요한 역할을 나타냅니다.
HIPV 노출은 휘발성 배출을 유발하지 않았다. 그러나, HIPV 노출 가지는 집시 나방의 먹이로 증가 휘발성 응답을 준비하는있었습니다. herbivores의 부재에서 휘발성 배출의 증가 HIPVs에 응답하는 것은 생태 부과될뿐만 아니라 생리 왜냐하면 수TS, HIPVs는 herbivores '천적에게 신뢰할 수 정보를 제공할 수 있습니다 때문입니다. 식물 HIPVs에 노출 후 증가 휘발성 응답 자신을 수상하는 대신,보다 적응 전략은 수 있습니다. HIPV 노출 나뭇잎에서 휘발성 배출이 증가 속도는 우선적으로 herbivores의 자연 원수를 유치하거나 블루베리의 집시 나방에 의해 유도된 여러 휘발성 물질이 유충 12 구충제 영향을 미칠 수 있기 때문에 직접적인 방어 역할을 될거다하여 간접적인 방어 역할을 할 수도 있습니다.
요약, 나의 결과는 손상된 블루베리 지점에서 나뭇잎이 곤충 먹이의 손상과 인접한 지점의 수신 단풍의 주요 휘발성 배출을 최소화하는 휘발성 물질을 통해 정보를 전송하는 것을 보여줍니다. 다른 사람과 함께 이러한 결과는 HIPVs는 내부 식물 신호의 역할을 더욱 HIPVs의 다기능 역할을 보여주는 것을 강력한 증거를 제공합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
나는 공개 아무것도 없어
Acknowledgments
저자는 기술 지원 로버트 Holdcraft 감사드립니다. 이 연구는 USDA CSREES 특별 권한 부여 (2009-34155-19957) 및 해치 자금 (NJ08192)에 의해 부분적으로 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Volatile collection chambers | Analytical Research Systems, Inc. | VCC-G6X12DT-1P | Gainesville, FL |
| Air compressor, 20 gal, oil free, 2 hp | Westward | 3JR71 | Sold by Grainger, Inc. |
| Air delivery system | Analytical Research Systems, Inc. | VCS-ADS-4AFM4C | Gainesville, FL |
| Air collection system | Analytical Research Systems, Inc. | VCS-MVCS-4CX1P | Gainesville, FL |
| Vacuum pump 100-150V, ¼ hp | Gast Manufacturing, Inc. | 4F740 | Sold by Grainger, Inc. |
| Methyl jasmonate | Sigma-Aldrich | J2500 | St. Louis, MO |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 | St. Louis, MO |
| Rhodamine-B | Sigma-Aldrich | St. Louis, MO | |
| Plastic spray bottles, 2 oz | Setco Inc. | Cranbury, NJ | |
| Spun polyester sleeves | Rockingham Opportunities Corp. | Reidsville, NC | |
| Super-Q volatile collection traps | Analytical Research Systems, Inc. | VCT-1/4X3-SPQ | Gainesville, FL |
| Scion Image Software | Scion Corporation | Frederick, MD | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | St. Louis, MO |
| Gas chromatograph HP 6890 | Hewlett-Packard | ||
| Gas chromatograph Varian 3400 | Varian Inc., Agilent | ||
| n-octane | Sigma-Aldrich | 296988 | St. Louis, MO |
| Mass spectrometer MAT 8230 | Finnigan | San Jose, CA | |
| HP-1 GC column | Agilent Technologies | Palo Alto, CA |
|
| MDN-5S GC column | Supelco, Sigma-Aldrich | Bellefonte, PA |
References
- Dicke, M., Van Loon, J. J. A. Multitrophic effects of herbivore-induced plant volatiles in an evolutionary context. Entomol. Exp. Appl. 97, 237-237 (2000).
- Mumm, R., Dicke, M. Variation in natural plant products and the attraction of bodyguards involved in indirect plant defense. Can. J. Zool. 88, 628-628 (2010).
- Hopke, J. Herbivore-induced volatiles: the emission of acyclic homoterpenes from leaves of Phaseolus lunatus and Zea mays can be triggered by a β-glucosidase and jasmonic acid. FEBS Lett. 352, 146-146 (1994).
- Rodriguez-Saona, C. Behavioral and electrophysiological responses of the emerald ash borer, Agrilus planipennis, to induced volatiles of Manchurian ash, Fraxinus mandshurica. Chemoecology. 16, 75-75 (2006).
- Rodriguez-Saona, C. Herbivore induced volatiles in the perennial shrub, Vaccinium corymbosum, and their role in inter-branch signaling. J. Chem. Ecol. 35, 163-163 (2009).
- Karban, R. Damage-induced resistance in sagebrush: volatiles are key to intra- and interplant communication. Ecology. 87, 922-922 (2006).
- Frost, C. J. Within-plant signalling by volatiles overcomes vascular constraints on systemic signalling and primes responses against herbivores. Ecol. Lett. 10, 490-490 (2007).
- Heil, M., Bueno Silva, J. C. Within-plant signaling by volatiles leads to induction and priming of an indirect plant defense in nature. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5467-5467 (2007).
- Turlings, T. C. Exploitation of herbivore-induced plant odors by host-seeking parasitic wasps. Science. 250, 1251-1251 (1990).
- Makovic, I. Volatiles involved in the nonhost rejection of Fraxinus pennsylvanica by Lymantria dispar larvae. J. Agric. Food Chem. 44, 929-929 (1996).
