Summary
Colóides de ouro Alkanethiolate estabilizado conhecidos como clusters monocamada protegidas (PPM) são sintetizados, caracterizados, e montada em filmes finos como uma interface para a adsorção eletroquímica proteína monocamada de proteína redox simples, como
Abstract
Nanopartículas de ouro coloidal protegidos com ligantes alkanethiolate chamados clusters monocamada protegidos ouro (PPM) são sintetizados e, posteriormente, incorporados em conjuntos de cinema que servem como plataformas de adsorção de proteínas eletroquímica monocamada (PME). PME é utilizada como sistema modelo para estudar propriedades eletroquímicas de proteínas redox, confinando-os a uma plataforma de adsorção em um eletrodo modificado, que também serve como um parceiro redox para transferência de elétrons (ET) reações. Estudos têm demonstrado que as assembleias de nanopartículas de ouro filme desta natureza prever um ambiente mais homogêneo adsorção de proteínas e promover ET sem dependência distância em comparação com os sistemas mais tradicionais modificados com alkanethiol monocamadas auto-organizadas (SAM). 1-3 Neste artigo, PPM funcionalizados com ligantes hexanethiolate são sintetizados usando uma reação Brust modificado 4 e caracterizados com espectroscopia visível (UV-Vis) ultravioleta, microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e prótons (1 H) de ressonância magnética nuclear (RMN). MPC filmes são montados na SAM interfaces de eletrodo de ouro modificado usando um "mergulho ciclo" método de camadas alternadas MPC e ditiol moléculas de ligação. Crescimento de filmes em eletrodo de ouro é rastreada eletroquimicamente medindo mudanças para a camada dupla corrente de carga do sistema. Filmes análogos montados em lâminas de vidro modificado silano permitem a monitoração óptica de crescimento de filmes e análise transversal TEM fornece uma espessura estimada. Durante a montagem de filmes, manipulação de protecção ligante MPC, bem como o mecanismo de ligação interpartículas permitir a filmes em rede, que são facilmente adaptáveis, para fazer a interface com a proteína redox ter mecanismo de adsorção diferentes. Por exemplo, Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) pode ser adsorvida hidrofobicamente para ditiol-linked filmes de PPM hexanethiolate e citocromo c (cyt c) pode ser imobilizada eletrostaticamente em um ácido carboxílico modificado MPC camada interfacial. Neste relatório, vamos nos concentrar sobre o protocolo de filmes para o sistema AZ exclusivamente. Investigações envolvendo a adsorção de proteínas em plataformas MPC modificado sintéticos podem ajudar a entender as interações entre biomoléculas e materiais sintéticos, e, conseqüentemente, auxiliar no desenvolvimento de sistemas de biosensor, os sistemas de ET, modelagem e materiais sintéticos biocompatíveis. 5-8
Protocol
1. Monocamada Hexanethiolate Protected Síntese Clusters de Ouro
Hexanethiolate funcionalizados monocamada clusters de ouro protegidas (PPM) são sintetizados na sequência de um 1-hexanethiol 02:01 (C6) a razão molar de ouro para produzir uma estrutura média de Au 225 (C6) 75. 4-9 modificações específicas para a reação Brust, como tratamentos tipo de ligante específico, tiol-to-ouro proporções, temperatura e taxa de entrega de reação, ou pós-síntese, 9-11 pode render uma grande variedade de PPM com tamanhos variados e núcleo funcional grupos de proteção, respectivamente. aproximada 4 O MPC ( média) composições de PPM funcionalizados com diversos grupos alkanethiol pode ser determinada por prótons (1 H) a análise de ressonância magnética nuclear (RMN) de iodo-decomposto amostras.
- Dissolver 1,1 g de brometo de tetraoctylammonium (TOABr) em 30 mL de tolueno com ventilação apropriada capa fume.
- Dissolver 0,38 g borohidreto de sódio (NaBH 4) em ~ 20 mL de água de 18 mohms ultrapurificada (UP H 2 O) e deixe esfriar sobre gelo por pelo menos 30 min.
- Dissolver 0,31 g de hidrogênio tetrachloroaurate (HAuCl 4) em ~ 20 mL de H 2 O UP e transferir quantitativamente a mistura de solução para a solução TOABr-tolueno usando um adicional de ~ 5 mL de H 2 O UP, a fim de transferir a fase aquosa ouro solução para a solução não aquoso. Mexa rigorosamente enquanto tampados levemente por 30 min para que o laranja queimado aquosa e clara fases não aquoso está misturando bem.
- Transferência de ambos os aquosa clara e laranja queimado fases não aquoso para um funil de separação. Descartar a camada (inferior) aquosa e decantar a camada (de cima) não aquoso para um balão limpo.
- Adicionar C6 em uma proporção de 2:1 com HAuCl 4 a solução não aquoso. Agitar por 30 min para formar uma Au (I) de polímeros, como detectado por uma mudança de cor de laranja avermelhado para uma solução clara, amarelo quase incolor.
- Transfira a mistura de reação a um banho de gelo isolado e frio de 0 ° C por pelo menos 30 min com agitação.
- Quantitativamente e rapidamente adicionar o NaBH 4 refrigerados solução para a mistura de reação, a fim de reduzir Au (I) a um dourado metálico na presença de tióis, instantaneamente formando uma solução de PPM preto grosso em cima disso. Mexa reação durante a noite a 0 ° C.
- Transfira a mistura de reação a um funil de separação, descarte a camada (inferior) aquosa para um copo de resíduos, e rotativos evaporar a camada (de cima) não aquoso tolueno à secura quase completo deixando uma lama preta pesada no frasco.
- Precipitar o PPM, acrescentando acetonitrila e permitindo a sentar-se durante a noite.
- Coletar PPM por filtração a vácuo utilizando uma frita de vidro de média porosidade com acessórios de borracha e do lado da armada frasco com aspirador e lave com uma quantidade abundante de acetonitrila.
- Permitir PPM para o ar seco, pesar produtos, caracterizam-se por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e análise de RMN, e armazenar tampado para uso futuro. Obter imagens TEM a gota-casting PPM dissolvido em tolueno para formvar / filme de carbono suporte em malha de cobre (400 mesh) e operar o aparelho TEM a 80-100 kV. O tamanho do núcleo média pode ser estimada utilizando software de análise de imagem, tais como Imagem J (freeware).
2. Vídeo de montagem: ditiol-linked Assembléia Film MPC para Eletroquímica monocamada Protein
O substrato é o primeiro ouro eletroquimicamente limpos e modificados com um SAM C6 antes de imergir na alternando soluções de ditiol moléculas de ligação e PPM C6 modificado para tornar-se um "ciclo de queda", que é repetida várias vezes para finalmente formar uma ditiol-linked montagem cinematográfica MPC . Conforme descrito em estudos prévios, o plasmídeo 2 original para o aeruginosa Pseudomonas azurin proteína (AZ) foi dado graciosamente pelo Dr. Corey Wilson, da Universidade Rice e AZ foi fornecido como um pó purificado e liofilizado pela Universidade de Richmond professor, Dr. Jonathan Dattelbaum, que foi posteriormente reidratados com 4,4 mM tampão fosfato de potássio (KPB, pH = 7.0, μ = mM 10) para criar uma solução M 10/05 conforme verificado pela análise visível (UV-Vis) ultravioleta.
- Monte o sanduíche célula eletroquímica (echem) na seguinte ordem de baixo para cima: placa retentora primeiro Lucite, substrato de ouro como eletrodo de trabalho, entre em contato bronze elétrica para eletrodo de ouro de trabalho, primeira junta de borracha, Viton o-ring que define a área do eletrodo (0,32 cm 2), vidro corpo celular, junta de borracha segundo, e placa retentora segundo Lucite. Toda a célula é mantida unida por barras roscadas e apertados cuidadosamente porcas. A célula é equipado com um eletrodo de referência adquirida comercialmente, que abriga um barril de vidro com 1 M KCl saturado, Ag / AgCl fio de referência e um fio de Pt eletrodo auxiliar.
- Eletroquimicamente ª limpae substrato de ouro através da realização de voltametria cíclica (CV) nas janelas potencial 0,2-0,9 V, 0,2-1,2 V, e 0,2-1,35 V (versus Ag / AgCl, KCl) a 100 mV / s em uma solução de 0,1 MH 2 SO 4 e KCl 0,01 M.
- Medir a corrente de carga do substrato de ouro limpo nuas realizando CV em "condições normais", incluindo uma janela de potencial de 0,1-0,4 V (versus Ag / AgCl, KCl) digitalizada a 100 mV / s em KPB KPB Descartar. 1 e enxágüe sucessivamente com UP H 2 O, etanol (EtOH), UP H 2 O e EtOH.
- Expor o substrato limpo de ouro para ~ 300 mL de solução 5 mM em EtOH C6 e deixe descansar durante a noite para formar um ordenado C6 SAM. Eliminar a solução C6 a partir da célula e lave sucessivamente, com EtOH, UP H 2 O, EtOH, e UP H 2 O.
- Medir a corrente de carga do SAM em condições normais. Descartar KPB e enxaguar, sucessivamente, com UP H 2 O, EtOH, UP H 2 O e EtOH. A corrente de carga deve ser marcadamente diminuído de que a medição de ouro nua (passo 2.3) 1.
- Expor o SAM substrato de ouro modificado para ~ 300 mL de 5 mM de 1,9-nonanedithiol solução (NDT) em EtOH e deixe descansar por 1 hora para interdisperse NDT ligando moléculas dentro do SAM C6. Eliminar a solução NDT e lave sucessivamente e cuidadosamente com EtOH, UP H 2 O, EtOH, UP H 2 O, e cloreto de metileno (CH 2 Cl 2).
- Expor o substrato de ouro para uma solução de MPC CH 2 Cl 2 (~ 1 mg / mL) com agitação por lentamente borbulhando com gás N 2 para 1 hr. Se necessário, substitua evaporou solução MPC com mais CH 2 Cl 2. Esta é a ancoragem da camada MPC da montagem cinematográfica. Eliminar a solução MPC e novamente lavar sucessivamente com CH 2 Cl 2, H 2 O UP, e KPB.
- Medir a corrente de carga da camada de MPC em condições normais. Descartar KPB e enxaguar, sucessivamente, com UP H 2 O e CH 2 Cl 2.
- Expor o substrato de ouro para ~ 300 mL de solução 5 mM de NDT CH 2 Cl 2, com agitação por lentamente borbulhando com gás N 2 para 20 min.
- Descartar NDT e enxaguar abundantemente com CH 2 Cl 2. Repita os passos 2.7 e 2.8 para depositar a camada MPC segundo da montagem cinematográfica.
- Para depositar camadas adicionais MPC, as medidas 2.9 e 2.10 são repetidas. Com cada camada adicional MPC um aumento correspondente na corrente de carga é observado.
- Após o filme em rede MPC está completa, lavar o substrato modificado com filme KPB. Proteína AZ é adsorvido na montagem de filmes MPC injetando ~ 150 mL de solução de M ~ 5-10 AZ de KPB na célula sanduíche echem e permitindo a sentar-se cobertas e refrigeradas por pelo menos 1 hr.
- Remover a célula echem do frigorífico e deixe-o voltar à temperatura ambiente próximo. Enxaguar com KPB, recarga de celular com echem KPB, e KPB bolha com gás N 2 para 10 min.
- Estudos de proteínas monocamada eletroquímica são executadas como CV na janela de potencial de -0,25 V a 0,25 V (versus Ag / AgCl, KCl) digitalizada a 100 mV / s em KPB.
3. Vídeo de montagem: ditiol-linked Assembléia Film MPC para rastreamento óptico
Antes de crescimento filmes MPC para avaliação óptica, secções lâmina de vidro são pré-lavadas com solução de Piranha (CUIDADO! 02:01 concentrada H 2 SO 4 e H 2 O 2) e tratados com (3-mercaptopropyl)-trimetoxissilano (3-MPTMS ). 1-2 filmes MPC são, então, montado sobre estes slides de vidro modificado usando o "dip ciclo" técnica como já descrito acima.
- Enxágüe a 3-MPTMS lâmina de vidro modificado com CH 2 Cl 2 e colocá-lo em uma solução de MPC CH 2 Cl 2 (~ 1 mg / mL) para 1 hr enquanto agitando em agitador em baixa velocidade. Isso completa a camada de MPC da primeira Assembleia filme de ancoragem PPM ao endgroups mercaptanos do silano. Enxaguar abundantemente com o slide CH 2 Cl 2, e seque com gás N 2. Tome um espectro UV-Vis (400-1000 nm) do slide, e lave novamente com CH 2 Cl 2.
- Coloque o slide em uma solução de NDT 5 mM de CH 2 Cl 2 para 1 hora, enquanto agitação em um agitador em baixa velocidade. Lavar a lâmina com CH 2 Cl 2.
- Coloque o slide em uma solução de MPC durante 1 hr, enquanto agitação em um agitador em baixa velocidade. Isso completa a camada MPC segundo da montagem cinematográfica. Enxaguar abundantemente com o slide CH 2 Cl 2, seque com gás N 2, e ter um espectro UV-Vis (400-1000 nm) do slide. A absorbância em todo o espectro deve ser crescente como camadas adicionais MPC são adsorvidos à montagem do filme.
- Para depositar camadas adicionais MPC, steps 3,2-3,3 são repetidas.
4. Caracterização da monocamada Protected Assembléias Ouro Film Cluster por Microscopia Eletrônica de Transmissão Seccional Cruz
TEM seções transversais são preparados por reincorporação rosto en filmes incorporado. 2, 12 Isto é feito pela primeira anexar um filme MPC montado sobre uma lâmina de vidro de 3 MPTMS modificado em um microscópio, limpa padrão slides usando resina epóxi Embed 812 para permitir a melhor comportamento durante o procedimento abaixo. Tenha cuidado com o calor aplicado como temperaturas mais elevadas vão decompor o PPM dentro do filme.
- Mix Embed 812 resina epóxi e deixe engrossar por pelo menos 12 hr.
- Preencher um "00" cápsula beem com resina epóxi e inverter em cima da amostra filme MPC (preparado na seção 3). Colocar pressão sobre a cápsula, para que uma bolha sobe ao topo da cápsula, criando uma vedação entre a resina epóxi e amostra de filme MPC. Permitem polimerizar por pelo menos 18 horas a 60 ° C e depois esfriar os slides montado em temperatura ambiente.
- Calor montado slides por 20 seg em uma placa de alumínio fundido quente a 200 ° C, a fim de facilitar a remoção do bloco com cara de filme anexado MPC en.
- Cortar a amostra contendo o filme fora do bloco de cápsula Beem usando viu um joalheiro.
- Re-incorporar a parte removida em um molde de silicone plana com o lado filme MPC-se de frente para o interior do silício também. Preencha o silício bem com resina epóxi à temperatura ambiente e deixar polimerizar por pelo menos 18 horas a 60 ° C. Arrefecer a amostra à temperatura ambiente.
- Obtenção de cortes finos amostra de 60-80 nm em um ultramicrótomo Leica UCT usando uma faca de diamante para cortar seções perpendiculares ao fio da navalha.
- Coloque fatias seções sobre formvar / filme de carbono suporte em malha de cobre (400 mesh) e tirar imagens de TEM preparadas seções transversais das assembléias filme MPC.
5. Resultados representativos:
Figura 1 camada dupla cobrança de monitoramento atual do MPC crescimento de filmes para um total de 5 ciclos de imersão (alternando a exposição ao MPC e soluções NDT). Corrente de carga aumentou sistematicamente com cada ciclo de imersão, acrescentando que "camadas" de MPC ao filme (Fig. 2). Os voltamogramas cíclicos foram obtidos utilizando uma janela de potencial de 0,1-0,4 V (versus Ag / AgCl, KCl) digitalizada a 100 mV / s em 4,4 mM tampão fosfato de potássio (pH = 7,0 μ, MM = 10). Reproduzido com permissão do ML Vargo, Gulka CP, Gerig JK, Manieri CM, Dattelbaum JD, Marks CB, Lawrence NT, Trawick ML, e Leopold MC, Langmuir 26 (1), 560-569. Copyright 2010 American Chemical Society.
Figura 2 (a) Representação esquemática da proteína AZ adsorvido para uma assembléia filme ditiol-linked MPC. (B) voltamograma cíclico típico para AZ adsorvido por MPC filme de montagem coletados por meio de uma janela de potencial de -0,25 a 0,25 V (versus Ag / AgCl, KCl) digitalizada a 100 mV / s em 4,4 mM tampão fosfato de potássio (pH = 7.0, μ = 10 mM).
Figura 3 Representante monitoramento UV-Vis do espectro de um crescimento de filmes ditiol-linked MPC numa lâmina de vidro de 3 MPTMS modificado. Um ciclo de mergulho consiste em uma exposição da lâmina de vidro para NDT solução linker seguiu uma exposição à solução de MPC. Cada subseqüentes resultados mergulho no crescimento da espessura do filme e um aumento de absorbância simultâneas. Como o número de ciclos de mergulho aumenta, a superfície de banda plasmon é gradualmente definida em ~ 520 nm. Reproduzido com permissão do ML Vargo, Gulka CP, Gerig JK, Manieri CM, Dattelbaum JD, Marks CB, Lawrence NT, Trawick ML, e Leopold MC, Langmuir 26 (1), 560-569. Copyright 2010 American Chemical Society.
Figura 4 microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de análise de imagem seccional cruzada de um conjunto de filmes ditiol-linked MPC. Detalhe: TEM imagem típica de hexanethiolate PPM funcionalizados utilizados na montagem do filme. Análise TEM determinada uma média de diâmetro do núcleo de ouro do PPM ser ~ 2 nm usando análise J imagem. Reproduzido com permissão do ML Vargo, Gulka CP, Gerig JK, Manieri CM, Dattelbaum JD, Marks CB, Lawrence NT, Trawick ML, e Leopold MC, Langmuir 26 (1), 560-569. Copyright 2010 American Chemical Society.
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Discussion
Eletroquímica monocamada de proteína é uma técnica eficaz usada para estudar as interações entre proteínas redox e sintéticos plataformas de adsorção. A eficácia desta estratégia, no entanto, depende da capacidade de adsorção engenheiro de uma interface com um alto grau de controle de nível molecular. As plataformas baseadas em MPC criado por este protocolo representam plataformas especificamente projetados que são capazes de proporcionar um ambiente mais homogêneo de proteína adsorção 3 e facilitar o ET a uma distância maior em comparação com dois sistemas de PME tradicionais empregando SAMs alkanethiolate. A resistência do conjunto filme MPC como uma interface eletroquímica é a sua versatilidade e adaptabilidade a outras proteínas redox de diferentes tamanhos e superfície química / função, vários nanomateriais diferentes, e configurações de eletrodos alternativos também. Por exemplo, o procedimento descrito é facilmente adaptada para estudos ET de citocromo c (cyt c) usando simples lugar de troca de reações na camada mais externa da PPM incorporado ao conjunto. 11 Como cyt c é catiônico e é capaz de ligar substratos eletrostaticamente, ácido carboxílico tióis terminada alkanethiols podem ser trocados por lugar-os ligantes periféricos de PPM, incluindo a interface eletrodo modificado para facilitar uma imobilização eletrostática driven da proteína, com a análise eletroquímica subseqüente sendo idêntico ao descrito aqui. 1 Para ajustar o tamanho do PPM para acomodar tamanhos diferentes de proteínas, os ajustes para a síntese Brust, como alterar tiol-to-ouro proporções, a reação de temperatura / taxa de entrega, o rendimento de uma grande variedade de diâmetros MPC que irá coincidir com o diâmetro aproximado de uma proteína alvo . 9-10
O procedimento geral, os ciclos repetitivos principalmente da exposição a partículas e moléculas de ligação (layer-by-layer) tem sido utilizado com sucesso para criar filmes finos incorporando uma variedade de diferentes nanomateriais. Por exemplo, as nanopartículas aquosa (PN) com diferentes revestimentos de proteção e propriedades ópticas únicas foram em rede em filmes que estão ligados exclusivamente com interações eletrostáticas entre NPs e pontes polieletrólito 13. Estratégia O mesmo também foi aplicado para a construção do filme altamente sensível opticamente assembléias com nano shell ou NPs oco.
Enquanto o procedimento descrito aqui utiliza células personalizado projetado eletroquímica e substratos de ouro, é facilmente adaptável para eletrodos mais genérico, configurações eletroquímica, eletroanalítica e técnicas. Além de todos os filmes descritos ser capaz de ser construída sobre eletrodos de ouro evaporado e lâminas de vidro, os filmes também têm sido facilmente montado em eletrodos de ouro comum de disco que estão prontamente disponíveis a partir Instruments CH ou Sistemas Bioanalytical (BAS). Apesar de voltametria cíclica continua a ser a técnica eletroquímica primária em PME, temos recentemente com sucesso analisados monocamada de proteína ET com uma variedade de outras técnicas eletroquímicas, incluindo passo, pulso, e impedância de técnicas baseadas. 14
Pesquisa e desenvolvimento de interfaces baseadas em nanomateriais para a adsorção de proteínas estão em andamento, mas as assembléias filme MPC descritos neste relatório representam uma estratégia eficaz e melhorado para estudos de PME. O procedimento é relativamente simples e pode ser realizada por estudantes e cientistas de todos os níveis, criando filmes altamente versátil que pode ser facilmente adaptada às metas proteína específica, se necessário.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos a National Science Foundation (CHE-0847145), eo Henry Dreyfus Professor Scholar-Programa de Prêmios para generosamente apoio a esta pesquisa. Gostaríamos de reconhecer especificamente Christine Davis, Diretor de Microscopia e Imagem do Departamento de Biologia da Universidade de Richmond por sua assistência com transversal de imagem. Um agradecimento especial é dada aos drs. T. Leopold, Case Kanters R., D. Kellogg, R. Miller, e W., bem como, Russ Collins, Phil Joseph, Carolyn Marks, Mandy Mallory e John Wimbush - todos eles fazem iniciação científica possível na Universidade de Richmond. Um pessoal muito obrigado é dado a todos os atuais, passados e futuros pesquisadores de graduação no Laboratório de Pesquisa Leopold.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tetraoctylammonium bromide | Sigma-Aldrich | 294136 | |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 213462 | |
| Hydrogen tetrachloroaurate | Sigma-Aldrich | 254169-5G | |
| 1-Hexanethiol | Sigma-Aldrich | 234192 | |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | 1010 | |
| Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer | Bruker Corporation | 300 MHz | |
| Formvar/carbon support film on copper grid (400 mesh) | Electron Microscopy Sciences | FCF400-Cu | |
| Gold substrate | Evaporated Metal Films Corp. | Custom | |
| Ag/AgCl Reference electrode | Microelectrodes, Inc. | MI-401F | |
| Potentiostats | CH Instruments, Inc. | CHI650A, CHI610B | |
| 1,9-Nonanedithiol | Sigma-Aldrich | N29805 | |
| (3-mercaptopropyl)-trimethoxysilane | Sigma-Aldrich | 175617 | |
| Ultraviolet Visible Spectrophotometer | Agilent Technologies | 8453 | |
| Embed 812 epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
| "00" BEEM capsule | Electron Microscopy Sciences | 70000-B | |
| Silicon flat mold | Electron Microscopy Sciences | 70900 | |
| Diamond knife | Diatome | 21-ULE, S12801 |
References
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