Summary
Dieses Manuskript beschreibt drei sich ergänzenden Protokolle zur Beurteilung der Toxizität von Polyglutamin (Polyglutamindomänen)-Expansion Proteinen in der Hefe
Abstract
Fehlfaltung mit vielen Krankheiten, insbesondere neurodegenerativer Erkrankungen, wie Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit und Huntington-Krankheit 1 zugeordnet ist. Huntington-Krankheit (HD) durch die anormalen Entwicklung eines Polyglutamin (Polyglutamindomänen) Bereich innerhalb des Proteins Huntingtin verursacht. Die Polyglutamindomänen-expanded Huntingtin-Protein erreicht eine anomale Konformation (dh es misfolds) und verursacht zelluläre Toxizität 2. Mindestens acht weiteren neurodegenerativen Krankheiten werden durch Polyglutamindomänen-Erweiterungen, einschließlich der Spinozerebelläre Ataxien und Kennedy-Syndrom 3 verursacht.
Der Modellorganismus Hefe hat wesentliche Einblicke in die zellulären und molekularen Grundlagen der Polyglutamindomänen-Toxizität erleichtert, einschließlich der Auswirkungen von intra-und inter-molekularen Faktoren der Polyglutamindomänen-Toxizität und die Identifizierung von zellulären Signalwegen, die in Zellen beeinträchtigt sind Ausdruck Polyglutamindomänen-Expansion Proteine 8.3. Wichtigly, wurden viele Aspekte der Polyglutamindomänen-Toxizität, die in der Hefe gefunden wurden, in anderen experimentellen Systemen und in gewissem Maße in Proben von HD-Patienten reproduziert und bewiesen damit, die Bedeutung des Hefe-Modell für die Entdeckung der grundlegenden Mechanismen zugrunde Polyglutamindomänen-Toxizität.
Eine direkte und relativ einfachen Weg, um Polyglutamindomänen-Toxizität in Hefe zu bestimmen ist, um das Wachstum von Hefe-Defekte Zellen, die Proteine Polyglutamindomänen-Expansion zu messen. Dieses Manuskript beschreibt drei komplementäre experimentelle Ansätze zur Polyglutamindomänen-Toxizität in Hefe durch Messung bestimmen das Wachstum von Hefe-Zellen, die Proteine Polyglutamindomänen-Expansion. Die ersten zwei experimentelle Ansätze verfolgen das Wachstum der Hefe auf Tellern, überwacht der dritte Ansatz, das Wachstum von flüssigen Hefekulturen mit dem BioscreenC Instrument.
Darüber hinaus beschreibt diese Handschrift experimentellen Schwierigkeiten, die auftreten beim Umgang mit Hefe Polyglutamindomänen Modelle können und skizziert Strategien, die helfen, oder zu vermeiden wirddiese Schwierigkeiten zu minimieren. Die Protokolle können die hier beschriebenen zu identifizieren und zu genetischen Wegen und kleinen Molekülen, die Polyglutamindomänen-Toxizität modulieren zu charakterisieren. Darüber hinaus können die beschriebenen Assays als Template für eine genaue Analyse der Toxizität von anderen Krankheit assoziierte fehlgefaltete Proteine in Hefe verursacht Modelle dienen.
Protocol
1. Expression von toxischen PolyQ-Erweiterung Proteine in Hefe
Eine systematische Analyse der genauen Aminosäuresequenz eines Proteins Polyglutamindomänen-Erweiterung, die erforderlich ist, um Toxizität in Hefe 7 erzeugen hergestellt wird. Diese toxische Polyglutamindomänen-Expansion-Protein enthält eine Amino-terminalen FLAG-Tag durch 17 Aminosäuren von der ursprünglichen Sequenz des Huntingtin-Protein, einem Polyglutamindomänen Region und eine Carboxy-terminale Fusion mit einem fluoreszierenden Protein (GFP oder entweder GFP gefolgt, siehe Abbildung 1 a). Die Expression von Proteinen mit Polyglutamindomänen Erweiterungen von 46 Glutaminen oder mehr (z. B. 72 und 103 Glutaminen) erzeugt Toxizität in Hefe, wenn sie unter der Kontrolle des induzierbaren und relativ starke GAL1-Promotor 7, 9 ausgedrückt.
Wie zuvor beschrieben, ist Polyglutamindomänen Toxizität in Hefe nur scheinbar in Zellen, die das Protein in seiner Durchführung Rnq1p Prion-Konformation, [RnQ +], zB die Hefe-Stamm W303 9. Die toxische Polyglutamindomänen-Erweiterung Protein recapitulates zentrale Aspekte der Polyglutamindomänen-Biologie in Hefe, wie Polyglutamindomänen Länge-abhängige Toxizität (siehe unten) und Aggregation (Abbildung 1 b). Bemerkenswert ist, müssen toxische Proteine Polyglutamindomänen-Erweiterung nicht töten Hefezellen sofort, sondern eher beeinträchtigen oder die Festnahme des Zellzyklus und der Zell-Devision, was zu einer Verlangsamung oder Hemmung des Wachstums von Hefe-Kolonien auf Platten oder flüssigen Kulturen (eigene unveröffentlichte Daten).
2. Potenzielle Probleme mit Hefezellen, Toxic PolyQ-Erweiterung Proteine
Hefezellen, die sonst giftige Polyglutamindomänen Expansion Proteine dürfen keine Fehler Wachstum 9. Die genetische Beschaffenheit dieser Suppressoren Polyglutamindomänen-Toxizität scheint nicht auf einfachen Mendelschen Mutationen beruhen und somit mit relativ hoher Frequenz (eigene unveröffentlichte Ergebnisse) auftreten. Wir spekulieren, dass diese spontanen Unterdrücker durch die Härtung von nicht identifizierten Prionen, die ähnlich wie in [RnQ +] bei der Bestimmung Polyglutamindomänen toxicity.Thes funktionieren verursacht werdene spontane Suppressoren Polyglutamindomänen Toxizität kann gefährden den erfolgreichen Ausgang eines Experiments, das zu charakterisieren Polyglutamindomänen Toxizität oder zur Identifizierung und Charakterisierung von Modifikatoren Polyglutamindomänen Toxizität zielt.
Um das häufige Vorkommen dieser spontanen Unterdrücker zu vermeiden, befolgen Sie die unten aufgeführten Vorsichtsmaßnahmen, die sich als sehr wirksam sind:
- Verwenden Sie frische Hefe-Zellen für Experimente Toxizität. Lagern Hefe für längere Zeiträume. Häufig abrufen frische Hefe-Kolonien aus gefrorenen Beständen.
- Häufig beobachten die Expression und Aggregation von toxischen Proteinen Polyglutamindomänen-Expansion durch Fluoreszenzmikroskopie.
- Halten der Hefezellen in Medien, die die Expression des toxischen Polyglutamindomänen Toxizität zu allen Zeiten (dh in selektiven Medien mit Glucose als einziger Kohlenstoffquelle) unterdrücken, bevor keine Toxizität Messungen.
- Verwenden Sie mindestens drei unabhängigen Transformanten für jedes Polyglutamindomänen-Toxizität Experiment. </ Li>
3. Wachstums-Assays
- Für jede experimentelle Bedingung, eine Kolonie beimpft jeweils aus drei unabhängigen Transformanten von Hefe-Zellen, die toxische Polyglutamindomänen-Expansion Proteins in 3 ml Hefe-selektive Medien mit Glucose als einziger Kohlenstoffquelle.
- Inkubieren Sie diese Kulturen über Nacht bei 30 ° C. Unter diesen Bedingungen werden die Zellen nicht exprimiert polyglutamine-Expansion Protein, da die Glucose im Medium verdrängt ihre Expression. Lassen Sie sich nicht diese Kulturen überwuchern, halten Sie die OD 600 (Absorption von Licht der Wellenlänge 600 nm) der Übernacht-Kulturen unter 1.
- Wir verwenden routinemäßig drei verschiedenen Assays, um die Mängel Wachstum von Hefe-Zellen, die das toxische Protein Polyglutamindomänen-Erweiterung zu überwachen:
3,1 Wachstum auf Platten
- Verdünnen Sie die Nacht Hefekulturen (aufgewachsen mit 220 rpm geschüttelt) auf eine OD 600 von 0,0005 (dh eine 1:1000 Verdünnung eines OD600 = 0,5 Kultur) in selektiver michØ 7 mit Glucose.
- Gleichmäßig verteilt 50 ul (was ca.. 700 Kolonien pro Platte) der verdünnten Kultur auf einer Platte (10 cm Durchmesser) mit selektiven Medium, das Glucose als einzige Kohlenstoffquelle und eine Platte mit selektiven Medium, das Galactose als einziger Kohlenstoffquelle.
- Die Inkubation erfolgt während drei bis vier Tage bei 30 ° C Nach der Inkubation, um Aufnahmen von jeder Platte und die Anzahl der Kolonien auf dem Glucose und die Anzahl der Kolonien auf den Platten Galactose. Unter idealen Bedingungen, sollte es keine oder nur sehr wenige Kolonien auf der Platte sein Galactose bei der Verwendung von Hefe-Zellen, eine hochgiftige Polyglutamindomänen-Erweiterung Protein (103q, Abbildung 2a).
3,2 Spotting-Assays
Dieser Assay ist quantitativ als die Plattierung Assay oben beschrieben, und kann somit offenbaren auch feine Unterschiede in Polyglutamindomänen Toxizität mit dem gleichen Experiment auf der gleichen Platte.
- Verdünnen Sie die ÜNight Kulturen in Medium mit Glukose zu einer OD 600 von 0,1 gezüchtet.
- Je 200 ul dieser verdünnten Kulturen in sterile 96-well Platten und bereiten fünf Fünffache serielle Verdünnungen in sterilem Wasser unter Verwendung einer Mehrkanal-Pipette.
- Verwendung eines frogger, (auch als ein Spotter, mit 8 x 6 Pins für die Übertragung von Zellsuspensionen) übertragen Zellsuspensionen auf Platten, die selektive Medien mit Glucose als einziger Kohlenstoffquelle und Platten, die selektive Medien mit Galactose als einziger Kohlenstoffquelle.
- Die Platten vor Inkubation bei 30 ° C für drei bis vier Tage trocknen.
- Nach der Inkubationszeit, machen Fotos von jeder Platte (Abb. 2b).
3.3. Die Überwachung Polyglutamindomänen Toxizität in Hefe durch das Wachstum der Flüssigkulturen
Dieses Protokoll ist die quantitative (OD600-Nummern) der drei beschriebenen Tests hier und kann sogar erkennen, sehr feine Unterschiede in Polyglutamindomänen Toxizität. Die vorgenannten ocCurrence spontane Suppressoren kann jedoch potenziell irreführende Ergebnisse zur Folge. Ich empfehlen daher die Kombination dieser Assay mit mindestens einer der beiden oben beschriebenen Assays Plattieren. Wir schlagen vor, den BioscreenC Instrument für diese Experimente zu verwenden. Die BioscreenC ist ein Instrument, misst automatisch die optische Dichte von Hefezellen in 100-Well-Platten, während bei bestimmten Temperaturen mit definierten Bewegung inkubiert. Andere Verfahren zum Züchten von Hefezellen und Messung ihrer optischen Dichte kann ebenfalls Anwendung finden.
- Waschen der Hefezellen aus Minimalmedium mit Glucose als einziger Kohlenstoffquelle dreimal in 3 ml sterilem Wasser.
- Verdünnen Sie die Übernacht-Kulturen in Medium mit Galactose zu einer OD 600 von 0,1 gezüchtet.
- Füllen Sie jede Position auf der 100-Well-Platte BioscreenC mit 300 ul der Hefekulturen.
- Öffnen Sie das Programm einfach Bioscreen Experiment. Bestimmen Sie die Anzahl der Proben Sie überwachen möchten (einschließlich Leerzeichen und nur mittel-Kontrollen), die Temperatur auf 30 ° C, muss die Länge der Versuche zu 3 Tage, setzen Sie die Mess-Intervalle bis 15 Minuten, setzen Sie den Filter bis 600 nm / Brown, und stellen Sie den Modus Schütteln bis 15 Sekunden vor jeder Messung an mittlerer Stärke.
- Die BioscreenC Instrument und der beigefügten Software produziert Excel-Tabellen von jedem Datenpunkt während des Experiments übernommen.
- Bereiten Wachstumskurven mit Excel für jede Probe und vergleichen Wachstum von verschiedenen Proben (Abbildung 2c). Eine detaillierte Beschreibung der Analyse von Daten, BioscreenC Experimenten hergestellt wurde vor dem 10. vorgesehen.
4. Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1. Die Hefe Polyglutamindomänen Modell. a) Schematische Darstellung des toxischen Polyglutamindomänen-Expansion-Protein. b) Fluoreszenzmikroskopie zeigt Hefe-Zellen, die eine kurze, nicht-toxische PolyglutamindomänenExpansion Protein (25Q, linkes Bild) und Hefe-Zellen, die eine lange, giftige Polyglutamindomänen-Erweiterung Protein (103q, rechtes Bild).
Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse der Wachstums-Assays von Hefezellen, die Polyglutamindomänen-Expansion Proteine. a) Plating-Assay. Rund 700 Hefezellen wurden auf Platten verteilt und für drei Tage bei 30 ° C. Das obere Feld zeigt eine Platte mit Glucose-Medium, dh die Expression des toxischen Polyglutamindomänen-Expansion Protein (103q) nicht induziert. Das untere Feld zeigt eine Hefe Platte mit Galactose Medium, dh die Expression des toxischen Polyglutamindomänen-Expansion Protein induziert wird. Beachten Sie, dass in dem Experiment hier dargestellt, traten keine spontane Suppressor. B) Spotting-Assay. Fünf serielle fünf Verdünnungen von Hefe-Zellen, die entweder ein nicht-toxisches Protein Polyglutamindomänen (25Q) oder eine toxische Polyglutamindomänen-Expansion Protein (103q) wurden auf Glucose-Platten, die die Expression der Proteine (linkes Feld) oder auf Galactose Platten, die ihre Expression zu induzieren unterdrücken entdeckt. Die Platten wurden dann für drei Tage bei 30 ° C inkubiert c) BioscreenC Experiment. Das Wachstum von Hefe-Zellen, die entweder ein nicht-toxisches Protein Polyglutamindomänen (25Q) oder eine toxische Polyglutamindomänen-Expansion Protein (103q) durch die überwacht wurden, BioscreenC Instrument. Die experimentellen Bedingungen und die Analyse der BioscreenC Experimente sind in den Haupttext beschrieben.
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Discussion
Dieses Manuskript beschreibt drei sich ergänzende experimentelle Ansätze zu Polyglutamindomänen-Toxizität in der Modell-Organismus Hefe zu vermindertem Wachstum von Hefe-Zellen, die toxische Polyglutamindomänen-Erweiterung der Basis von Proteinen zu messen. Work in Hefe hat tiefe Einblicke in die grundlegenden zellulären und molekularen Mechanismen der Fehlfaltung und dessen entsprechend Toxizität, einschließlich der Fehlfaltung und Toxizität von Polyglutamindomänen-Erweiterung Proteine 9,11,12 angeboten. Versuche über die Protokolle hier vorgestellten Basis haben bereits dazu beigetragen, Identifizierung und Charakterisierung von genetischen Enhancer oder Suppressoren Polyglutamindomänen Toxizität, kleines Molekül Modifikatoren der Polyglutamindomänen Toxizität und zellulären Mechanismen zugrunde Polyglutamindomänen Toxizität 5-8,13,14.
Die vorgelegten Protokolle können einfach angepasst an andere Modifikatoren der Polyglutamindomänen Toxizität wie verschiedenen Wachstumsbedingungen oder genetische Mutationen, die entweder zu reduzieren oder verstärken Polyglutamindomänen Toxizität zu untersuchen. Darüber hinaus präsentiert das experimentelle Protokollkann leicht angepasst, um die Toxizität von anderen toxischen fehlgefaltete Proteine in Hefe zu testen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Arbeit im Labor Duennwald wird durch Zuschüsse aus dem American Federation für Alternsforschung (Afar), der Erbkrankheit Stiftung (HDF) und der William Wood-Stiftung unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Frogger (6x8 pins) | V&P Scientific | VP 407 AH | |
| BioscreenC | Growth Curves USA | 5101370 | |
| 100-well Honeycomb plates | Growth Curves USA | 9602550 |
References
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