Summary
Vår protokoll demonstrerer hvordan du helle flere protein geler gangen ved gjenvinning Invitrogen Nupage Novex minigel kassetter og billige materialer kjøpt på et hjem forbedring butikken. Dette økonomiske og strømlinjeformet metode inkluderer en måte å lagre gels ved 4 ° C i noen uker. Ved gjenbruk av plast gel kassettene fra kommersielt tilgjengelige geleer, laboratorier som kjører hyppige protein geler kan spare betydelige kostnader og hjelpe miljøet.
Abstract
Evalueringen av proteiner ved hjelp av natrium dodecyl sulfat polyakrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) analyse er en vanlig teknikk som brukes av biokjemi og molekylærbiologi forskere 1-4. For laboratorier som utfører daglige analyser av proteiner, kan kostnadene for kommersielt tilgjengelige polyakrylamid geler (~ $ 10/gel) være betydelig over tid. Å redusere denne kostnaden, noen forskere utarbeider sine egne polyakrylamid geler. Tradisjonelle metoder for å helle disse gels typisk utnytte spesialisert utstyr og glass gel plater som kan være dyrt og utelukker helle mange geleer og lagre dem til senere bruk. Videre kan håndtering av glassplater under rengjøring eller gel helle resultere i utilsiktet brudd skape en sikkerhetsrisiko, som kan utelukke bruken i undergraduate laboratoriet klasser. Vår protokoll demonstrerer hvordan du helle flere protein geler samtidig ved gjenvinning Invitrogen Nupage Novex minigel kassetter, og billig materials kjøpt på et hjem forbedring butikken. Dette økonomiske og strømlinjeformet metode inkluderer en måte å lagre gels ved 4 ° C i noen uker. Ved gjenbruk av plast gel kassettene fra kommersielt tilgjengelige geleer, laboratorier som kjører hyppige protein geler kan spare betydelige kostnader og hjelpe miljøet. I tillegg plast gele kassetter er ekstremt motstandsdyktig mot brudd, noe som gjør dem ideelle for undervisning laboratoriet klasserom.
Protocol
1. Klargjøre kassetter
- Clean foran og bak plater av en brukt Invitrogen Nupage Novex minigel kassett eller annen kommersiell minigel kassett.
- Forbered ca 1-3 ml av plast epoxy og bland godt i henhold til produsentens anvisninger.
- Påfør epoxy på innsiden kanten av frontplaten, der de to platene kommer i kontakt når kassetten settes sammen.
- Skyv et stykke filter papir eller papp gjennom bunnen splitten av bakplaten ved montering av kassetten for å hindre overflødig epoxy fra forsegle åpningen. Fjern filteret papiret så snart de to platene er montert.
- Plasser ringperm klipp langs kantene for en tett forsegling, og la kassettene sitte over natten for epoxy til fullt kurere.
- Tett spalten på undersiden av bakplaten med elektrisk tape.
2. Helle løse gel
- Til en 125 ml side arm kolbe, legge til følgende:2,25 ml 4X Tris-Base Resolving gel buffer 8,70 pH, 3,50 ml på 30,8% akrylamid / bisacrylamide, 3,25 ml av type I reagens karakter vann (IRG-H 2 O) for et totalt volum på 9 ml.
- De-gass løsningen i 10 min ved å feste siden arm av kolben til et vakuum apparat, og plassere en invertert propp på toppen av kolben.
- Overfør 9 ml de-gasset løsning til en 50 ml disponibel polypropylen sentrifugerør og legge 30 mL 10% ammounium persulfate (APS) og 6 mL av N, N, N ', N',-tetramethylethylenediamine (TEMED) og bland godt ved å svinge løsningen for å unngå innføring av bobler.
- Umiddelbart helle løsningen i kassetten, slik at det å kjøre ned på siden av kassetten for å forhindre eventuelle bobler dannes mellom de gel platene. Fyll kassetten til ca 2 cm fra øvre kant av fronten (kortere) plate.
- Tilsett 0,5 ml av 1-butanol mettet med 1X løse gel buffer og la gelen polymerisere for entime.
3. Helle stabling gel
- Legg til følgende i en 125 ml side arm kolbe: 0,75 ml 4X Tris-Base Stacking gel buffer pH 6,80, 0,40 ml på 30,8% akrylamid / bisacrylamide, 1,85 ml IRG-H 2 O for et totalt volum på 3 ml.
- De-gass løsningen for 10 min som beskrevet i trinn 2.
- Mens stabling gel løsningen er avgassing, hell av 1-butanol mettet med 1X Resolving gel buffer fra toppen av løse gel. Skyll toppen av løse gel gang med IRG-H 2 O. Hell av vannet og bruk en bibulous eller Whatman filter papir til å absorbere eventuell gjenværende væske.
- Fjern 3 ml av din avgasset løsning og legge 9 mL 10% APS og 2 mL av TEMED og bland godt.
- Raskt hell løsningen i kassetten, slik at det å kjøre ned på siden av kassetten til den er nær øvre kant av kortere front gel plate.
- Sett en ren gel kam i toppen av gel kassetten,Plasser en perm klipp på kassetten over kammen for å holde den på plass. La stabling gel polymerisere i 1 time til natten.
4. Lagring av gel
- Når geleen er helt polymerisert, fjerner permen klipp og plasser kassetten i en varme-lukkbar plast posen, eller en re-plastpose som kan lukkes.
- Hell 20 ml 1X stabling gel buffer som inneholder 0,1% natriumazid inn i posen.
- Varm forsegle posen i 5 sek, og sørge for at det ikke er noen lekkasjer i posen.
- Oppbevar gel ved 4 ° C.
5. Forbereder prøvene
- I en tynnvegget mikrosentrifuge rør, legge opp til 6,5 mL av protein prøven, 7,5 mL av 2x Novex Tris-Glycine SDS sample buffer, en mL av 100 mm ditiotreitol (DTT) og IRG-H 2 O (hvis nødvendig) for en Totalt volum 15 mL.
- Bland prøven ved virvling, og kort sentrifuger prøven å bringe innhold til bunnen av røret. <li> denature prøven ved 70 ° C i 10 min.
6. Kjøre gel
- Sett opp Novex gel apparatet.
- Tilsett 200 ml Tris-Glycine Running buffer som inneholder 500 mL av Nupage antioksidant til den indre kammeret, og 300 ml Tris-Glycine Running buffer til ytre kammeret.
- Legg i denaturert protein prøvene (15 mL) inn i brønner ved hjelp av en gel lasting pipette tips.
- Kjør gel på 200 V for 60-70 min.
7. Farging av gel
- Fjern kassetten fra gelen apparater og bryte epoxy forseglingen ved å løsne de to plast gel platene fra hverandre med en gel kniv eller en stiv sparkel. Forsiktig skille gel fra platene, ta vare å ikke rive gel.
- Skyll gel med IRG-H 2 O tre ganger med forsiktig omrøring.
- Flekk gelen med Invitrogen SimplyBlue SafeStain for en time med forsiktig omrøring.
- Hell av Farging løsningen ogdestain gelen med IRG-H 2 O.
8. Rengjøring av kassettene
- Bruk en slikkepott metall til skrape eller skrelle bort all den epoxy på kassettene slik at de kan gjenbrukes igjen.
- Vask hver av plast gel platene med mildt såpevann, og skyll godt med vann fra springen etterfulgt av destillert vann.
9. Representative Resultater
Fordi epoxy vil danne en vanntett forsegling, (figur 1), vil kassettene ikke lekke når akrylamid løsningen helles i dem. I tillegg kan gelen kassettene være lett å åpne for å hente gel til farging, og epoxy kan skrelles ut av kassettene for å tillate deres fortsatte gjenbruk. Som vist i figur 2, viser gel klart skille protein markører og utvalg band som egner seg for rutinemessig protein elektroforese.
Figur 1. Søkeresering av epoxy til å forsegle minigel kassetter. Et tynt lag med epoxy påføres til kanten av en av kassettene før montering. For å markere epoxy, var det falsk-farget rød i dette bildet.
Figur 2. Separasjon av proteiner på en SDS-Tris-glycine gel helte hjelp gjenbrukes minigel kassetter. SDS-PAGE ble utført som beskrevet ovenfor. Etter elektroforese gel ble fjernet fra minigel kassett, beiset i SimplyBlue SafeStain som per produsentens instruksjoner, og fotografert ved hjelp overført hvitt lys. Lane M inneholder SeeBlue Plus2 pre-fargede protein standarder. De molekylære vekter på proteiner i kjørefeltet M indikeres på høyre side av gel i kilodaltons (KDA). De andre kjørefelt viser proteiner fra en ryddet lysate fra bakterier som uttrykker en glutation-S-transferase (GST)-merket protein. De proteinene som vises er de som vaskes av glutathione perler før eluering av GST-tagget protein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protein elektroforese er en uunnværlig metode for de fleste molekylærbiologiske laboratorier. Kommersielt tilgjengelige minigels gi en høy grad av brukervennlighet, men kan være kostbart. Her viser vi hvordan du gjenbruke de minigel kassettene fra en populær merkevare av kommersielt tilgjengelige minigels. Denne metoden beholder bekvemmeligheten av å ha et ferdig kilde gels, men til en brøkdel av prisen av kommersielt tilgjengelige minigels. Et viktig steg i denne prosedyren er å bruke riktig mengde epoxy å fullstendig forsegle kassettene før du legger den unpolymerized acrylamide å hindre lekkasje. Bruk bare epoxy som er vurdert for plast, og la nok tid til polymerisasjon av epoxy som beskrevet i produsentens anvisninger. For ekstra komfort, kan flere kassetter være forseglet og lagret før helle gels. Når helle løse gel, sørg for å være nok plass for stabling gel, vanligvis ca 0,5 cm mer enn høyden på than kam brukes til å danne brønnene. Under polymerisering av løse gel, holde gel oppreist slik at bufferen-mettet 1-butanol vil danne en rett, flat overflate for å dannes på toppen av løse gel. Hvis gelen ikke polymerisere innen 30 min, kan beløpet på 10% APS og TEMED økes. Når geleen er ferdig, er det viktig å nøye bryte epoxy forseglingen å hindre ripping den tynne gel. Metoden rapporteres her for gjenbruk kommersielle gel kassetter kan spare betydelige kostnader forbundet med hyppige SDS-PAGE bruk. De samme kassettene kan gjenbrukes i mange år og vi har ingen bevis for at gjentatt bruk av samme kassetten reduserer deres anvendelighet. I tillegg kan flere geler være forberedt og lagres i flere uker i en polyester barriere film bag som inneholder en liten mengde av 1X stabling gel buffer som inneholder 0,1% natriumazid.
Forkortelser:
Ditiotreitol (DTT), N, N, N ', N',-tetramethylethylenediamine (TEMED), Type I reagensen karakter vann (IRG-H2O), ammounium persulfate (APS), natrium dodecyl sulfat (SDS), Tris (hydroksymetyl) aminometan (Tris-base), N, N'-Methylene-bis-akrylamid (bis -akrylamid)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne takker Howard Hughes Medical Institute for en UF Science for Life pris til AH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Invitrogen Nupage Novex Minigel Cassette (1.0 mm) | Invitrogen | NC2010 | Available in 2, 5, 10, 12, 15 and 2D wells |
| Plastic Epoxy | Loctite | 108771 | |
| Electrical Tape | Scotch Co. | ||
| 125 mL side arm flask | Pyrex | 5360 | |
| 4X Tris-Base resolving gel buffer | 1.5 M Tris-base pH 8.7 | ||
| acrylamide | Fisher Scientific | 01065-500 | |
| Bis-acrylamide | MP Biomedicals | 800173 | |
| 30.8% acrylamide solution | 30:0.8 acrylamide: bis-acrylamide in IRG-H2O | ||
| 10% APS | Fisher Scientific | BP179-25 | 0.1 g ammonium persulfate in 1 ml IRG-H2O, prepared immediately before use |
| TEMED | Acros Organics | 138450500 | |
| 1-butanol saturated with 1X resolving gel buffer | 5:2 1-butanol to 1X resolving gel buffer | ||
| 4X Tris-Base stacking gel buffer | 1.5 M Tris-base pH 6.8 | ||
| Gel comb | Invitrogen | NC3015 | 15 well, 1.0 mm thickness |
| Impulse Sealer | TEW Electric Heating Equipment | ||
| Heat Sealable Pouch | Kapak/Scotchpak | 1 pint size (6.5" x 8") | |
| Gel storage buffer | 1X stacking gel buffer with 0.1% sodium azide | ||
| Novex SDS Tris-Glycine sample buffer (2X) | Invitrogen | LC2676 | |
| DTT | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| 10X Tris-Gylcine Running buffer | Invitrogen | LC2675 | 1L of 10X stock: 29.0 g Tris-Base, 144.0 g Glycine, 10.0 g SDS |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | |
| Gel Knife | Invitrogen | EI9010 | |
| SimplyBlue Safe Stain | Invitrogen | LC6065 |
References
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Raymond, S., Weintraub, L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis. Science. 130, 711-711 (1959).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem. Biophys. Res. Commun. 28, 815-820 (1967).
