Summary
Vores protokol viser, hvordan man hælde flere proteingeler ad gangen ved genbrug Invitrogen Nupage Novex minigel kassetter og billige materialer, der indkøbes på et hjem forbedring butik. Dette økonomiske og strømlinet Fremgangsmåden indbefatter en måde at opbevare gelerne ved 4 ° C i nogle få uger. Ved genbrug af plastic gelkassetter fra kommercielt tilgængelige geler, laboratorier, der kører hyppige proteingeler kan spare betydelige omkostninger og hjælpe miljøet.
Abstract
Evaluering af proteiner under anvendelse af natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE-analyse) er en almindelig teknik ved biokemiske og molekylærbiologiske forskere 1-4. For laboratorier, som udfører daglige analyser af proteiner, kan omkostningerne ved kommercielt tilgængelige polyacrylamidgeler (~ $ 10/gel) være betydeligt med tiden. For at mindske denne omkostning, nogle forskere forberede deres egne polyacrylamidgeler. Traditionelle metoder til at hælde disse geler typisk anvender specialudstyr og glas gel plader, der kan være dyrt og udelukker hælde mange geler og gemme dem til senere brug. Derudover kan håndtering af glasplader under rengøring eller gel hælde resultere i utilsigtet brud skabe en sikkerhedsrisiko, som kan udelukke deres anvendelse i bachelor laboratorie klasser. Vores protokol viser, hvordan man hælde flere proteingeler samtidig ved genbrug Invitrogen Nupage Novex minigel kassetter, og billig marialer købt på et hjem forbedring butik. Dette økonomiske og strømlinet Fremgangsmåden indbefatter en måde at opbevare gelerne ved 4 ° C i nogle få uger. Ved genbrug af plastic gelkassetter fra kommercielt tilgængelige geler, laboratorier, der kører hyppige proteingeler kan spare betydelige omkostninger og hjælpe miljøet. Desuden er plast gelkassetterne ekstremt modstandsdygtige over for beskadigelse, hvilket gør dem ideelle til undergraduate laboratorie klasseværelser.
Protocol
1. Forberedelse af kassetter
- Ren og bagpladerne af anvendes Invitrogen Nupage Novex minigel kassette eller andre kommercielle minigel kassette.
- Forberede omkring 1-3 ml af plast epoxy og bland godt i overensstemmelse med producentens instruktioner.
- Anvende epoxy til den indvendige kant af den forreste plade, hvor de to plader vil komme i kontakt, når kassetten er samlet.
- Glide et stykke filtrerpapir eller karton gennem bunden slids bagpladen ved montering af kassetten for at forhindre overskydende epoxy at tætne åbningen. Fjerne filterpapir, så snart de to plader er samlet.
- Placer bindemiddel klip langs kanterne for en tæt forsegling, og lad kassetterne sidde natten over for epoxy til at hærde fuldstændigt.
- Tætne slidsen på bunden af bagpladen med elektrisk tape.
2. Hælde løse gelen
- Til en 125 ml sidearm kolbe følgende tilsættes:2,25 ml 4X Tris-base opløsende gel, pH 8,70, 3,50 ml 30,8% acrylamid / bisacrylamid, 3,25 ml type I reagenskvalitet vand (IRG-H2O) til et samlet volumen på 9 ml.
- De-gas opløsningen i 10 minutter ved fastgørelse af sidearmen af kolben til et vakuumapparat og placere en inverteret prop på toppen af flasken.
- Overføre 9 ml afgasset opløsning til en 50 ml engangs polypropylen centrifugerør, og der tilsættes 30 gl 10% ammounium persulfat (APS) og 6 pi N, N, N ', N',-tetramethylethylendiamin (TEMED) og blandes og ved omrystning af opløsningen for at undgå indføring af luftbobler.
- Umiddelbart Hæld opløsningen i kassetten, når det kører ned langs siden af kassetten for at forhindre eventuelle bobler der dannes mellem de gelplader. Fylde kassetten til cirka 2 cm fra den øverste kant af den forreste (kortere) plade.
- Forsigtigt tilsættes 0,5 ml 1-butanol mættet med 1X opløsende gel buffer og lade gelen polymerisere i entime.
3. Hælde stabling gel
- Tilsættes følgende i en 125 ml sidearm kolbe: 0,75 ml 4X Tris-basestabling gel, pH 6,80, 0,40 ml 30,8% acrylamid / bisacrylamid, 1,85 ml IRG-H2O til et samlet volumen på 3 ml.
- De-gas opløsningen i 10 minutter som beskrevet i trin 2.
- Mens den stablede gel opløsningen afgasning, hæld 1-butanol mættet med 1X opløsende gel buffer fra toppen af den opløsende gel. Skylning toppen af den opløsende gel gang med IRG-H2O Hæld vand og bruge en sugende eller en Whatman filtrerpapir til at absorbere enhver resterende væske.
- Fjernelse 3 ml din afgasset opløsning, og der tilsættes 9 gl 10% APS og 2 pi TEMED og bland godt.
- Hurtigt hældes opløsningen i kassetten, så den kan løbe ned langs siden af kassetten, indtil den er nær den øverste kant af den kortere forreste gelpladen.
- Indsætte en ren gel kam ind i toppen af gelen kassetten,placere et bindemiddel klip på kassetten hen over kammen til at holde den på plads. Lad stacking gel polymerisere i 1 time til natten over.
4. Lagring af gelen
- Når gelen er fuldstændig polymeriseret, fjerne bindemidlet clips og placere kassetten i en varmeforseglelig plast pose eller en genlukkelig plastpose.
- Hæld 20 ml 1X stacking gel buffer, der indeholder 0,1% natriumazid i posen.
- Varm forsegle posen i 5 sek, og sørg for der er ingen utætheder i posen.
- Opbevares gelen ved 4 ° C.
5. Forberedelse af prøver
- I et tyndvægget mikrocentrifugerør, og der tilsættes op til 6,5 pi proteinprøve, 7,5 ul 2x Novex Tris-Glycin SDS prøvepuffer, 1 ul 100 mM dithiothreitol (DTT) og IRG-H2O (hvis nødvendigt) for en totalvolumen på 15 ul.
- Prøven blandes ved omhvirvling og kortvarigt centrifugeres prøven at bringe indholdet til bunden af røret. <li> Denaturer prøven ved 70 ° C i 10 minutter.
6. Kører gel
- Opstil Novex gelapparat.
- Tilsæt 200 ml Tris-glycin Running buffer, der indeholder 500 pi Nupage antioxidant til det indre kammer, og 300 ml Tris-glycin Kørsel puffer til det ydre kammer.
- Indlæse de denaturerede proteinprøver (15 ul) i brøndene ved hjælp af en gel loading pipettespids.
- Kør gelen ved 200 V for 60-70 min.
7. Farvning af gelen
- Fjerne kassetten fra gelen apparatet og bryde epoxy forseglingen ved at lirke de to plastelementer gelplader mellemrum ved hjælp af en gel kniv eller en stiv spartel. Omhyggeligt adskilt gelen fra pladerne, idet man ikke rive gelen.
- Skyl gelen med IRG-H2O tre gange med forsigtig omrøring.
- Plet gelen med Invitrogen SimplyBlue SafeStain i 1 time med forsigtig omrøring.
- Hæld farvningsopløsning ogaffarves gelen med IRG-H2O
8. Rensning af kassetterne
- Anvende en metalspatel for at skrabe eller skrælle al epoxy på kassetterne, så de kan genbruges igen.
- Vask hver af plast gel plader med et mildt rengøringsmiddel, og skyl godt med vand fra hanen, efterfulgt af destilleret vand.
9. Repræsentative resultater
Fordi epoxy vil danne en vandtæt forsegling, (figur 1), vil kassetterne ikke lække, når acrylamid Opløsningen hældes i dem. Desuden kan de gelkassetterne let åbnes for at hente gelen for farvning, og epoxy kan skrælles af kassetterne at tillade deres fortsatte genbrug. Som vist i figur 2, gelen viser klar adskillelse af proteinmarkører og eksempler bånd egnet til rutinemæssig protein elektroforese.
Figur 1. Ansøgningdelse af epoxy at forsegle minigel kassetter. Et tyndt lag af epoxy påføres kanten af en af kassetterne før samling. For at understrege epoxy, det var falsk-farvet rødt på dette billede.
Figur 2. Adskillelse af proteiner på en SDS-Tris-glycin gel hældt anvendelse genbruges minigel kassetter. SDS-PAGE blev udført som beskrevet ovenfor. Efter elektroforese blev gelen fjernet fra minigel kassetten, farvet i SimplyBlue SafeStain ifølge producentens anvisninger, og fotograferet under anvendelse transmitteret hvidt lys. Bane M indeholder SeeBlue Plus2 forud farvede proteinstandarder. Molekylvægtene af proteinerne i bane M er angivet på højre side af gelen i kilodalton (kDa). De andre baner viser proteiner fra et klaret lysat fra bakterier, der udtrykker et glutathion-S-transferase (GST)-tagget protein. De viste proteiner er dem, vaskes af glutathione perler før eluering af GST-taggede protein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protein gelelektroforese er en uundværlig fremgangsmåde til fleste molekylærbiologiske laboratorier. Kommercielt tilgængelige minigelerne sikre et højt niveau af bekvemmelighed, men kan være dyrt. Her viser vi, hvordan man genbruge de minigel kassetter fra et populært mærke af kommercielt tilgængelige minigelerne. Denne fremgangsmåde bevarer bekvemmelighed har en færdiglavet kilde geler, men en brøkdel af omkostningerne ved kommercielt tilgængelige minigeler. Et vigtigt trin i denne procedure anvender den korrekte mængde epoxy til fuldstændig forsegling af kassetterne før tilsætning af upolymeriseret acrylamid at forhindre lækage. Brug kun epoxy, der er vurderet til plast, og tid nok til polymerisering af epoxy som beskrevet i producentens anvisninger. For ekstra komfort, kan flere kassetter kan forsegles og opbevares før hælde geler. Når hælde løse gelen, skal du sørge for at efterlade nok plads til stabling gel, typisk omkring 0,5 cm mere end højden af than kam anvendes til at danne fordybningerne. Under polymerisationen af den opløsende gel, holde gelen lodret, således at pufferen-mættede 1-butanol vil danne en lige, plan overflade til dannelse af toppen af den opløsende gel. Hvis gelen ikke polymeriserer i 30 minutter, kan mængden af 10% APS og TEMED øges. Når gelen er kørt, er det vigtigt omhyggeligt at bryde epoxy tætning for at forhindre at rive tynd gel. Metoden rapporteret her til re-hjælp kommercielle gelkassetter kan spare betydelige omkostninger forbundet med hyppige SDS-PAGE brug. De samme kassetter kan genanvendes til år, og vi har ingen beviser for, at gentagen anvendelse af den samme kassette reducerer deres anvendelighed. Derudover kan flere geler fremstilles og opbevares i flere uger i et polyester barrierefilm pose indeholdende en lille mængde 1X stacking gel buffer indeholdende 0,1% natriumazid.
Forkortelser:
Dithiothreitol (DTT), N, N, N ', N',-tetramethylethylendiamin (TEMED), type I reagenskvalitet vand (IRG-H2O), ammounium persulfat (APS), natriumdodecylsulfat (SDS), Tris (hydroxymethyl) aminomethan (Tris-base), N, N'-methylen-bis-acrylamid (bis -acrylamid)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne takker Howard Hughes Medical Institute for UF videnskab for Life pris til AH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Invitrogen Nupage Novex Minigel Cassette (1.0 mm) | Invitrogen | NC2010 | Available in 2, 5, 10, 12, 15 and 2D wells |
| Plastic Epoxy | Loctite | 108771 | |
| Electrical Tape | Scotch Co. | ||
| 125 mL side arm flask | Pyrex | 5360 | |
| 4X Tris-Base resolving gel buffer | 1.5 M Tris-base pH 8.7 | ||
| acrylamide | Fisher Scientific | 01065-500 | |
| Bis-acrylamide | MP Biomedicals | 800173 | |
| 30.8% acrylamide solution | 30:0.8 acrylamide: bis-acrylamide in IRG-H2O | ||
| 10% APS | Fisher Scientific | BP179-25 | 0.1 g ammonium persulfate in 1 ml IRG-H2O, prepared immediately before use |
| TEMED | Acros Organics | 138450500 | |
| 1-butanol saturated with 1X resolving gel buffer | 5:2 1-butanol to 1X resolving gel buffer | ||
| 4X Tris-Base stacking gel buffer | 1.5 M Tris-base pH 6.8 | ||
| Gel comb | Invitrogen | NC3015 | 15 well, 1.0 mm thickness |
| Impulse Sealer | TEW Electric Heating Equipment | ||
| Heat Sealable Pouch | Kapak/Scotchpak | 1 pint size (6.5" x 8") | |
| Gel storage buffer | 1X stacking gel buffer with 0.1% sodium azide | ||
| Novex SDS Tris-Glycine sample buffer (2X) | Invitrogen | LC2676 | |
| DTT | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| 10X Tris-Gylcine Running buffer | Invitrogen | LC2675 | 1L of 10X stock: 29.0 g Tris-Base, 144.0 g Glycine, 10.0 g SDS |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | |
| Gel Knife | Invitrogen | EI9010 | |
| SimplyBlue Safe Stain | Invitrogen | LC6065 |
References
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Raymond, S., Weintraub, L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis. Science. 130, 711-711 (1959).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem. Biophys. Res. Commun. 28, 815-820 (1967).
