Summary
Наш протокол свидетельствует о том, как влить несколько гелей белка на время переработки Invitrogen Nupage Novex кассеты minigel и недорогие материалы, приобретенные в магазине товаров для дома. Этот экономичный и упорядочить метод включает в себя способ хранения гели при температуре 4 ° С в течение нескольких недель. По повторное использование пластиковых кассет геля из имеющихся в продаже гели, лабораторий, которые работают часто гели белков может существенно сэкономить затраты и помочь окружающей среде.
Abstract
Оценка белков с использованием додецилсульфата натрия полиакриламидном геле (SDS-PAGE) анализ общих техника, используемая биохимии и молекулярной биологии исследователи 1-4. Для лабораторий, которые выполняют ежедневный анализ белков, стоимость коммерчески доступных полиакриламидном геле (~ $ 10/gel) может быть значительным с течением времени. Для снижения этой стоимости, некоторые исследователи готовят свои гели полиакриламида. Традиционные методы заливки этих гелей обычно используют специализированное оборудование и стеклянные пластины геля, который может быть дорогим и исключает многие заливки гелей и хранить их для дальнейшего использования. Кроме того, обработка стеклянных пластин во время чистки или гель заливка может привести к случайной поломки создании угрозы безопасности, которые могут препятствовать их использованию для студентов лабораторные занятия. Наш протокол свидетельствует о том, как влить несколько гелей белков одновременно по переработке Invitrogen Nupage Novex кассеты minigel и недорогой маterials приобрести в магазине товаров для дома. Этот экономичный и упорядочить метод включает в себя способ хранения гели при температуре 4 ° С в течение нескольких недель. По повторное использование пластиковых кассет геля из имеющихся в продаже гели, лабораторий, которые работают часто гели белков может существенно сэкономить затраты и помочь окружающей среде. Кроме того, пластиковые кассеты гель чрезвычайно устойчивы к разрушению, что делает их идеальными для студентов классах лаборатории.
Protocol
1. Подготовка кассеты
- Чистая передняя и задняя пластины использовали Invitrogen Nupage Novex minigel кассету или другие коммерческие кассеты minigel.
- Подготовка примерно 1-3 мл пластиковых эпоксидных и хорошо перемешать в соответствии с инструкциями производителя.
- Применение эпоксидных к внутренней кромке передней панели, где две тарелки будет вступать в контакт, когда кассета собирается.
- Вставьте кусок фильтровальной бумаги или картона через нижнюю щель задней панели при сборке кассеты для предотвращения чрезмерного эпоксидной от герметизации проема. Удалить фильтровальной бумаги, как только две пластины собираются.
- Установите зажимы по краям для уплотнения, а кассеты на ночь для эпоксидных, чтобы полностью вылечить.
- Печать щель в нижней части задней панели с помощью изоленты.
2. Заливка решения гель
- В 125 мл колбу рукой стороны, добавим следующее:2,25 мл Трис-4X базы Разрешая гель буфер рН 8,70, 3,50 мл 30,8% акриламид / бисакриламид, 3,25 мл реагента типа I класса вод (IRG-H 2 O) на общий объем 9 мл.
- Де-газ решение в течение 10 минут путем присоединения стороне руки колбу с вакуумным аппаратом, а также размещение перевернутую пробку в верхней части колбы.
- Передача 9 мл дегазированным решение 50 мл одноразовые трубки центрифуги полипропилена и добавить 30 мкл 10% ammounium персульфат (APS) и 6 мкл N, N, N ', N',-тетраметилэтилендиамина (TEMED) и смеси хорошо закрученного решение, чтобы избежать введения пузыри.
- Сразу залить раствор в кассету, что позволяет запускать вниз сторона кассеты для предотвращения пузырей между гелем пластин. Заполните кассеты примерно в 2 см от верхнего края передней (более короткой) пластины.
- Аккуратно добавить 0,5 мл 1-бутанола насыщенный 1X решения гель буфера и пусть гель полимеризуется в течение 1час.
3. Заливка концентрирующий гель
- Добавьте следующие строки в 125 мл колбу стороне руки: 0.75 мл Трис-4X базы Укладка рН гель буфер 6,80, 0,40 мл 30,8% акриламид / бисакриламид, 1,85 мл IRG-H 2 O на общий объем 3 мл.
- Де-газ решение в течение 10 мин, как описано в шаге 2.
- Несмотря на то, концентрирующий гель решение дегазации, слить 1-бутанол насыщенный 1X разрешающей гель буфер из верхней части решения геля. Промыть в верхней части решения гель один раз с IRG-H 2 O. Слейте воду и использовать впитывающий влагу или ватмана фильтровальную бумагу, чтобы поглотить оставшуюся жидкость.
- Удалить 3 мл дегазированной вашего решения и добавляют 9 мкл 10% АЭС и 2 мкл TEMED и хорошо перемешать.
- Быстро влейте раствор в кассету, что позволяет запускать вниз сторона кассеты, пока она находится вблизи верхнего края пластины геля короче передних.
- Вставьте чистый гребень гель в верхней части геля кассеты,разместить связующим клип на кассете на гребень, чтобы удерживать его на месте. Пусть концентрирующий гель полимеризуется в течение 1 часа ночи.
4. Хранение геля
- Когда гель полностью полимеризуется, удалите зажимы и положите кассету в жару закрывающийся пластиковый пакет или закрывающемся полиэтиленовом пакете.
- Налейте 20 мл 1X концентрирующий гель буфер, который содержит 0,1% азида натрия в сумке.
- Термосварки сумке в течение 5 секунд и убедиться в отсутствии течи в сумке.
- Храните гель при температуре 4 ° C.
5. Подготовка образцов
- В тонкостенных труб микроцентрифужных, добавить до 6,5 мкл образца белка, 7,5 мкл 2x Novex Трис-Глицин SDS образец буфера, 1 мкл 100 мМ ДТТ (DTT) и IRG-H 2 O (при необходимости) Общий объем 15 мкл.
- Смешать образца встряхивая, и кратко центрифуги образца привести содержимое в нижней части трубы. <LI> денатурации образцов при температуре 70 ° С в течение 10 мин.
6. Запуск гель
- Настройка аппарата Novex геля.
- Добавить 200 мл Трис-Глицин Running буфер, который содержит 500 мкл Nupage антиоксидант для внутренней камеры и 300 мл Трис-Глицин Запуск буфер внешней камеры.
- Загрузите денатурированные образцы белка (15 мкл) в лунки помощью геля загрузки пипетки.
- Запустите геля при 200 В на 60-70 мин.
7. Окрашивание геля
- Извлеките кассету из геля аппарат и сломать эпоксидной печатью любопытных две пластиковые пластины геля кроме ножом гель или жесткий шпатель. Осторожно отделите гель от тарелки, стараясь не оторвать геля.
- Промойте гель с IRG-H 2 O в три раза с нежным агитации.
- Пятно гель с Invitrogen SimplyBlue SafeStain в течение 1 часа с нежным агитации.
- Вылейте раствор и окрашиваниеdestain гель с IRG-H 2 O.
8. Очистка кассеты
- С помощью металлического шпателя, чтобы очистить или снимите все эпоксидной на кассетах, таким образом они могут быть использованы снова.
- Промыть каждую из пластиковых пластин гель с мягким моющим средством, и хорошо промыть водопроводной водой, затем дистиллированной водой.
9. Представитель Результаты
Поскольку эпоксидные образуют водонепроницаемое уплотнение (рис. 1), кассеты, не будет течь, когда акриламид раствор выливают в них. Кроме того, гель кассеты можно легко открыть, чтобы получить гель для окрашивания, а также эпоксидных может быть снята с кассет, чтобы их дальнейшего повторного использования. Как показано на рисунке 2, гель показывает четкое разделение белковых маркеров и образец полосы подходят для рутинных электрофорез белков.
Рисунок 1. Appliкатион эпоксидных, чтобы запечатать minigel кассет. тонкий слой эпоксидной применяется к краю одной из кассет до сборки. Чтобы выделить эпоксидную смолу, она была ложно-красного цвета в этот образ.
Рисунок 2. Разделение белков на SDS-Трис-глицин гель заливается использованием повторно использовать minigel кассет. SDS-PAGE проводили, как описано выше. После электрофореза гель был удален из minigel кассеты, окрашенные в SimplyBlue SafeStain в соответствии с инструкциями производителя, и сфотографировали использованием переданных белый свет. Лейн M содержит SeeBlue Plus2 предварительно окрашенных стандартам белка. Молекулярный вес белка в полосе М указаны на правой стороне гель кДа (кДа). Другие полосы показывают белки от разрешенного лизат из бактерий выражения глутатион-S-трансферазы (GST), помеченные белка. Белки представляют собой показатели, отмывали от гlutathione бисер перед элюирования GST с метками белка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Электрофорез белков гель является незаменимым методом для большинства лабораторий молекулярной биологии. Коммерчески доступные minigels обеспечивают высокий уровень удобства, но может быть дорогостоящим. Здесь мы покажем, как повторное использование minigel кассет с популярной маркой коммерчески доступных minigels. Этот метод сохраняет удобен тем, что готовый источник гели, но на долю от стоимости имеющихся в продаже minigels. Ключевым шагом в этой процедуре применения необходимого количества эпоксидной полностью запечатать кассеты перед добавлением Неполимеризованные акриламида для предотвращения утечки. Используйте только эпоксидные, которая рассчитана на пластик, и обеспечить достаточное время для полимеризации эпоксидного, как описано в инструкции производителя. Для дополнительного удобства, несколько кассет может быть опломбирована и хранится до заливки гелей. При заливке решения гель, не забудьте оставить достаточно места для наложения геля, как правило, примерно на 0,5 см больше, чем высота тОн гребень используется для формирования скважин. Во время полимеризации геля решения, держать гель вертикально так, чтобы буфер насыщенных 1-бутанол образуют прямой, ровной поверхности, чтобы сформировать в верхней части решения геля. Если гель не полимеризоваться в течение 30 мин, в размере 10% APS и TEMED может быть увеличена. Как только гель завершения работы, важно тщательно разорвать эпоксидной уплотнение для предотвращения копирования тонких гель. Метод сообщил здесь повторного использования коммерческих кассеты гель может сэкономить значительные расходы, связанные с частыми SDS-PAGE использования. То же кассеты можно использовать повторно в течение многих лет и у нас нет доказательств того, что многократное использование одного и того же кассеты снижает их практичность. Кроме того, несколько гели могут быть подготовлены и хранятся в течение недели в полиэфирной пленки барьер пакет, содержащий небольшое количество геля 1X укладки буфера, содержащего 0,1% азида натрия.
Сокращения:
ДТТ (DTT), N, N, N ', N',-тетраметилэтилендиамина (TEmed), тип I хч воды (IRG-H2O), ammounium персульфат (APS), додецилсульфата натрия (SDS), трис (гидроксиметил) аминометан (Трис-основание), N, N-метилен-бис-акриламид (бис -акриламид)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы благодарят Медицинского института Говарда Хьюза для UF науки для жизни награду AH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Invitrogen Nupage Novex Minigel Cassette (1.0 mm) | Invitrogen | NC2010 | Available in 2, 5, 10, 12, 15 and 2D wells |
| Plastic Epoxy | Loctite | 108771 | |
| Electrical Tape | Scotch Co. | ||
| 125 mL side arm flask | Pyrex | 5360 | |
| 4X Tris-Base resolving gel buffer | 1.5 M Tris-base pH 8.7 | ||
| acrylamide | Fisher Scientific | 01065-500 | |
| Bis-acrylamide | MP Biomedicals | 800173 | |
| 30.8% acrylamide solution | 30:0.8 acrylamide: bis-acrylamide in IRG-H2O | ||
| 10% APS | Fisher Scientific | BP179-25 | 0.1 g ammonium persulfate in 1 ml IRG-H2O, prepared immediately before use |
| TEMED | Acros Organics | 138450500 | |
| 1-butanol saturated with 1X resolving gel buffer | 5:2 1-butanol to 1X resolving gel buffer | ||
| 4X Tris-Base stacking gel buffer | 1.5 M Tris-base pH 6.8 | ||
| Gel comb | Invitrogen | NC3015 | 15 well, 1.0 mm thickness |
| Impulse Sealer | TEW Electric Heating Equipment | ||
| Heat Sealable Pouch | Kapak/Scotchpak | 1 pint size (6.5" x 8") | |
| Gel storage buffer | 1X stacking gel buffer with 0.1% sodium azide | ||
| Novex SDS Tris-Glycine sample buffer (2X) | Invitrogen | LC2676 | |
| DTT | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| 10X Tris-Gylcine Running buffer | Invitrogen | LC2675 | 1L of 10X stock: 29.0 g Tris-Base, 144.0 g Glycine, 10.0 g SDS |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | |
| Gel Knife | Invitrogen | EI9010 | |
| SimplyBlue Safe Stain | Invitrogen | LC6065 |
References
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Raymond, S., Weintraub, L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis. Science. 130, 711-711 (1959).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem. Biophys. Res. Commun. 28, 815-820 (1967).
