Summary
Aynı fare zaman içinde bir bağışıklık yanıtı ilerlemesini takip etmek, lenf düğümleri sırayla ameliyatla çıkarılabilir. Burada, bu teknik gerçekleştirilebilir açıklanmıştır.
Abstract
Bir aşı, bir enfeksiyon veya tümöre karşı bir bağışıklık cevabı ilerlemesini anlamak için immünoloji alanı içinde, yanıt zaman içinde takip eder. Benzer şekilde, lenfosit homeostazı çalışma süresi Elbette deney gerektirir. Aynı fare olan bu çalışmaların gerçekleştirme deney değişkenlik de kullanılan farelerin sayısını azaltmak için uygundur. Kan çekilme zamanı tabii deneyler performans sağlar, ancak yalnızca lenfositler dolaşım hakkında bilgi verir ve hücre 1-4 sınırlı sayıda sağlar. Vücut içinde dolaşan ve lenf bezlerinde bulunan lenfosit farklı özelliklere sahip olduğundan, her iki bölgede incelemek önemlidir. Cerrahi ile lenf nodlarının çıkarılması sıralı bir bağışıklık tepkisi veya zaman içinde aynı fare immün hücre genişleme takip eşsiz bir fırsat sunuyor. Dahası, bu teknik PE için yeterli olan lenf düğümü başına 1-2x10 6 hücreleri arasında verimlerifenotipik karakterizasyonu ve / veya fonksiyonel testler rform. Sıralı lenf nodu cerrahi veya lenfadenektomi başarıyla bize ve diğerleri 5-11 tarafından kullanılmıştır. Burada, brakiyal ve kasık lenf düğümleri bir Narkoz fare derisinde küçük bir kesi yaparak çıkarılabilir açıklar. Cerrahi yüzeysel ve hızlı bir olduğundan, fare çok çabuk kurtarır, iyi iyileştirir ve aşırı acı deneyim değil. Her iki günde, o zaman tabii deneyler için izin veren bir ya da iki lenf düğümleri hasat etmek mümkündür. Bu teknik, zamanla lenf düğümü özellikleri-bulunan lenfositler incelemek ve böylece de uygundur. Bu yaklaşım çeşitli deneysel tasarımlar için uygundur ve biz birçok laboratuvarda sıralı lenf nodu cerrahisine yarar olacağına inanıyorum.
Protocol
1. Cerrahi Öncesi Hazırlık
Fareler Hayvan Bakımı yönergelere Kanada Konseyi'ne göre tedavi edildi.
- Ketamin / Xylazine (150/300 mg / kg, ip) ile enjeksiyon yoluyla ya da izofluran inhalasyon (% 2, 1L oksijen) ile Anesthetise fareleri. Eğer mevcutsa bu anestezi zaman ve derinliği daha iyi bir kontrolü için olanak olarak, izofluran kullanılmalıdır. Ayrıca, oksijen hayvanın fizyolojik işlevleri destekler aynı anda verilir. Dahası, izofluran doğrudan akciğerler ile elimine edilir ve böylece hepatik veya böbrek metabolizmasını gerektirmez.
- Ya da bir başka analjezik - Buprenorfin (0.1 mg / kg, sc 0,05) enjekte edilir.
- (Izofluran kullanılırsa) göz kuruluğu önlemek için ameliyattan önce fare göze merhem sürün.
- Fare pençesini pinching ve kuyruk yuvarlayarak uykuda olduğundan emin olun. Fare tepki vermezse, cerrahi ile devam edin.
2. Cerrahi
- Yan fare koyun.
- Bir incisio gerçekleştirecek bölge Localizen, hasat istediğiniz LN bağlı. (Şekil 1).
- Bu bölgeye, klorheksidin veya başka bir dezenfektan uygulayın.
- Keskin bir makas (yaklaşık 5 mm) ön bacağını arkasında veya yanında karın arka ayak (Şekil 1) Yukarıda biriyle küçük bir kesi yapmak.
- Eğer forseps ile kestik tüyleri temizleyin. Eğer tercih ederseniz, kesi yapmadan önce fare tıraş olabilir. Ancak, prosedür uzatır ve burada gösterildiği gibi, hem çok nadirdir iyileşme veya azalma enfeksiyon, geliştirmek değil çünkü gerekli olmadığını bulmak.
- LN görmek için 2 forseps ile kesi gerin. Kesi 10 mm ulaşabilir. LN grimsi veya çevreleyen yağ dokusundan daha koyu görünür.
- Bir forseps ile LN üstüne fasya (yağ ve doku kapsayan ince bir zar) sıkın ve çevre dokulara zarar vermeden hafifçe çekin.
- Mümkün olduğunca unde ikinci forseps yerleştirinLN rneath. İlk forseps ile fasya kırmak ve LN çıkarın. Başarıyla LN hasat varsa, bir kan lekesi LN daha önce bulunduğu yerde görünmelidir. Not izotonik çözelti içinde LN lavabolar. Bu basit test size bir LN ve yağ dokusu değil ayıkladıktan doğrulamak sağlar.
- Hiçbir kıllar yara olduğunu doğrulayın.
- (Deri içi) bir araya cilt 2 parça yapışarak ve bir klip ile zımbalama suretiyle kesi yakındır. Biz uygulayarak forseps ile bazı Michel Klip kullanın. Kesi büyüklüğüne göre bir veya 2 klipleri yükleyin. Dokunun iyileşmesi zaman Çoğu kez, klipler düşer.
3. Ameliyat Sonrası Bakım
- Farelerin ameliyattan sonra rahatlıkla besleyebilir böylece kafesinin alt bazı yaş gıda ekleyin.
- Ameliyattan sonra 6 ila 8 saat, deneyim ağrı etmemelerini sağlamak için farelerin kontrol edin. Dikkatle davranışlarını (postür, yürüme, gözlemlemekkürk soydaşlarımıza ve görünümü ile teraction). Farelerin genel görünümü kötüyse, buprenorfin ikinci bir doz yönetmek. Ertesi gün farelerin buprenorfinin idaresi devam aksi takdirde normal davranışı geri kazanmak olmalıdır. Fareler daha önce belirlenen ve Hayvan Bakım Kurulu tarafından kabul bitiş ulaşmak asla. Ögüt ve hayvan bakımı vivaryum teknisyeni yardım isteyebilirsiniz.
4. Lenf Bezleri İşleme
- Laboratuar, tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için, normal usulüne göre LN ayrışır. Biz buzlu slaytlar karşı LN basın ve rutin LN başına 1-2 x 10 6 hücre elde. Alternatif olarak, RNA ekstraksiyonu için LN hazırlamak.
- Her zamanki protokol uyarınca hücreleri Leke. Siz bekleniyor LN sitometrisi profilleri almalıdır.
5.. Temsilcisi Sonuçlar
Öne ve yan dağılım p bir örneğiÇok ameliyatla ya da bir kurban fare (Şekil 2) bir anestetize fare hasat LN için gösterilmiştir. Canlı lenfosit kapısı içinde profil ve hücrelerin yüzdesi LN cerrahi hasat hücreleri için uygun bir yöntem olup gösteren aynıdır.
Şekil 1. Kasık ve fare brakiyal LN yerelleştirme. A. inguinal LN biraz göbek doğru, sadece arka ayak üzerinde yer almaktadır. B. brakiyal LN ön bacağını arkasında yer alır.
Lenfosit Şekil 2. Flow sitometri profili LN cerrahi sonrası elde. İleri ve yana saçılım profilleri bir Anseth hasat LN için gösterilircerrahi (A) ya da bir kurban fare (B) etized fare. LN, hasat ayrışmış ve bir akış sitometresinde edildi. Canlı lenfosit kapısı hücrelerin yüzdesi gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz pek çok deneysel sistemler için geçerli olabilir LN cerrahi bir protokol tanımladılar. Immün yanıtlar veya bağışıklık hücre homeostazının takip etmek çok yararlı olmasına rağmen, bu tekniğin birkaç sınırlaması vardır. İlk olarak, yalnızca dört LN toplanabilirler. İkincisi, incelenen immün yanıt sistemik olabilir veya yüzeyel inguinal veya brakiyal (cilt-boşaltma) LN oluşması gerekir. Son olarak, hücreler hasat sayısı LN kaldırılması, mutlak hücre sayısı ihtiyaç duyulduğunda deney değişkenliği katkıda bulunabilir bir teknik sınırlama kalitesi tarafından etkilenir. LN boyutu çeşitli deneysel durum karşısında değişmez Ancak, hedef hücrelerin yüzdesi, kendi başına, özellikle ilgili ve doğru bilgiler sağlayabilir. Neyse ki, bir kez tekniği de her LN yeniden üretilebilir hücre sayıları için izin, LN kaldırma geliştirir kalitesini hakim edilir. Biz bu birkaç sınırlamalara rağmen, LN cerrahi incelemek için önemli avantaj sağladığını düşünmekteyizimmün yanıtın ilerlemesi. İlk olarak, zaman içinde bağışıklık yanıtı, deneysel değişkenlik de kullanılan farelerin sayısını azaltarak, belirli bir fare izlenebilir. İkincisi, bu tür lenfosit homeostazı veya LN meydana gelen bağışıklık yanıtı başlatılması gibi olayları doğrudan ele alınabilir. Diğer bir önemli avantajı daha fazla hücre uzun hücre karakterizasyonu için izin kandan daha LN elde edilebilir olmasıdır. Bu teknik, aynı zamanda, transjenik farelerin genotiplenmesi ya da B hücreleri, dendritik hücreler ve makrofaj gibi LN vasıtasıyla diğer hücre yaşayan nüfus veya ticareti okuyan gibi başka amaçlar için de uygundur.
Laboratuvarımız ve diğerleri birkaç yıldır bu tekniği kullanarak edilmiştir ve biz bağışıklık yanıtı 7-9,12,13 seyrine ve 5-7 bağışıklık homeostazında herhangi bir etkileşim görülmüyor hiç. Yabani tip C57BL / 6 fare istirahat ardışık LN cerrahi CD4 yüzdesi ve numarası etkilemedi + + T hücreleri 5-7. Ayrıca, aynı zamanda kalıntı LN bu parametrelerin etkilemedi. Dahası, bir bağışıklık cevabı sırasında, yüzeysel LN çıkarılması T-hücresi tepkisi de bellek T hücreleri 8,9,12,13 bir kuşak kinetikleri etkilemedi. Ayrıca, T hücre yanıtı yana karşılaştırma yana sıralı LN cerrahi yoluyla takip veya fare elimizde herhangi bir farklılık (yayımlanmamış sonuçlar ve Şekil 2) göstermemiştir kurban. Bu nedenle, sıralı LN cerrahi T hücre homeostazının ve yanıt incelemek için uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz Sylvie Lesage ve protokol eleştirel okuma için tüm laboratuvar üye teşekkür ederiz. Bu çalışma Sağlık Araştırması (CIHR) olan Kanada Enstitüleri bir hibe (MOP-77.545) tarafından desteklenmiştir. Nathalie Labrecque bir FRSQ Kıdemli Bursu tarafından desteklenen ve Melissa Mathieu bir NSERC Alexander Graham Bell Kanada Yüksek Lisans Bursu alınır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Graefe Fine Pattern Premium Forceps | Harvard Apparatus | 52-2144 | Strongly Curved, 10 cm (4 in), 0.8 mm tip |
| Michel Clip Applying and Removing Forceps | Harvard Apparatus | 52-3779 | 12.5 cm (5 in) |
| Michel Clip 100 | Harvard Apparatus | 52-3746 | 7.5-1.75 mm |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride) | Merck & Co. | ||
| Vetalar (Ketamine hydrochloride) | Bioniche Animal Health | DIN: 01989529 | |
| Rompun (Xylazine) | Bayer AG | DIN: 02169592 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | DIN: 02032384 | |
| Hypotears eye ointment | Novartis AG | DIN: 02133288 | |
| Baxedin (Clorhexidine gluconate 2% in isopropyl alcohol 70%) | Omega Engineering, Inc. | L0000017 | DIN: 02251477 |
References
- Zehn, D., Lee, S. Y., Bevan, M. J. Complete but curtailed T-cell response to very low-affinity antigen. Nature. 458, 211-214 (2009).
- Vezys, V. Memory CD8 T-cell compartment grows in size with immunological experience. Nature. 457, 196-199 (2009).
- Zhou, X. Differentiation and persistence of memory CD8(+) T cells depend on T cell factor 1. Immunity. 33, 229-240 (2010).
- Wirth, T. C., Badovinac, V. P., Zhao, L., Dailey, M. O., Harty, J. T. Differentiation of central memory CD8 T cells is independent of CD62L-mediated trafficking to lymph nodes. J. Immunol. 182, 6195-6206 (2009).
- Rooke, R., Waltzinger, C., Benoist, C., Mathis, D. Targeted complementation of MHC class II deficiency by intrathymic delivery of recombinant adenoviruses. Immunity. 7, 123-134 (1997).
- Witherden, D. Tetracycline-controllable selection of CD4(+) T cells: half-life and survival signals in the absence of major histocompatibility complex class II molecules. J. Exp. Med. 191, 355-364 (2000).
- Labrecque, N. How much TCR does a T cell need. Immunity. 15, 71-82 (2001).
- Leignadier, J., Labrecque, N. Epitope density influences CD8+ memory T cell differentiation. PLoS One. 5, e13740 (2010).
- Leignadier, J., Hardy, M. P., Cloutier, M., Rooney, J., Labrecque, N. Memory T-lymphocyte survival does not require T-cell receptor expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20440-20445 (2008).
- Obst, R., van Santen, H. M., Mathis, D., Benoist, C. Antigen persistence is required throughout the expansion phase of a CD4(+) T cell response. J. Exp. Med. 201, 1555-1565 (2005).
- Bassett, J. D. CD8+ T-cell expansion and maintenance after recombinant adenovirus immunization rely upon cooperation between hematopoietic and nonhematopoietic antigen-presenting cells. Blood. 117, 1146-1155 (2011).
- Lacombe, M. H., Hardy, M. P., Rooney, J., Labrecque, N. IL-7 receptor expression levels do not identify CD8+ memory T lymphocyte precursors following peptide immunization. J. Immunol. 175, 4400-4407 (2005).
- Leignadier, J., Rooney, J., Daudelin, J. F., Labrecque, N. Lowering TCR expression on naive CD8+ T cells does not affect memory T-cell differentiation. Immunol. Cell. Biol. 89, 322-325 (2011).
