Summary
Un push-pull metodo per la raccolta di volatili impianto è descritto. Il metodo permette un confronto tra volatili indotte da alimentazione erbivoro, jasmonate metil esogena, e danni meccanici. Questa tecnica viene utilizzata anche per studiare la risposta volatili di rami danneggiati all'esposizione a sostanze volatili dai rami erbivoro-danneggiato all'interno di impianti di mirtillo.
Abstract
Erbivori indotta volatili impianto (HIPVs) sono comunemente emessi dalle piante dopo 1,2 erbivoro attacco. Queste HIPVs sono principalmente gestiti dalla difensiva acido jasmonic ormone vegetale (JA) e la sua jasmonate volatili metil derivato (Meja) 3,4,5. Nel corso degli ultimi 3 decenni, i ricercatori hanno documentato che HIPVs può attrarre o respingere gli erbivori, attraggono i nemici naturali degli erbivori, e in alcuni casi possono indurre o difese delle piante prima del primo attacco erbivoro. In un recente articolo 6, mi ha riferito che l'alimentazione da bruchi Lymantria, esogeni applicazione Meja, e danni meccanici indurre le emissioni di sostanze volatili dalle piante di mirtilli, anche se in modo diverso. Inoltre, le filiali mirtillo rispondere alle HIPVs emessi dai rami vicini della stessa pianta, aumentando i livelli di JA e resistenza erbivori (cioè, le difese impianto diretto) e dalle emissioni di adescamento volatili (ad esempio, le difese impianto indiretta). Trovare similiIngs sono stati segnalati recentemente per sagebrush 7, pioppo 8 e fagioli 9 ..
Ecco, ho descritto un push-pull metodo per la raccolta di volatili mirtillo indotte da erbivori (Lymantria dispar), l'alimentazione, l'applicazione esogena Meja, e danni meccanici. L'unità di rilevazione volatili è costituito da una camera di 4 Raccolta L volatili, a 2 pezzi ghigliottina, un sistema di erogazione dell'aria che purifica l'aria in entrata, e un sistema di vuoto collegato ad una trappola piena di Super-Q adsorbente per raccogliere volatili 5,6,10 . Volatili raccolti in Super-Q trappole vengono eluiti con diclorometano e poi separati e quantificati tramite gas cromatografia (GC). Questo metodo di raccolta dei volatili è stato utilizzato n 6 il mio studio per indagare la risposta volatili di rami danneggiati all'esposizione a sostanze volatili dai rami erbivoro-danneggiato all'interno di impianti di mirtillo. Questi metodi sono descritti qui. In breve, non danneggiata rami mirtillo sono esposti a HIPVs indietrom rami vicini all'interno della stessa pianta. Utilizzando le stesse tecniche sopra descritte, volatili emessi dalle filiali dopo l'esposizione a HIPVs sono raccolti e analizzati.
Protocol
1. Induzione locale di sostanze volatili: danni erbivoro
- Due rami di piante di mirtilli sono insaccato con un manicotto in poliestere filato.
- Sei bruchi Lymantria (2 ° -3 ° stadi) sono collocati all'interno dei palloni e ha permesso di nutrirsi di piante per 2 giorni prima della raccolta volatili. Piante di controllo non ricevono alcun bruchi.
- Emissioni volatili sono raccolti come descritto di seguito (protocollo # 7) il giorno 3 (Figura 1). Maniche in poliestere rimangono sulle piante per evitare che gli insetti di fuggire.
2. Induzione locale di sostanze volatili: danni meccanici
- Danni meccanici alle piante viene inflitto dalla punzonatura fori per imitare la quantità di superficie fogliare rimosso da Lymantria.
- Cinque foglie per pianta sono feriti con due fori da 7 mm situati alla base e parte superiore delle foglie, alla fine dei giorni 1 e 2. Il trattamento di controllo non riceve danni meccanici.
3. Induzione locale di sostanze volatili: Meja
- Piante di mirtilli sono trattati con 10 ml di una soluzione di 1 o 1,5 mM di Meja in un 0,1% di Tween-20 soluzione.
- Meja è applicato con un 2-oz flacone spray. Impianti di controllo vengono spruzzati con 10 ml di una soluzione di Tween-20 0,1%.
- Le piante sono trattate alle 16:00 ore, e conservate nella serra per 15 ore all'interno di un 17-cm di diametro e 35 cm di camera alta plexiglas prima collezioni di volatili.
- Emissioni volatili sono raccolti come descritto di seguito.
4. Induzione sistemica di sostanze volatili: segnalazione interna
- Un ramo basso di un impianto di mirtillo è insaccato con un manicotto in poliestere filato e danneggiato mettendo sei (2 ° -3 ° stadi) bruchi Lymantria all'interno del sacchetto.
- Il ramo danni rimane al di fuori della camera di raccolta volatili, mentre le branches sopra il ramo danni sono posti all'interno della camera (Figura 2).
- Bruchi sono autorizzati a nutrire sul ramo basso per 2 giorni.
- A partire dal giorno 3, volatili sono raccolti presso la parte danneggiata del piante danneggiate.
- Volatili sono raccolti per 7 giorni consecutivi. Piante di controllo sono trattate in modo simile ma non ho ricevuto danni erbivoro.
5. Vascolare connettività
- Questo studio ha determinato il grado di connettività tra i diversi rami vascolari all'interno di un impianto di mirtillo.
- La parte finale di un ramo basso da una pianta viene tagliata per supportare un pick floreali acqua contenente 6 mL di soluzione di rodamina-B (Sigma-Aldrich), colorante (0,25% w / v), come descritto nella Orians et al 11.
- Movimento del colorante attraverso l'impianto è monitorato giorno per 7 giorni.
- Dopo 7 giorni, la quantità di colorazione rossa è visivamente valutato da posizioni diverse della pianta.
6. L'esposizione a HIPVs: segnalazione esterna
- Rami all'interno di un impianto sono o esposti a HIPVs da un ramo adiacente o ricevuto alcuna esposizione al HIPVs.
- Per esporre rami HIPVs, un ramo inferiore è insaccato con un manicotto in poliestere e sei (2 ° -3 ° stadi) bruchi Lymantria sono collocati all'interno di sacchi (Figura 3).
- L'impianto è ingabbiato all'interno di una camera in plexiglas simili a quelli descritti sopra. Gli insetti possono nutrirsi di piante per 2 giorni, in modo tale che i rami adiacenti sono esposti a sostanze volatili emesse dal ramo indotto.
- Dopo l'esposizione (giorno 3), rami esposti sono posti all'interno della camera di raccolta volatili, lasciando l'insetto-feriti al di fuori sede (come si vede in Figura 2).
- Volatili da HIPV esposti rami sono raccolti come descritto di seguito, e la quantità di superficie fogliare consumato dal ramo inferiore sono misurati con Scion Immagine Software.
7. L'esposizione a HIPVs: adescamento
- Per determinare se le piante sono "innescato" HIPV dopo l'esposizione, le piante vengono trattate come nel protocollo n. 5.
- La metà delle piante sono esposte a HIPVs da un ramo indotto adiacente, mentre l'altra metà è esposta a rami danni.
- Il giorno 3, quattro primi 2 °-instar bruchi Lymantria sono poste su ogni pianta e volatili vengono raccolti come descritto di seguito (Figura 4).
- Dopo le collezioni volatili, lascia inizialmente danneggiato da bruchi Lymantria, così come quelli che sono danneggiati al giorno 3, sono asportati e le quantità di consumo superficie fogliare vengono misurate.
8. Raccolta dei volatili
- Emissioni HIPV sono campionati in serra utilizzando un sistema push-pull. La parte fuori terra di piante in vaso (fusto, rami e foglie), tra cui bruchi nel trattamento danni erbivoro, sono collocati all'interno di una L 4 volacollezione di piastrelle da camera. A 2 pezzi ghigliottina supporta la base delle piante. Purificato l'aria entra nella parte superiore di ogni camera ad un tasso di 2 L / min.
- Volatili sono raccolti in trappole riempite con 30 mg di Alltech Super-Q adsorbente tirando aria dalle camere ad un tasso di 1 L / min.
- L'apparato collezione volatili si compone di quattro camere, che consente per le collezioni simultanea di volatili provenienti da quattro diverse piante (Figura 1).
- Le collezioni sono condotti durante il giorno 9:00-17:00 h.
- Dopo la raccolta, tutte le foglie dalle piante vengono raccolti, essiccati in forno a 60 ° C, e pesato, e le camere sono risciacquati con acqua di rubinetto e 70% di etanolo.
9. Analisi delle sostanze volatili
- I volatili raccolti da Super-Q trappole vengono eluiti con diclorometano (150 mL) e 400 ng di n-ottano è aggiunto come standard interno.
- Separazione e quantificazione dei composti è fatto su una Hewlett Packard 6890 SeriesGascromatografo (GC) (Figura 5), dotato di un rilevatore a ionizzazione di fiamma (FID) e un Agilent HP-1 colonna (10 mx 0,53 mm x 2,65 micron), e con Lui come gas di trasporto (flusso costante = 5 ml / min , velocità = 39 cm / sec). Il programma di temperatura ha iniziato a 40 ° C mantenuta per 1 minuto, è aumentato a 14 ° C / min a 180 ° C (2 min), poi a 40 ° C / min a 200 ° C e mantenuto a 200 ° C per 2 minuti .
- Tentativo di identificazione dei composti è effettuata su un Varian 3400 GC accoppiato ad uno spettrometro di massa Finnigan MAT 8230 (MS), dotato di un MDN-5S colonna Supelco (30 mx 0,32 millimetri x 0,25 micron), e con Lui, come gas di trasporto. La MS è gestito in ionizzazione elettronica (EI) e totale cromatogramma ionico (TIC) in modalità a 250 ° C (temperatura di sorgente). Il programma è iniziato a 35 ° C (1 min), è aumentato a 4 ° C / min a 170 ° C, poi a 15 ° C / min a 280 ° C.
- Composti sono provvisoriamente individuate tramite il confronto dei dati spettrali con quelli del NIST biblioteca e by indice di ritenzione di GC, e confrontando i loro tempi di ritenzione con quelli dei composti in commercio.
10. Rappresentante dei risultati:
Ventidue volatili sono stati identificati dalle foglie di mirtillo (Figura 6). La figura 7 mostra un cromatografo rappresentante di foglie di mirtillo integro e foglie danneggiate da alimentazione da Lymantria. Danni meccanici e di alimentazione da bruchi Lymantria aumento delle emissioni di sostanze volatili a livello locale dalle foglie di mirtillo rispetto ai controlli (Figura 8). Rispetto all'alimentazione bruco, il trattamento Meja indotto 11 dei 17 composti indotti da Lymantria (Figura 9). C'era, tuttavia, nessuna evidenza di induzione sistemica di sostanze volatili dalle foglie integre di Gypsy Moth-danneggiato gli impianti sette giorni dopo i danni alimentazione iniziale (ossia, la mancanza di segnalazione interna) (Figura 10). Inoltre, dopo una settimana, molto lento movimentomento del colorante rosso è stata osservata tra i rami delle piante di mirtilli (Figura 11). Vi è un'elevata connettività vascolari tra le foglie all'interno di una succursale unica. Tuttavia, c'era intermedio-basso connettività tra due rami allineati verticalmente all'interno di un tiro, e la connettività a basso tra due rami sui lati opposti di un germoglio.
Non c'era alcuna differenza tra quantità di sostanze volatili emesse dai rami esposti a HIPVs rispetto a quelli non esposti a HIPVs (Figura 12). Tuttavia, HIPVs agiscono come segnali esterni difensivi a mirtilli. Lymantria bruchi nutriti con le foglie precedentemente esposti a HIPVs consumato materiale fogliare 71% in meno rispetto a quelli nutriti con foglie di controllo non esposti (Figura 13). Inoltre, gli importi dei volatili emessi per quantità di superficie fogliare consumata in HIPV esposti rami sono stati 4 volte superiore rispetto ai non esposti rami (Figura 14), indicando che parte da HIPV-ex rami poste erano più sensibili alle erbivori (ad esempio, erano mano di fondo).
Figura 1. Un sistema push-pull è utilizzato per raccogliere volatili dalle piante di mirtilli. Le piante sono collocati all'interno di camere di vetro e l'aria pulita è passato su di loro. Un filtro che contiene un materiale assorbente era attaccata al lato di ogni camera per intrappolare volatili emessi dalle piante. Il vuoto è utilizzato per estrarre l'aria dall'interno della camera attraverso il filtro.
Figura 2. Per studiare la risposta sistemica volatili dalle piante di mirtilli, mirtillo rami più bassi sono stati entrambi danneggiati dai bruchi Lymantria (a destra della camera) o di sinistra danneggiato (a sinistra della camera). Dopo 2 giorni (il giorno 3), volatili da indenne rami più alti da piante danneggiate e non danneggiate sono stati raccolti.
Figura 3. Per verificare se le foglie dai rami danneggiati rispondere alle HIPVs dai rami danneggiati, ho insaccato una delle sedi in ciascuna delle piante di mirtilli. Ho poi messo bruchi Lymantria all'interno dei sacchetti di metà delle piante. Le borse che ho usato permettono il movimento di volatili da dentro a fuori di borse. Impianti sono stati collocati all'interno di camere di plexiglass per esporre i rami danneggiati a HIPVs. Volatili sono stati poi raccolti dai rami esposti.
Figura 4. Per verificare se le foglie dai rami danneggiati sono "innescato" dopo l'esposizione a HIPVs, gli esperimenti sono stati ripetuti, come descritto nella figura 3, ma bruchi Lymantria sono stati immessi sul HIPV rami esposti e non esposti all'interno di ogni camera di raccolta volatili.
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Figura 5. Dopo collezioni volatili, i campioni vengono iniettati in un gascromatografo (GC) per identificare e quantificare i composti volatili emessi dalle piante di mirtilli.
Figura 6. Almeno 22 i composti emessi dalle foglie di mirtillo.
Figura 7. Cromatografi tipici di mirtillo integro foglie e foglie danneggiate dai bruchi Lymantria. Volatili sono emessi in quantità molto basse da non danneggiato foglie di mirtillo. Tuttavia, quando le foglie sono danneggiate da bruchi Lymantria, emissione di sostanze volatili aumentato drammaticamente.
Figura 8. Il grafico mostra la quantità di ciascuna di 22 sostanze volatili emesse dalle foglie integre, mechanically-danneggiato foglie e foglie danneggiate dai bruchi Lymantria. Danni artificiale per simulare la quantità di superficie fogliare rimosso da bruchi aumento di emissioni volatili dalle foglie di mirtillo, ma la risposta è stata diversa da quella risposta volatili di foglie di alimentazione Gypsy Moth.
Figura 9. Testata se il percorso JA regola le emissioni volatili in foglie di mirtillo. Le piante sono state irrorate con diverse quantità di Meja. Ho trovato che le concentrazioni crescenti di esogenamente Meja-applicato un aumento delle emissioni di sostanze volatili dalle foglie di mirtillo.
Figura 10. Il grafico mostra la quantità totale delle sostanze volatili emesse dai rami mirtillo controllo e dai rami danneggiati da piante Lymantria danneggiato (risposta sistemica). Volatili sono stati raccolti per un aTal di 7 giorni consecutivi. Ho trovato nessuna induzione sistemica di sostanze volatili, anche 7 giorni dopo danno iniziale per abbassare i rami delle piante.
Figura 11. Ho usato rodamina-B (colorante rosso) per determinare il grado di connettività tra i rami vascolari in piante di mirtilli. Ho trovato che circa. 80%, 20%, 5% e 0% di foglie dai rami contenenti il colorante, rami direttamente sopra il ramo contenente il colorante, filiali in tutto il ramo contenente colorante, e filiali situate in una sparatoria diverse all'interno di un impianto di mirtillo, rispettivamente, sono stati completamente colorato con il colorante.
Figura 12. Il grafico mostra la quantità di sostanze volatili emesse dai rami esposti alle filiali HIPVs e non esposti. Ho trovato che l'esposizione a HIPVs non influiscono sulle emissioni volatili vicininoioso rami mirtillo intatto.
Figura 13. Il grafico mostra la quantità di alimentazione da bruchi Gypsy Moth sui rami mirtillo esposti alle filiali HIPVs e non esposti. Bruchi su HIPV esposti rami consumato meno quantità di fogliame rispetto a quelli sui rami non esposti.
Figura 14. Quando ho calcolato il tasso di emissioni per area consumato, ho scoperto che HIPV esposti rami aveva aumentato i tassi di emissione di sostanze volatili non esposti rispetto ai rami, indicando che l'esposizione a HIPVs innescato lascia in rami di mirtillo per un incremento della risposta volatile.
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Discussion
Il push-pull apparato collezione volatili qui descritto rappresenta un metodo standard per le collezioni dello spazio di testa dei volatili delle piante. Questo apparato è stato utilizzato per determinare la risposta volatili di foglie di mirtillo erbivori da bruchi Lymantria e mi ha permesso di fornire nuove prove per il ruolo di HIPVs in intra-impianto di segnalazione.
I risultati qui presentati mostrano che l'alimentazione bruco, esogeno applicato Meja, e ferendone meccanica aumento delle emissioni di volatili presso il sito di danni, anche se in modo diverso. Questi risultati indicano che il percorso JA gioca un ruolo chiave nella induzione di HIPVs di mirtilli.
HIPV esposizione non ha indotto le emissioni volatili. Rami Tuttavia, HIPV esposti erano pronti per un incremento della risposta volatili per l'alimentazione Gypsy Moth. Rispondendo alle HIPVs da un aumento delle emissioni di volatili, in assenza di erbivori potrebbe incorrere ecologico e cos fisiologicits, perché HIPVs potrebbe fornire informazioni affidabili per i nemici naturali degli erbivori '. Invece, una strategia più adattiva potrebbe essere per piante per primo se stessi per un incremento della risposta volatili dopo l'esposizione a HIPVs. Questo aumento del tasso di emissione di volatili da HIPV esposte le foglie possono servire come una difesa indiretta preferenzialmente attirando i nemici naturali degli erbivori o potrebbe servire un ruolo diretto di difesa in quanto volatili diversi indotti da Lymantria di mirtilli può avere effetti repellenti sulla bruchi 12.
In sintesi, i miei risultati mostrano che le foglie dai rami mirtillo danneggiate trasmettere informazioni tramite volatili che minimizzano i danni degli insetti e di alimentazione principale delle emissioni di volatili nelle foglie ricezione di rami adiacenti. Questi risultati combinati con quelli di altri forniscono una forte evidenza che HIPVs giocare un ruolo negli scambi impianti di segnalazione e di dimostrare ulteriormente le multi-funzionale dei ruoli HIPVs.
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Disclosures
Non ho nulla da rivelare
Acknowledgments
L'autore ringrazia Robert Holdcraft per assistenza tecnica. Questo studio è stato finanziato in parte da una CSREES USDA speciale Grant (2009-34155-19957) e fondi portello (NJ08192).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Volatile collection chambers | Analytical Research Systems, Inc. | VCC-G6X12DT-1P | Gainesville, FL |
| Air compressor, 20 gal, oil free, 2 hp | Westward | 3JR71 | Sold by Grainger, Inc. |
| Air delivery system | Analytical Research Systems, Inc. | VCS-ADS-4AFM4C | Gainesville, FL |
| Air collection system | Analytical Research Systems, Inc. | VCS-MVCS-4CX1P | Gainesville, FL |
| Vacuum pump 100-150V, ¼ hp | Gast Manufacturing, Inc. | 4F740 | Sold by Grainger, Inc. |
| Methyl jasmonate | Sigma-Aldrich | J2500 | St. Louis, MO |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 | St. Louis, MO |
| Rhodamine-B | Sigma-Aldrich | St. Louis, MO | |
| Plastic spray bottles, 2 oz | Setco Inc. | Cranbury, NJ | |
| Spun polyester sleeves | Rockingham Opportunities Corp. | Reidsville, NC | |
| Super-Q volatile collection traps | Analytical Research Systems, Inc. | VCT-1/4X3-SPQ | Gainesville, FL |
| Scion Image Software | Scion Corporation | Frederick, MD | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | St. Louis, MO |
| Gas chromatograph HP 6890 | Hewlett-Packard | ||
| Gas chromatograph Varian 3400 | Varian Inc., Agilent | ||
| n-octane | Sigma-Aldrich | 296988 | St. Louis, MO |
| Mass spectrometer MAT 8230 | Finnigan | San Jose, CA | |
| HP-1 GC column | Agilent Technologies | Palo Alto, CA |
|
| MDN-5S GC column | Supelco, Sigma-Aldrich | Bellefonte, PA |
References
- Dicke, M., Van Loon, J. J. A. Multitrophic effects of herbivore-induced plant volatiles in an evolutionary context. Entomol. Exp. Appl. 97, 237-237 (2000).
- Mumm, R., Dicke, M. Variation in natural plant products and the attraction of bodyguards involved in indirect plant defense. Can. J. Zool. 88, 628-628 (2010).
- Hopke, J. Herbivore-induced volatiles: the emission of acyclic homoterpenes from leaves of Phaseolus lunatus and Zea mays can be triggered by a β-glucosidase and jasmonic acid. FEBS Lett. 352, 146-146 (1994).
- Rodriguez-Saona, C. Behavioral and electrophysiological responses of the emerald ash borer, Agrilus planipennis, to induced volatiles of Manchurian ash, Fraxinus mandshurica. Chemoecology. 16, 75-75 (2006).
- Rodriguez-Saona, C. Herbivore induced volatiles in the perennial shrub, Vaccinium corymbosum, and their role in inter-branch signaling. J. Chem. Ecol. 35, 163-163 (2009).
- Karban, R. Damage-induced resistance in sagebrush: volatiles are key to intra- and interplant communication. Ecology. 87, 922-922 (2006).
- Frost, C. J. Within-plant signalling by volatiles overcomes vascular constraints on systemic signalling and primes responses against herbivores. Ecol. Lett. 10, 490-490 (2007).
- Heil, M., Bueno Silva, J. C. Within-plant signaling by volatiles leads to induction and priming of an indirect plant defense in nature. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5467-5467 (2007).
- Turlings, T. C. Exploitation of herbivore-induced plant odors by host-seeking parasitic wasps. Science. 250, 1251-1251 (1990).
- Makovic, I. Volatiles involved in the nonhost rejection of Fraxinus pennsylvanica by Lymantria dispar larvae. J. Agric. Food Chem. 44, 929-929 (1996).
