Summary
פרוטוקול שלנו מדגים כיצד למזוג ג 'ל חלבון מרובים בכל פעם על ידי מיחזור Invitrogen Nupage קלטות Novex minigel וחומרים זולים שנרכשו בחנות שיפוץ הבית. שיטה זו חסכונית יעילה כולל דרך לאחסן את הג'לים על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות. על ידי מחדש באמצעות קלטות ג'ל פלסטיק של ג'ל זמינים מסחרית, מעבדות הפועלות ג'ל חלבון תכופים יכול לחסוך בעלויות משמעותיות לעזור לסביבה.
Abstract
הערכה של חלבונים באמצעות סולפט dodecyl נתרן polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) ניתוח היא טכניקה נפוצה בשימוש על ידי חוקרים לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית 1-4. עבור מעבדות המבצעות בדיקות יומיות של חלבונים, העלות של ג'ל polyacrylamide זמינים מסחרית (~ $ 10/gel) יכול להיות משמעותי לאורך זמן. כדי להקטין את העלות, כמה חוקרים להכין ג'ל שלהם polyacrylamide. השיטות המסורתיות של לשפוך את הג'לים בדרך כלל לנצל ציוד מיוחד ו ג 'ל זכוכית צלחות כי יכול להיות יקר למנוע לשפוך ג'ל רבים ואחסונם לשימוש עתידי. יתר על כן, טיפול של לוחות הזכוכית במהלך ניקוי או ג'ל לשפוך יכול לגרום שבירה בשוגג יצירת מפגע בטיחותי, אשר עשוי למנוע את השימוש בהם בשיעורי מעבדה לתואר ראשון. פרוטוקול שלנו מדגים כיצד לשפוך ג'ל חלבונים רבים בו זמנית על ידי מיחזור Invitrogen Nupage קלטות Novex minigel, ותואר שני זולterials לרכוש בחנות שיפוץ הבית. שיטה זו חסכונית יעילה כולל דרך לאחסן את הג'לים על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות. על ידי מחדש באמצעות קלטות ג'ל פלסטיק של ג'ל זמינים מסחרית, מעבדות הפועלות ג'ל חלבון תכופים יכול לחסוך בעלויות משמעותיות לעזור לסביבה. בנוסף, קלטות ג'ל פלסטיק עמידים מאוד שבירה, מה שהופך אותם אידיאליים עבור כיתות מעבדה לתואר ראשון.
Protocol
1. הכנת קלטות
- מול נקי ובחזרה צלחות קלטת שימוש Invitrogen Nupage minigel Novex או minigel אחר קלטת מסחרי.
- להכין 1-3 מ"ל של כ אפוקסי פלסטיק ומערבבים היטב על פי הוראות היצרן.
- החל אפוקסי לקצה בתוך צלחת הקדמי, שבו שני לוחות יבוא במגע כאשר את הקלטת מורכבת.
- החלק פיסת נייר קרטון פילטר או דרך החריץ התחתון של הלוח האחורי כאשר הרכבת את הקלטת כדי למנוע אפוקסי עודפי איטום הפתיחה. הסר את הנייר מסנן מיד את שני לוחות מורכבים.
- מניחים מהדקים יחד את הקצוות של חותם חזק, ולתת קלטות יושבים לילה עבור אפוקסי באופן מלא לרפא.
- לאטום את החריץ בחלק התחתון של הלוח האחורי עם הקלטת חשמל.
2. לשפוך ג'ל לפתרון
- כדי בקבוק 125 מ"ל בצד הזרוע, להוסיף את הדברים הבאים:2.25 מ"ל של 4X-טריס בסיס פתרון של ג'ל חיץ pH 8.70, 3.50 מ"ל של acrylamide 30.8% / bisacrylamide, 3.25 מ"ל של מים סוג אני מגיב כיתה (IRG-H 2 O) על בהיקף כולל של 9 מ"ל.
- דה גז פתרון 10 דקות על ידי הצמדת היד בצד של הבקבוק למכשיר ואקום, והנחת פקק הפוך על החלק העליון של הבקבוק.
- להעביר 9 מ"ל של פתרון דה הגזים כדי 50 מ"ל הפנויה צינור פוליפרופילן צנטריפוגות ולהוסיף 30 μl של persulfate ammounium 10% (APS) ו 6 μl של N, N, N ', נ',-tetramethylethylenediamine (TEMED) ומערבבים היטב על ידי מתערבל פתרון כדי למנוע החדרת בועות.
- יוצקים מיד את הפתרון אל תוך קלטת, הפעלתו את הצד של הקלטת למנוע בועות מ טביעה בין צלחות ג'ל. למלא את הקלטת של כ 2 ס"מ מהקצה העליון של הלוח (קצר) הקדמי.
- בעדינות להוסיף 0.5 מ"ל של butanol-1 רווי חיץ 1X ג'ל לפתרון ולתת ג'ל לפלמר עבור 1שעה.
3. לשפוך ג'ל לערום
- להוסיף את הדברים הבאים בקבוק 125 מ"ל לצד הזרוע: 0.75 מ"ל של pH טריס 4X-Base הערמה ג'ל חיץ 6.80, 0.40 מ"ל של acrylamide 30.8% / bisacrylamide, 1.85 מ"ל של IRG-H 2 O על בהיקף כולל של 3 מ"ל.
- דה גז פתרון דקות 10 כמתואר בשלב 2.
- בעוד הפתרון ג'ל לערום הוא degassing, יוצקים מעל 1-butanol רווי חיץ פתרון של 1X ג'ל מהחלק העליון של ג'ל לפתרון. יש לשטוף את החלק העליון של ג'ל לפתרון פעם אחת עם IRG-H 2 O. יוצקים את המים ולהשתמש נייר bibulous או Whatman מסנן לספוג כל נוזל הנותר.
- הסרה של 3 מ"ל של תמיסת degassed ולהוסיף 9 μl של APS 10% ו 2 μl של TEMED ומערבבים היטב.
- במהירות יוצקים את הפתרון קלטת, הפעלתו את הצד של הקלטת עד קרוב לקצה העליון של הצלחת קצר ג'ל הקדמי.
- הכנס מסרק ג'ל נקי לתוך החלק העליון של קלטת ג 'ל,למקם קליפ קלסר על קלטת על מסרק להחזיק אותו במקום. בואו ג'ל לערום לפלמר שעה 1 עד לילה.
4. אחסון ג'ל
- כאשר ג'ל יש מפולמר לגמרי, להסיר את הסרטונים בינדר למקם את הקלטת בנרתיק חום רב סגר פלסטיק או שקית מחדש סגר פלסטיק.
- יוצקים 20 מ"ל של חיץ 1X לערום ג'ל המכיל אזיד הנתרן 0.1% בתוך כיס.
- מחממים לאטום את הכיס עבור 5 שניות כדי לוודא שאין נזילות בתיק.
- לאחסן את הג'ל על 4 ° C.
5. הכנת דוגמאות
- בצינור דק דופן microcentrifuge, מסתכמים μl 6.5 המדגם חלבון, 7.5 μl של חיץ 2x Novex SDS טריס-גליצין המדגם, 1 μl של 100 mM dithiothreitol (DTT) וכן IRG-H 2 O (במקרה הצורך) על הנפח הכולל של μl 15.
- מערבבים את המדגם על ידי vortexing, ובקיצור צנטריפוגות מדגם להביא התוכן לחלק התחתון של הצינור. <li> לפגל את המדגם על 70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
6. הרצת ג'ל
- הגדרת מנגנון ג'ל Novex.
- הוסף 200 מ"ל של חיץ טריס-גליצין ריצה המכיל 500 μl של נוגדי חמצון Nupage לחדר הפנימי, 300 מ"ל של טריס-גליצין הפעלת המאגר אל החדר החיצוני.
- לטעון את דגימות חלבון מפוגל (15 μl) לתוך הבארות באמצעות טעינת ג'ל עצה פיפטה.
- הפעל את הג'ל על V 200 דקות 60-70.
7. מכתים ג'ל
- הסר את הקלטת מן המנגנון ג'ל ולשבור את החותם אפוקסי ידי חטטניות שתי צלחות פלסטיק ג'ל זה מזה באמצעות סכין ג'ל או סכין מרק נוקשה. בזהירות להפריד ג'ל מן הצלחות, נזהרת שלא לקרוע את הג'ל.
- שוטפים את הג'ל עם IRG-H 2 O שלוש פעמים עם תסיסה עדינה.
- כתם ג'ל עם Invitrogen SimplyBlue SafeStain שעה 1 עם תסיסה עדינה.
- יוצקים את הפתרון מכתים וdestain ג'ל עם IRG-H 2 O.
8. ניקוי קלטות
- השתמש מרית מתכת לגרד או לקלף אפוקסי על כל הקלטות, כך שניתן יהיה לעשות בה שימוש חוזר שוב.
- לשטוף את כל הצלחות ג'ל פלסטיק עם פתרון חומר ניקוי עדין, ולשטוף היטב במי ברז לאחר מכן במים מזוקקים.
9. נציג תוצאות
בגלל אפוקסי יהוו חותמת מים חזק, (איור 1), קלטות לא ידלפו כאשר הפתרון acrylamide הוא שפך לתוכם. בנוסף, קלטות הג'ל ניתן לפתוח בקלות כדי לאחזר את הג'ל על מכתים, ו אפוקסי ניתן קילף של הקלטות, כדי לאפשר המשך שימוש חוזר שלהם. כפי שניתן לראות בתרשים 2, ג'ל מראה הפרדה ברורה של סמנים חלבוניים ולהקות מדגם מתאים אלקטרופורזה חלבון שגרתית.
באיור 1. Appliקטיון של אפוקסי לאטום קלטות minigel. בשכבה דקה של אפוקסי מוחל על קצה 1 של הקלטות לקראת האסיפה. כדי להדגיש את אפוקסי, זה היה שקר בצבע אדום בתמונה זו.
איור 2. הפרדת חלבונים על ג'ל SDS-טריס-גליצין מזג באמצעות שימוש חוזר קלטות minigel. SDS-PAGE בוצע כפי שתואר לעיל. אלקטרופורזה הבאה ג'ל הוסרה קלטת minigel, מוכתם ב SimplyBlue SafeStain לפי הוראות היצרן, וצילם באמצעות אור לבן מועבר. ליין M מכיל SeeBlue Plus2 מראש מוכתמים סטנדרטים חלבון. משקל מולקולרי של חלבונים במסלול M מצוינים בצד ימין של ג'ל ב kiloDaltons (KDA). בסמטאות אחרים מראים חלבונים מן lysate פינה מחיידקים המבטאים גלוטתיון-S-transferase (GST), מתויג חלבון. החלבונים הם אלה המוצגים שטף מ glutathione חרוזים שקדמו elution של חלבון GST-מתויג.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ג'ל אלקטרופורזה חלבון היא שיטה הכרחית עבור מעבדות ביולוגיה מולקולרית ביותר. Minigels זמינים מסחרית לספק רמה גבוהה של נוחות, אבל יכול להיות יקר. כאן אנו מראים כיצד לעשות שימוש חוזר בקלטות minigel של המותג הפופולרי של minigels זמינים מסחרית. שיטה זו שומרת על הנוחות של בעל מקור המוכן של ג'ל, אבל בכל חלק של העלות של minigels זמינים מסחרית. צעד מרכזי בהליך זה מיישמת את הסכום הנכון של אפוקסי לחלוטין לאטום את קלטות לפני הוספת acrylamide unpolymerized כדי למנוע דליפה. השתמש אפוקסי רק כי הוא מדורג על פלסטיק, לאפשר מספיק זמן פילמור של אפוקסי כמתואר הוראות היצרן. עבור הוסיף נוחות, קלטות מרובים יכול להיות אטום ומאוחסן לפני לשפוך את הג'לים. כאשר נשפך ג'ל לפתרון, הקפד להשאיר מספיק מקום ג'ל לערום, בדרך כלל על 0.5 ס"מ יותר מאשר בעיצומו של tהוא מסרק רגיל לסגנון הבארות. במהלך פילמור של ג'ל לפתרון, לשמור על ג'ל כזה זקוף, כי המאגר רווי 1-butanol יהוו משטח ישר, שטוח להקים על החלק העליון של ג'ל לפתרון. אם הג'ל אינו לפלמר בתוך 30 דקות, בסך של APS 10% ו TEMED ניתן להעלות. לאחר ג'ל ישלים את פעולתו, חשוב בזהירות לשבור את החותם אפוקסי, כדי למנוע קריעה ג'ל דק. שיטת דיווח כאן מחדש באמצעות קלטות ג'ל מסחריים יכול לחסוך בעלויות משמעותיות הקשורות לשימוש SDS-PAGE תכופים. קלטות אותן ניתן לעשות בה שימוש חוזר במשך שנים ואין לנו ראיות כי שימוש חוזר של קלטות זאת מפחית את השימושיות שלהם. בנוסף, מספר רב של ג'ל ניתן להכין ולאחסן במשך שבועות שקית מחסום פוליאסטר המכיל כמות קטנה של ג'ל חיץ 1X לערום המכיל נתרן אזיד 0.1%.
קיצורים:
Dithiothreitol (DTT), N, N, N ', נ',-tetramethylethylenediamine (טEMED), הקלד אני מגיב מים כיתה (IRG-H2O), persulfate ammounium (APS), נתרן גופרתי dodecyl (SDS), טריס (hydroxymethyl) aminomethane (טריס בסיס), N, ללהקת מתילן-BIS-acrylamide (BIS -acrylamide)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
המחברים מודים הווארד יוז רפואי במכון למדע UF לפרס החיים על AH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Invitrogen Nupage Novex Minigel Cassette (1.0 mm) | Invitrogen | NC2010 | Available in 2, 5, 10, 12, 15 and 2D wells |
| Plastic Epoxy | Loctite | 108771 | |
| Electrical Tape | Scotch Co. | ||
| 125 mL side arm flask | Pyrex | 5360 | |
| 4X Tris-Base resolving gel buffer | 1.5 M Tris-base pH 8.7 | ||
| acrylamide | Fisher Scientific | 01065-500 | |
| Bis-acrylamide | MP Biomedicals | 800173 | |
| 30.8% acrylamide solution | 30:0.8 acrylamide: bis-acrylamide in IRG-H2O | ||
| 10% APS | Fisher Scientific | BP179-25 | 0.1 g ammonium persulfate in 1 ml IRG-H2O, prepared immediately before use |
| TEMED | Acros Organics | 138450500 | |
| 1-butanol saturated with 1X resolving gel buffer | 5:2 1-butanol to 1X resolving gel buffer | ||
| 4X Tris-Base stacking gel buffer | 1.5 M Tris-base pH 6.8 | ||
| Gel comb | Invitrogen | NC3015 | 15 well, 1.0 mm thickness |
| Impulse Sealer | TEW Electric Heating Equipment | ||
| Heat Sealable Pouch | Kapak/Scotchpak | 1 pint size (6.5" x 8") | |
| Gel storage buffer | 1X stacking gel buffer with 0.1% sodium azide | ||
| Novex SDS Tris-Glycine sample buffer (2X) | Invitrogen | LC2676 | |
| DTT | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| 10X Tris-Gylcine Running buffer | Invitrogen | LC2675 | 1L of 10X stock: 29.0 g Tris-Base, 144.0 g Glycine, 10.0 g SDS |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | |
| Gel Knife | Invitrogen | EI9010 | |
| SimplyBlue Safe Stain | Invitrogen | LC6065 |
References
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Raymond, S., Weintraub, L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis. Science. 130, 711-711 (1959).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem. Biophys. Res. Commun. 28, 815-820 (1967).
