Summary
Å følge utviklingen av en immunrespons over tid innenfor samme mus, kan lymfeknuter være sekvensielt fjernes ved operasjon. Her beskriver vi hvordan denne teknikken kan utføres.
Abstract
Innen immunologi, for å forstå utviklingen av en immunrespons mot en vaksine, en infeksjon eller en svulst, er responsen ofte fulgt over tid. Tilsvarende krever studiet av lymfocytt homeostase tidsforløpet eksperimenter. Utføre disse studiene innenfor samme musen er ideelt å redusere den eksperimentelle variabilitet samt antall mus brukes. Blood uttak tillater utførelse av tidsforløpet eksperimenter, men det gir bare informasjon om sirkulerende lymfocytter og gir et begrenset antall celler 1-4. Siden lymfocytter sirkulerer gjennom kroppen og bosatt i lymfeknutene har forskjellige egenskaper, er det viktig å undersøke begge steder. Den sekvensielle fjerning av lymfeknuter ved kirurgi gir en unik mulighet til å følge en immunrespons eller immun celle ekspansjon i samme musen over tid. Videre gir denne teknikken mellom 1-2x10 6 celler per lymfeknute som er tilstrekkelig til å perform fenotypisk karakterisering og / eller funksjonelle analyser. Sekvensiell lymfeknute kirurgi eller lymphadenectomy har blitt brukt av oss og andre 5-11. Her beskriver vi hvordan brakiale og inguinal lymfeknuter kan fjernes ved å lage et lite snitt i huden av en bedøvet mus. Siden operasjonen er overfladisk og gjort raskt, gjenoppretter musa veldig raskt, helbreder godt og ikke opplever overdreven smerte. Annenhver dag, er det mulig å høste en eller to lymfeknuter som åpner for tidsforløpet eksperimenter. Denne teknikken er derfor egnet til å studere egenskapene til lymfeknute-bosatt lymfocytter over tid. Denne tilnærmingen er egnet til ulike eksperimentelle design, og vi tror at mange laboratorier ville ha nytte av å utføre sekvensielle lymfeknute surgeries.
Protocol
1. Forberedelser før operasjonen
Musene ble behandlet i henhold til den kanadiske rådet på Animal Care retningslinjer.
- Anesthetise mus ved injeksjon av ketamin / xylazin (150/300 mg / kg, ip) eller ved innånding av isofluran (2%, 1L oksygen). Hvis tilgjengelig, bør isofluran brukes som det gir en bedre kontroll av anestesi tid og dybde. Dessuten er oksygen administreres samtidig som støtter fysiologiske funksjoner i dyret. Videre er isofluran direkte eliminert av lungene og dermed krever ikke lever eller nyre metabolisme.
- Injiser buprenorfin (0,05 til 0,1 mg / kg, sc) eller annen smertestillende.
- Påfør salven på musen øynene før operasjonen for å unngå øye tørrhet (hvis isofluran brukes).
- Kontroller at musen sover ved å klemme sin labb og rulle halen. Hvis musen ikke reagerer, fortsette med operasjonen.
2. Operasjonen
- Sett musen på sin side.
- Lokalisere området der du vil utføre en incision, avhengig av LN du ønsker å høste. (Figur 1).
- Bruk klorhexidin eller annen desinfiserende, til denne regionen.
- Lag en liten snitt med skarpe sakser (ca 5 mm) enten på baksiden av forben eller over hind pote nær buken (figur 1).
- Fjern løse hår du har klippet med tang. Hvis du foretrekker, kan du barbere musa før snittet. Men forlenger den prosedyren og vi finner at det ikke er nødvendig siden, som vist her, betyr det ikke bedre helbredelse eller reduksjon infeksjon, som begge er svært sjeldne.
- Strekk snitt med 2 pinsett for å se LN. Snittet kan komme opp i 10 mm. LN vises gråaktig eller mørkere enn den omkringliggende fett.
- Klem fascia (den tynne membranen som dekker fett og vev) på toppen av LN med en tang og trekk lett uten å bryte omkringliggende vev.
- Plasser den andre tang så langt som mulig underneath LN. Med de første tang, bryte fascia og fjern LN. Hvis du har høstet LN, bør en flekk av blod vises på stedet der LN var tidligere lokalisert. Merk at LN synker i isoton løsning. Denne enkle testen kan du validere at du har pakket en LN og ikke fettvev.
- Kontroller at ingen hårene er i såret.
- Lukk snittet ved å stikke de 2 delene av huden sammen (på innsiden av huden), og ved stifting dem med en klipp. Vi bruker noen Michel klippet med tang som gjelder. Installer én eller to klipp avhengig av størrelsen på såret. Oftest klippene falle av når vevet gror.
3. Postoperativ Care
- Legg litt våtfôr til bunnen av buret slik at mus kan mate lett etter operasjonen.
- Om 6 til 8 timer etter operasjonen, sjekk musene for å sikre at de ikke opplever smerte. Nøye observere deres oppførsel (holdning, ganglag, iinteraksjon med kongener og utseende av pels). Hvis det helhetlige utseendet på musene er dårlig, administrere en andre dose av buprenorfin. Ved neste dag musene skal gjenvinne sin normale oppførsel ellers fortsette administrering av buprenorfin. Musene bør aldri komme endepunktene tidligere fastsatte og akseptert av din Animal Care Council. Du ønsker kanskje å søke råd og hjelp fra din dyr omsorg vivarium tekniker.
4. Lymfeknute Håndtering
- I laboratoriet, for å få en enkelt celle suspensjon, dissosiere LN som per vanlig prosedyre. Vi trykker LN mot frostede lysbilder og rutinemessig få 1-2 x 10 6 celler per LN. Alternativt, forbereder vi LN for RNA ekstraksjon.
- Flekk cellene som per vanlig protokoll. Du bør oppnå forventede LN flowcytometri profiler.
5. Representative Resultater
Et eksempel på fremover og side spre pMye vises for LNS høstet fra en bedøvet mus ved kirurgi eller fra en ofret mus (figur 2). Profilen og prosenter av cellene i live lymfocytt porten er de samme som viser at LN kirurgi er en passende teknikk for å høste celler.
Figur 1. Inguinal og brachialis LN lokalisering i musen. A. inguinal LN ligger like over hind labben, litt mot magen. B. brachialis LN ligger bak forbenet.
Figur 2. Flowcytometri profilen lymfocytter innhentet etter LN kirurgi. Forover og side scatter profiler er vist for LNS høstet fra en anesthetized musen ved kirurgi (A) eller fra en ofret mus (B). LNS ble høstet, skilt og analysert på et strømningscytometer. Prosenter av celler i live lymfocytt gate er vist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrevet en protokoll av LN kirurgi som kan gjelde for mange eksperimentelle systemer. Selv om svært nyttig å følge immunreaksjoner eller immun celle homeostase, har denne teknikken noen begrensninger. Først kan kun fire LNS høstes. Andre må immunresponsen studerte være systemisk eller forekommer i de overfladiske lysken eller brakial (hud-drenering) LNS. Endelig er antall celler høstet påvirket av kvaliteten på LN fjerning, en teknisk begrensning som kan bidra til eksperimentell variasjon når absolutte celle tall er nødvendig. Men prosentandelen av målcellene, på egen hånd, kan gi relevant og korrekt informasjon spesielt når LN størrelsen ikke varierer på tvers av ulike eksperimentelle forhold. Heldigvis, når teknikken er godt mestret, kvaliteten på LN fjerning bedres, noe som åpner for svært reproduserbare celle tall i hver LN. Vi tror at til tross for disse få begrensninger, gir LN kirurgi viktige fordeler å studereutviklingen av immunreaksjoner. Først kan immunforsvaret over tid spores i en gitt mus, minkende eksperimentell variasjon så vel som antall mus brukes. Andre kan hendelser som lymfocytt homeostase eller immunrespons innvielse skjer i LNS være direkte studert. En annen stor fordel er at flere celler kan utvinnes fra LNS enn fra blod som åpner for utvidet celle karakterisering. Denne teknikken er også egnet til andre formål som for eksempel genotyping transgene mus eller studere andre celle populasjoner som bor eller menneskehandel gjennom LNS som B celler, dendrittiske celler og makrofager.
Vårt laboratorium og andre har brukt denne teknikken i flere år og vi har aldri observert noen forstyrrelser på i løpet av immunresponsen 7-9,12,13 og på immun homeostase 5-7. Sekvensiell LN kirurgi i hvile villtype C57BL / 6 mus påvirket ikke prosentandelen og antall CD4 + + T celler 5-7. Videre er det også ikke påvirke disse parametrene i de gjenværende LNS. Videre, i løpet av en immunrespons, gjorde overfladisk LN fjerning ikke påvirke kinetikken av T celle respons eller generering av minne T-celler 8,9,12,13. Videre etterfulgt side ved side sammenligning av T-celle respons enten ved sekvensiell LN kirurgi eller ofret mus viste ingen forskjeller i våre hender (upubliserte resultater og Figur 2). Derfor er sekvensiell LN kirurgi egnet til å studere T-celle homeostase og respons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi takker Sylvie Lesage og alle lab medlemmer for kritisk lesing av protokollen. Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning (MOP-77545) fra den kanadiske Institutes of Health Research (CIHR). Nathalie Labrecque støttes av en FRSQ Senior stipend og Melissa Mathieu fikk en NSERC Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Graefe Fine Pattern Premium Forceps | Harvard Apparatus | 52-2144 | Strongly Curved, 10 cm (4 in), 0.8 mm tip |
| Michel Clip Applying and Removing Forceps | Harvard Apparatus | 52-3779 | 12.5 cm (5 in) |
| Michel Clip 100 | Harvard Apparatus | 52-3746 | 7.5-1.75 mm |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride) | Merck & Co. | ||
| Vetalar (Ketamine hydrochloride) | Bioniche Animal Health | DIN: 01989529 | |
| Rompun (Xylazine) | Bayer AG | DIN: 02169592 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | DIN: 02032384 | |
| Hypotears eye ointment | Novartis AG | DIN: 02133288 | |
| Baxedin (Clorhexidine gluconate 2% in isopropyl alcohol 70%) | Omega Engineering, Inc. | L0000017 | DIN: 02251477 |
References
- Zehn, D., Lee, S. Y., Bevan, M. J. Complete but curtailed T-cell response to very low-affinity antigen. Nature. 458, 211-214 (2009).
- Vezys, V. Memory CD8 T-cell compartment grows in size with immunological experience. Nature. 457, 196-199 (2009).
- Zhou, X. Differentiation and persistence of memory CD8(+) T cells depend on T cell factor 1. Immunity. 33, 229-240 (2010).
- Wirth, T. C., Badovinac, V. P., Zhao, L., Dailey, M. O., Harty, J. T. Differentiation of central memory CD8 T cells is independent of CD62L-mediated trafficking to lymph nodes. J. Immunol. 182, 6195-6206 (2009).
- Rooke, R., Waltzinger, C., Benoist, C., Mathis, D. Targeted complementation of MHC class II deficiency by intrathymic delivery of recombinant adenoviruses. Immunity. 7, 123-134 (1997).
- Witherden, D. Tetracycline-controllable selection of CD4(+) T cells: half-life and survival signals in the absence of major histocompatibility complex class II molecules. J. Exp. Med. 191, 355-364 (2000).
- Labrecque, N. How much TCR does a T cell need. Immunity. 15, 71-82 (2001).
- Leignadier, J., Labrecque, N. Epitope density influences CD8+ memory T cell differentiation. PLoS One. 5, e13740 (2010).
- Leignadier, J., Hardy, M. P., Cloutier, M., Rooney, J., Labrecque, N. Memory T-lymphocyte survival does not require T-cell receptor expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20440-20445 (2008).
- Obst, R., van Santen, H. M., Mathis, D., Benoist, C. Antigen persistence is required throughout the expansion phase of a CD4(+) T cell response. J. Exp. Med. 201, 1555-1565 (2005).
- Bassett, J. D. CD8+ T-cell expansion and maintenance after recombinant adenovirus immunization rely upon cooperation between hematopoietic and nonhematopoietic antigen-presenting cells. Blood. 117, 1146-1155 (2011).
- Lacombe, M. H., Hardy, M. P., Rooney, J., Labrecque, N. IL-7 receptor expression levels do not identify CD8+ memory T lymphocyte precursors following peptide immunization. J. Immunol. 175, 4400-4407 (2005).
- Leignadier, J., Rooney, J., Daudelin, J. F., Labrecque, N. Lowering TCR expression on naive CD8+ T cells does not affect memory T-cell differentiation. Immunol. Cell. Biol. 89, 322-325 (2011).
