Summary
같은 마우스 내에서 시간에 따른 면역 반응의 진행을 수행하려면, 임파선이 순차적으로 수술로 제거할 수 있습니다. 여기서는이 기술을 수행할 수있는 방법에 대해 설명합니다.
Abstract
백신, 감염이나 종양에 대한 면역 반응의 진행을 이해하는 면역학 분야에서, 반응은 종종 시간이 지남에 따라합니다. 마찬가지로 림프구 항상성의 연구는 시간 과정 실험이 필요합니다. 같은 마우스 내에서 이러한 연구를 수행하는 것은 실험적 다양성뿐만 아니라 사용하는 마우스의 개수를 줄이기 위해 이상적입니다. 혈액 금단 시간 과정 실험의 성능을 가능하지만, 그것은 단지 lymphocytes 순환에 대한 정보를 제공하고 세포 1-4 제한된 수의를 제공합니다. 몸 전체 순환과 림프 노드에 거주하는 lymphocytes 서로 다른 성질을 가지고 있기 때문에 두 위치를 검토하는 것이 중요합니다. 수술에 의한 림프절의 연속적인 제거는 면역 반응이나 시간의 경과에 같은 마우스의 면역 세포 확장을 수행하는 독특한 기회를 제공합니다. 또한이 기술은 PE에 대한 충분한입니다 림프절 당 1-2x10 6 셀 사이에 듭니다phenotypic 특성화 및 / 또는 기능 assays를 rform. 순차 림프절 수술이나 lymphadenectomy이 성공적으로 우리와 다른 5-11에 의해 사용되었습니다. 여기서는 상완과 사타구니 임파선이 anesthetised 마우스의 피부에 작은 절개를함으로써 제거할 수 방법에 대해 설명합니다. 수술은 외면하고 신속하게 이루어지기 때문에, 마우스가 매우 빠르게 복구 잘 치유하고 과도한 통증을 경험하지 않습니다. 매초마다 하루 시간 과정 실험 허용 하나 또는 두 개의 림프절을 적출하는 것이 가능합니다. 이 기술은 시간이 지남에 임파선의 특성 노드 거주 lymphocytes를 공부하기 때문에 적합합니다. 이 방법은 여러 가지 실험 설계에 적합하며 우리는 많은 실험실은 순차 림프절의 수술을 혜택을 누릴 것이라고 믿습니다.
Protocol
1. 수술 전 준비
마우스는 동물 복지 지침에 캐나다 문화원에 따라 취급되었다.
- 케타민을 / xylazine (300분의 150 밀리그램 / kg, IP)의 주입에 의해 또는 isoflurane의 흡입 (2 %, 1L 산소)에 의한 마취시키다 생쥐. 가능한 경우는 마취 시간과 깊이 나은 제어를 허용로 isoflurane를 사용해야합니다. 또한 산소는 동물의 생리 기능을 지원하는 동시에 관리합니다. 또한, isoflurane 직접 폐에 의해 제거되며 따라서 간장이나 신장 대사가 필요하지 않습니다.
- 또는 다른 진통제 - buprenorphine를 (0.1 밀리그램 / kg, SC 0.05) 주사.
- (isoflurane을 사용하는 경우) 안구 건조를 피하기 위해 수술 전에 마우스 눈을에 연고를 바릅니다.
- 마우스가 앞발을 곤란하고 꼬리를 압연하여 자고 있는지 확인합니다. 마우스가 반응하지 않는 경우 수술로 진행합니다.
2. 외과
- 그 측면에 마우스를 올려.
- 당신 incisio을 수행합니다 지역을 집중하다N, 당신이 적출하고 싶습니다 후면에 따라. (그림 1).
- 해당 지역에, chlorhexidine, 또는 다른 방역을 적용합니다.
- 날카로운 가위 (5mm 정도) foreleg의 뒷면이나 복부 근처의 뒷다리 다쳤구나 (그림 1) 이상 중 하나와 작은 절개를합니다.
- 당신 포셉으로 차단 느슨한 머리카락을 제거합니다. 원하는 경우에는 절개를하기 전에 마우스를 면도 있습니다. 그러나 절차를 길게하고 우리가 여기와 같이, 그것은 모두 매우 드물게 치유하거나 감소하는 감염을 개선하지 않기 때문에 그것이 필요하지 않을 것을 발견했습니다.
- 후면을 볼 수 있도록 두 집게로 절개를 부풀. 절개는 10mm에 도달할 수 있습니다. 아까 잿빛 또는 주변의 지방보다 더 어두운 나타납니다.
- 한 집게로 종이 위에 근막을 (지방과 조직을 덮고있는 얇은 막) 꼬집어와 주변 조직을 파괴하지 않고 가볍게 당기십시오.
- 까지 가능한 unde 번째 집게를 놓고그 종이를 rneath. 첫 포셉으로 근막을 끊어도하고 종이를 제거합니다. 당신이 성공적으로 종이를 수확 경우 혈액 얼룩이 종이는 이전에 위치해 있던 위치에 나타납니다. 참고 isotonic 솔루션 에선 싱크. 이것은 간단한 테스트 당신이 종이와 지방없는 조직을 추출한 것을 확인할 수 있습니다.
- 더 머리카락이 상처에 없는지 확인합니다.
- (피부의 안쪽) 함께 피부의이 부분을 고집 의해 클립으로 그들을 stapling하여 절개를 닫습니다. 우리는 적용 포셉 함께 미셸 클립을 사용합니다. 절개의 크기에 따라 1 개 또는 2 클립을 설치합니다. 조직 고치면 가장 자주 클립이 떨어져.
3. 수술후 관리
- 생쥐는 수술 후 쉽게 먹을 수 있도록 새장 바닥에 약간의 서부 유럽 표준시 음식을 추가합니다.
- 수술 후 6-8시간에 대하여, 그들이 고통을 경험하지 않도록하기 위해 생쥐를 확인합니다. 신중하게 그들의 행위 (자세, 걸음걸이, 관련 사항을 준수모피의 congener 및 외관과 teraction). 생쥐의 전반적인 외관이 가난한 경우 buprenorphine의 두 번째 복용을 관리할 수 있습니다. 다음날으로 쥐도 buprenorphine의 관리를 계속 달리 그들의 정상적인 동작을 회복해야합니다. 마우스는 이전 결정 및 동물 관리위원회의 승인을 종점에 도달하지 않습니다. 당신이 조언을 추구하고 동물 케어 동식물 사육장 기술자의 도움을하시기 바랍니다.
4. 림프절 처리
- 실험실에서 단일 세포 현탁액을 얻기 위해, 평소 절차에 따라 그 종이를 떼어 놓다. 우리는 프로스트 슬라이드 반대 하냐구요을 누르면 일상적 에선 당 1-2 X 10 6 세포를 구하십시오. 또한, 우리는 RNA 추출을위한 종이를 준비합니다.
- 평소 프로토콜에 따라 세포 청바지. 당신이 예상 하냐구요 유동세포계측법 프로필을 취득해야합니다.
5. 대표 결과
순방향 및 사이드 분산형 P의 예많은 수술이나 희생 마우스 (그림 2)에서 anesthetized 마우스에서 수확 LNs에 대해서만 표시됩니다. 라이브 림프구 게이트의 프로필과 세포의 비율은 솔직히 수술은 수확 세포에 적절한 방법임을 보여주는 동일합니다.
그림 1. 사타구니와 마우스의 상완 하냐구요 지방화. A. 사타구니 에선 약간 배쪽으로 그냥 뒷다리 다쳤구나 위에 위치하고 있습니다. B. 상완 에선 foreleg 뒤에 위치하고 있습니다.
lymphocytes의 그림 2. 유동세포계측법 프로필 에선 수술에 따라 획득하였습니다. 전방 측면 분산형 프로파일 anesth에서 수확 LNs 참고해 주시길 바랍니다수술 ()에 의해 또는 희생 마우스 (B)에서 etized 마우스. LNs는 수확 dissociated 및 유동 cytometer를 분석했다. 라이브 림프구 게이트에있는 세포의 비율이 표시됩니다.
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Discussion
우리는 많은 실험적인 시스템에 적용할 수있는 에선 수술의 프로토콜을 설명했습니다. 면역 반응 또는 면역 세포 항상성를 수행하는 것이 매우 유용하지만,이 기법은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 적당히 LNs을 수확 할 수 있습니다. 둘째, 공부 면역 반응은 조직의 산물이거나 외면 사타구니 또는 상완 (피부 배수) LNs에서 발생합니다. 마지막으로, 수확 세포의 숫자 에선 제거, 절대 셀 참조가 필요한 경우 실험적인 다양성에 기여할 수있는 기술적인 제한의 품질에 의해 영향을받습니다. 에선 크기가 다양한 실험 조건간에 차이가없는 경우 단, 표적 세포의 비율 자체에 특히 적합하고 정확한 정보를 제공할 수 있습니다. 다행스럽게도, 일단 기술이 잘 각 하냐구요에서 높은 재현성 휴대 전화 번호 있도록, 하냐구요 제거 개선의 품질을 마스터합니다. 우리는이 몇 가지 한계에도 불구하고 에선 수술이 공부하는 주요 이점을 제공한다고 믿고면역 반응의 진행. 첫째, 시간이 지남에 면역 반응은 실험적인 다양성뿐만 아니라 사용된 생쥐의 수를 감소, 주어진 마우스로 추적할 수 있습니다. 둘째, 이러한 림프구 항상성 또는 LNs에서 발생하는 면역 반응의 개시 등의 이벤트는 직접 공부를 할 수 있습니다. 또 다른 주요 이점은 더 많은 세포를 확장 셀 특성화를 위해 허용하는 혈액의 이상 LNs로부터 복구할 수있다는 것입니다. 이 기술은 또한 유전자 변형 생쥐를 genotyping 또는 B 세포, 돌기 세포 및 macrophages 등 LNs 통해 다른 세포 거주하는 인구 또는 인신 매매를 공부 등 다른 용도에 적합합니다.
우리 실험실과 다른 몇 년간이 기술을 사용하고 있으며 우리는 면역 반응 7-9,12,13의 코스와 5-7 면역 항상성에 대한 간섭을 관찰한 적이 없다. 야생 형 C57BL / 6 마우스를 휴식에서 순차 에선 수술 CD4의 비율과 숫자에 영향을 미치지 않았 + + T 세포 5-7. 또한, 그것은 또한 잔여 LNs에서 이러한 매개 변수에 영향을 미치지 않았다. 또한, 면역 반응의 과정 동안, 외면 에선 제거는 T 세포 반응이나 메모리 T 세포 8,9,12,13의 세대의 동력학에 영향을주지 않았다. 또한 T 세포 응답의 측면 비교에 의한 측면이 순차 에선 수술에 의해 중 다음 드나 마우스가 우리 손에있는 차이 (미발표 결과 및 그림 2)를 보여주지 않았다 희생. 따라서 순차 에선 수술은 T 세포 항상성 및 응답을 공부하기 적합합니다.
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Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
우리는 Sylvie의 Lesage 및 프로토콜의 중요한 독서에 대한 모든 실험실 구성원 감사드립니다. 이 작품은 건강 연구 (CIHR)의 캐나다 연구소에서 교부금 (걸레-77545)에 의해 지원되었다. 나탈리 Labrecque는 FRSQ 수석 장학금의 지원과 멜리사 매튜는 NSERC 알렉산더 그레이엄 벨 캐나다의 대학원 장학금을 받고있다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Graefe Fine Pattern Premium Forceps | Harvard Apparatus | 52-2144 | Strongly Curved, 10 cm (4 in), 0.8 mm tip |
| Michel Clip Applying and Removing Forceps | Harvard Apparatus | 52-3779 | 12.5 cm (5 in) |
| Michel Clip 100 | Harvard Apparatus | 52-3746 | 7.5-1.75 mm |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride) | Merck & Co. | ||
| Vetalar (Ketamine hydrochloride) | Bioniche Animal Health | DIN: 01989529 | |
| Rompun (Xylazine) | Bayer AG | DIN: 02169592 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | DIN: 02032384 | |
| Hypotears eye ointment | Novartis AG | DIN: 02133288 | |
| Baxedin (Clorhexidine gluconate 2% in isopropyl alcohol 70%) | Omega Engineering, Inc. | L0000017 | DIN: 02251477 |
References
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