Summary
بروتوكول لدينا يوضح كيفية صب المواد الهلامية بروتين متعددة في وقت واحد بواسطة Nupage إعادة تدوير أشرطة إينفيتروجن minigel Novex، ومواد غير مكلفة شراؤها في منزل تحسين تخزين. هذه الطريقة اقتصادية ويشمل تبسيط وسيلة لتخزين المواد الهلامية في 4 درجة مئوية لمدة بضعة أسابيع. ويمكن من خلال إعادة استخدام الأشرطة هلام البلاستيك من المواد الهلامية المتاحة تجاريا، ومختبرات المواد الهلامية التي تعمل بروتين متكرر توفير تكاليف كبيرة ويساعد في تحسين البيئة.
Abstract
تقييم البروتينات باستخدام كبريتات الصوديوم بولكرلميد دوديسيل الهلام الكهربائي (SDS-PAGE) التحليل هو التقنية المستخدمة من قبل الباحثين الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية 1-4. بالنسبة للمختبرات التي تقوم بإجراء التحاليل اليومية من البروتينات، يمكن أن تكلفة المواد الهلامية بولكرلميد المتاحة تجاريا (~ $ 10/gel) أن تكون كبيرة بمرور الوقت. للتخفيف من هذه التكاليف، وبعض الباحثين تعد المواد الهلامية التي بولكرلميد الخاصة. الطرق التقليدية في صب هذه المواد الهلامية تستخدم عادة المعدات المتخصصة وألواح الزجاج هلام التي يمكن أن تكون باهظة الثمن ويحول دون صب المواد الهلامية كثير وتخزينها لاستخدامها في المستقبل. وعلاوة على ذلك، يمكن التعامل مع لوحات من الزجاج أثناء التنظيف أو هلام صب يؤدي إلى كسر عرضي خلق يشكل خطرا على السلامة، والتي قد تحول دون استخدامها في الصفوف الجامعية مختبر. بروتوكول لدينا يوضح كيفية صب المواد الهلامية بروتين متعددة في وقت واحد بواسطة Nupage إعادة تدوير أشرطة إينفيتروجن minigel Novex، وماجستير غير مكلفةاستنباط مواد تم شراؤها في منزل تحسين تخزين. هذه الطريقة اقتصادية ويشمل تبسيط وسيلة لتخزين المواد الهلامية في 4 درجة مئوية لمدة بضعة أسابيع. ويمكن من خلال إعادة استخدام الأشرطة هلام البلاستيك من المواد الهلامية المتاحة تجاريا، ومختبرات المواد الهلامية التي تعمل بروتين متكرر توفير تكاليف كبيرة ويساعد في تحسين البيئة. وبالإضافة إلى ذلك، والأشرطة هلام البلاستيك هي مقاومة جدا للكسر، الأمر الذي يجعلها مثالية لقاعات الدراسة الجامعية مختبر.
Protocol
1. إعداد أشرطة الكاسيت
- نظيفة الأمامي والخلفي لوحات لاستخدامها كاسيت Nupage إينفيتروجن minigel Novex، أو غيرها من كاسيت minigel التجارية.
- إعداد مل 1-3 تقريبا من الايبوكسي البلاستيك وتخلط جيدا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- تطبيق الايبوكسي إلى حافة داخل لوحة الجبهة، حيث اثنين من لوحات وسوف تأتي في اتصال عندما يتم تجميعها في شريط كاسيت.
- حرك قطعة من الورق أو الورق المقوى مرشح من خلال الشق السفلي من لوحة الى الوراء عندما تجميع كاسيت لمنع الايبوكسي الزائدة من ختم الافتتاح. إزالة ورقة الترشيح في أقرب وقت ويتم تجميع اثنين من لوحات.
- وضع لقطات الموثق على طول الحواف لختم ضيق، والسماح لأشرطة الجلوس بين عشية وضحاها لالايبوكسي لعلاج تماما.
- اغلاق فتحة في الجزء السفلي من اللوحة الخلفية مع الشريط الكهربائي.
2. صب جل حل
- إلى قارورة 125 مل ذراع الجانب، إضافة ما يلي:2.25 مل من 4X تريس، قاعدة حل ودرجة الحموضة عازلة هلام 8.70، 3.50 مل من مادة الأكريلاميد 30.8٪ / bisacrylamide، 3.25 مل من النوع الأول للمياه كاشف الصف (IRG-H 2 O) لحجم ما مجموعه 9 ملم.
- دي غاز الحل لمدة 10 دقيقة عن طريق ربط الذراع الجانب من القارورة إلى جهاز فراغ، ومما يضع حدا مقلوب على الجزء العلوي من القارورة.
- نقل مل 9 من اجتثاث بالغاز حل ل50 مل يمكن التخلص منها البولي بروبلين أنبوب الطرد المركزي، وإضافة 30 ميكرولتر من بيرسلفات ammounium 10٪ (APS) و 6 ميكرولتر من N، N، N '، N'،، tetramethylethylenediamine (TEMED)، ومزيج بشكل جيد من قبل يحوم الحل لتجنب إدخال فقاعات.
- صب فورا الحل في الكاسيت، والسماح لها لتشغيل أسفل الجانب من كاسيت لمنع أي الفقاعات من النشوء بين لوحات هلام. شغل كاسيت إلى ما يقرب من 2 سم من الحافة العلوية من لوحة (أقصر) من الأمام.
- إضافة بلطف 0.5 مل من بيوتانول-1 مشبعة 1X العازلة جل حل، والسماح للهلام تتبلمر لمدة 1ساعة.
3. صب جل التراص
- إضافة التالية إلى قارورة 125 مل ذراع الجانب: 0.75 مل من 4X تريس، التراص قاعدة هلام درجة الحموضة عازلة 6.80، 0.40 مل من مادة الأكريلاميد 30.8٪ / bisacrylamide، 1.85 مل من O 2 IRG-H لإجمالي حجم 3 مل.
- دي غاز الحل لمدة 10 دقيقة كما هو موضح في الخطوة 2.
- في حين حل هلام التراص والتفريغ، من أجل الخروج من 1-بيوتانول مشبعة 1X العازلة حل وهلام من الجزء العلوي من جل حل. شطف الجزء العلوي من جل حل مرة واحدة مع O. 2 IRG-H صب قبالة المياه واستخدام ورقة أو ماص Whatman مرشح لامتصاص أي السائل المتبقية.
- إزالة 3 مل من الحل degassed وإضافة 9 ميكرولتر من وكالة الأنباء الجزائرية 10٪ و 2 ميكرولتر من TEMED وتخلط جيدا.
- صب بسرعة الحل في الكاسيت، والسماح لها لتشغيل أسفل الجانب من الكاسيت إلى أن يقع بالقرب من الحافة العلوية للوحة الأمامية أقصر هلام.
- اضافة الى وجود مشط هلام النظيفة في الجزء العلوي من كاسيت هلام،وضع مقطع الموثق على كاسيت على مشط ليثبت في مكانه. السماح للهلام التراص تتبلمر لمدة 1 ساعة ليلة وضحاها.
4. تخزين هلام
- عندما الجل وبلمرة تماما، وإزالة لقطات الموثق ووضع الكاسيت في كيس بلاستيكي قابل للغلق للحرارة، أو كيس من البلاستيك اعادة اغلاقها باحكام.
- صب 20 مل من 1X العازلة هلام التراص الذي يحتوي على 0.1٪ أزيد الصوديوم في الحقيبة.
- حرارة ختم الحقيبة لمدة 5 ثوانى وتأكد من عدم وجود تسرب في الحقيبة.
- تخزين هلام في درجة مئوية 4
5. إعداد العينات
- في أنبوب microcentrifuge رقيقة الجدران، إضافة ما يصل إلى 6.5 ميكرو لتر من عينة بروتين، 7.5 ميكرو لتر من Novex 2X تريس، جليكاين العازلة عينة SDS، 1 ميكرولتر من dithiothreitol 100 ملم (DTT) وIRG O-H 2 (إذا لزم الأمر) ل اجمالى حجم التداول من 15 ميكرولتر.
- خلط العينة vortexing، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة عينة لجلب محتويات إلى أسفل الأنبوب. <لى> تفسد العينة على 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
6. تشغيل هلام
- إعداد جهاز هلام Novex.
- إضافة 200 مل من عازلة الجري تريس، جليكاين الذي يحتوي على 500 ميكرولتر من مضادات الأكسدة Nupage إلى الدائرة الداخلية، و 300 مل من تريس، جليكاين تشغيل المخزن إلى غرفة الخارجي.
- تحميل عينات من التشويه والتحريف بروتين (15 ميكرولتر) في الآبار باستخدام طرف جل ماصة التحميل.
- تشغيل جل في 200 V لل60-70 دقيقة.
7. تلطيخ الجل
- إزالة كاسيت من جهاز جل وكسر ختم الايبوكسي من قبل المتطفلين على اثنين من لوحات هلام البلاستيك وبصرف النظر باستخدام سكين هلام أو سكين المعجون شديدة. بعناية فصل جل من لوحات، مع الحرص على عدم المسيل للدموع الجل.
- شطف الجل مع IRG-H 2 O ثلاث مرات مع تحريض لطيف.
- وصمة عار في هلام مع إينفيتروجن SimplyBlue SafeStain لمدة 1 ساعة مع الإثارة لطيف.
- صب قبالة حل وتلطيخيزيل اللون الجل مع O. 2 IRG-H
8. تنظيف الأشرطة
- تستخدم ملعقة معدنية لكشط أو تقشر الايبوكسي في كل شيء على أشرطة الكاسيت بحيث يمكن إعادة استخدامها مرة أخرى.
- غسل كل واحدة من لوحات هلام البلاستيك بمحلول منظف معتدل، وشطف جيدا مع ماء الصنبور يليه الماء المقطر.
9. ممثل النتائج
لان الايبوكسي ستشكل ختم المياه ضيق، (الشكل 1)، فإن أشرطة الكاسيت لا تسرب عندما يتم سكب مادة الأكريلاميد في حل منها. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن لأشرطة هلام فتحت بسهولة لاسترداد هلام لتلطيخ، ويمكن مقشر والايبوكسي الخروج من أشرطة الكاسيت للسماح المستمر إعادة استخدامها. كما هو مبين في الشكل 2، وهلام ويبين فصل واضح من علامات البروتين وشرائح عينة مناسبة للبروتين الكهربائي الروتيني.
الشكل 1. تطبيق صحيفةالكاتيون من الايبوكسي لختم أشرطة minigel. يتم تطبيق طبقة رقيقة من الايبوكسي إلى حافة واحدة من أشرطة الكاسيت قبل التجميع. لتسليط الضوء على الايبوكسي، كانت كاذبة اللون الأحمر في هذه الصورة.
الشكل 2. صب فصل البروتينات على هلام SDS-تريس، جليكاين باستخدام إعادة استخدام الأشرطة minigel. تم تنفيذ SDS-PAGE على النحو المبين أعلاه. الكهربائي التالية تم إزالة جل من كاسيت minigel، ملطخة في SafeStain SimplyBlue وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، وتصويرها باستخدام الضوء الأبيض المنقولة. حارة M يحتوي على بروتين SeeBlue المعايير Plus2 قبل الملون. يشار إلى الأوزان الجزيئية للبروتينات في M ممر على الجانب الأيمن من هلام في kilodaltons (قده). الممرات الأخرى تظهر من البروتينات المحللة تطهيرها من البكتيريا تعبر عن الجلوتاثيون-S-ترانسفيراز (ضريبة المبيعات) الموسومة بروتين. البروتينات هي تلك التي تظهر غسلها من زالخرز lutathione قبل شطف من البروتين ضريبة السلع والخدمات الموسومة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بروتين الكهربائي للهلام هو وسيلة لا غنى عنها للمختبرات البيولوجيا الجزيئية الأكثر. minigels المتاحة تجاريا توفير مستوى عال من الراحة، ولكن يمكن أن يكون مكلفا. هنا نبين كيفية إعادة استخدام الأشرطة minigel من ماركة شعبية من minigels متاحة تجاريا. هذا الأسلوب يحتفظ الراحة من وجود مصدر الجاهزة من المواد الهلامية، ولكن في جزء صغير من تكلفة minigels متاحة تجاريا. ومن الخطوات الرئيسية في هذا الإجراء هو تطبيق المبلغ الصحيح للالايبوكسي لاغلاق تماما الكاسيت قبل إضافة مادة الأكريلاميد unpolymerized لمنع التسرب. استخدام الايبوكسي فقط أن يتم تصنيف لصناعة البلاستيك، والسماح بوقت كاف للبلمرة من الايبوكسي كما هو موضح في إرشادات الشركة المصنعة. واضاف للراحة، ويمكن أن تكون مختومة الأشرطة متعددة وتخزينها قبل صب المواد الهلامية. عندما صب جل حل، ومن المؤكد ان تترك مجالا كافيا للهلام التراص، عادة حوالي 0.5 سم أكثر من ارتفاع تيانه يستخدم مشط لتشكل الآبار. خلال البلمرة من هلام حل، والحفاظ على هلام مثل تستقيم أن المنطقة العازلة المشبعة 1-بيوتانول ستشكل على التوالي، وسطح مستو لتشكل في الجزء العلوي من جل حل. إذا كان جل لا تتبلمر في غضون 30 دقيقة، يمكن زيادة كمية وكالة الأنباء الجزائرية 10٪ وTEMED. مرة واحدة في هلام انتهاء تشغيل، فمن المهم لكسر بعناية ختم الايبوكسي لمنع تمزيق جل رقيق. وذكرت والأسلوب هنا من إعادة استخدام الأشرطة الجل التجارية يمكن ان يوفر تكاليف كبيرة المرتبطة باستخدام SDS-PAGE متكررة. ويمكن إعادة استخدام الأشرطة نفسه لسنوات وليس لدينا أي أدلة على أن الاستخدام المتكرر للكاسيت نفسه يقلل من قابليتها للاستخدام. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إعداد المواد الهلامية متعددة وتخزينها لعدة أسابيع في فيلم البوليستر كيس الحاجز تحتوي على كمية صغيرة من 1X العازلة التي تحتوي على هلام التراص 0،1٪ أزيد الصوديوم.
الاختصارات:
Dithiothreitol (DTT)، ن، ن، ن '، ن'،، tetramethylethylenediamine (TEMED)، اكتب أنا المياه كاشف الصف (IRG-H2O)، ammounium بيرسلفات (APS)، كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS)، تريس (hydroxymethyl) aminomethane (تريس القاعدة)، N، N'-الميثيلين مكرر، الأكريلاميد (مكرر -الأكريلاميد)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
الكتاب أشكر معهد هوارد هيوز الطبي لعلوم الحياة الجبهة المتحدة للمشاركة في الجائزة إلى AH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Invitrogen Nupage Novex Minigel Cassette (1.0 mm) | Invitrogen | NC2010 | Available in 2, 5, 10, 12, 15 and 2D wells |
| Plastic Epoxy | Loctite | 108771 | |
| Electrical Tape | Scotch Co. | ||
| 125 mL side arm flask | Pyrex | 5360 | |
| 4X Tris-Base resolving gel buffer | 1.5 M Tris-base pH 8.7 | ||
| acrylamide | Fisher Scientific | 01065-500 | |
| Bis-acrylamide | MP Biomedicals | 800173 | |
| 30.8% acrylamide solution | 30:0.8 acrylamide: bis-acrylamide in IRG-H2O | ||
| 10% APS | Fisher Scientific | BP179-25 | 0.1 g ammonium persulfate in 1 ml IRG-H2O, prepared immediately before use |
| TEMED | Acros Organics | 138450500 | |
| 1-butanol saturated with 1X resolving gel buffer | 5:2 1-butanol to 1X resolving gel buffer | ||
| 4X Tris-Base stacking gel buffer | 1.5 M Tris-base pH 6.8 | ||
| Gel comb | Invitrogen | NC3015 | 15 well, 1.0 mm thickness |
| Impulse Sealer | TEW Electric Heating Equipment | ||
| Heat Sealable Pouch | Kapak/Scotchpak | 1 pint size (6.5" x 8") | |
| Gel storage buffer | 1X stacking gel buffer with 0.1% sodium azide | ||
| Novex SDS Tris-Glycine sample buffer (2X) | Invitrogen | LC2676 | |
| DTT | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| 10X Tris-Gylcine Running buffer | Invitrogen | LC2675 | 1L of 10X stock: 29.0 g Tris-Base, 144.0 g Glycine, 10.0 g SDS |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | |
| Gel Knife | Invitrogen | EI9010 | |
| SimplyBlue Safe Stain | Invitrogen | LC6065 |
References
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Raymond, S., Weintraub, L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis. Science. 130, 711-711 (1959).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem. Biophys. Res. Commun. 28, 815-820 (1967).
