Summary
Vår protokoll visar hur man hälla flera proteingeler i taget genom återvinning Invitrogen NuPAGE Novex minigel kassetter och billig utrustning som köps in på ett hem förbättring butik. Denna ekonomiska och strömlinjeformade metoden innefattar ett sätt att lagra gelerna vid 4 ° C under några veckor. Genom att återanvända plast gel kassetterna från kommersiellt tillgängliga geler, laborationer som kör ofta proteingeler kan spara betydande kostnader och hjälpa miljön.
Abstract
Utvärderingen av proteiner med användning av natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE)-analys är en vanlig teknik som används av biokemi och molekylär biologi forskare 1-4. För laboratorier som utför dagliga analyser av proteiner, kan kostnaden för kommersiellt tillgängliga polyakrylamidgeler (~ $ 10/gel) vara avsevärt över tiden. För att minska denna kostnad, vissa forskare laga sin egen polyakrylamidgeler. Traditionella metoder för att hälla dessa geler använder oftast specialutrustning och glasskivor gel som kan vara dyrt och utesluter hälla många geler och lagra dem för framtida bruk. Dessutom kan hantering av glasskivor under rengöring eller gel hälla resultera i oavsiktlig brott att skapa en säkerhetsrisk, vilket kan förhindra deras användning i grundutbildningen laboratorium klasser. Vår protokoll visar hur man hälla flera proteingeler samtidigt genom återvinning Invitrogen NuPAGE Novex minigel kassetter, och billig MAterial köpas ett hem förbättring butik. Denna ekonomiska och strömlinjeformade metoden innefattar ett sätt att lagra gelerna vid 4 ° C under några veckor. Genom att återanvända plast gel kassetterna från kommersiellt tillgängliga geler, laborationer som kör ofta proteingeler kan spara betydande kostnader och hjälpa miljön. Dessutom, plast gel kassetter är extremt resistenta mot brott, vilket gör dem idealiska för grundutbildningen laboratorium klassrum.
Protocol
1. Förbereda kassetterna
- Ren fram och bak plattor av en begagnad Invitrogen NuPAGE Novex minigel kassett eller annan kommersiell minigel kassett.
- Förbered cirka 1-3 ml av plast epoxi och blanda väl enligt tillverkarens instruktioner.
- Applicera epoxi till den inre kanten av den främre plattan, där de två plattorna kommer att komma i kontakt när kassetten är monterad.
- Glida ett stycke filterpapper eller kartong genom botten slitsen i den bakre plattan vid montering av kassetten för att förhindra överflödigt lim täta öppningen. Avlägsna filterpapper så snart som de två plattorna är hopmonterade.
- Placera bindemedel klipp längs kanterna för en tät förslutning, och låt kassetterna sitter över natten för epoxin att helt bota.
- Försegla öppningen på botten av den bakre plattan med eltejp.
2. Häller lösa gelen
- Till en 125 ml sidoarm, tillsätt följande:2,25 ml av 4X tris bas upplösande gel, pH 8,70, 3,50 ml 30,8% akrylamid / bisakrylamid, 3,25 ml typ I reagenskvalitet vatten (IRG-H2O) under en total volym av 9 ml.
- Avgasa lösningen under 10 minuter genom att fästa sidoarm av kolven till en vakuumapparat, och placera en inverterad propp på toppen av kolven.
- Överföra 9 ml avgasad lösning till en 50 ml engångs polypropylen centrifugrör och tillsätt 30 pl av 10% ammounium persulfat (APS) och 6 pl N, N, N ', N',-tetrametyletylendiamin (TEMED) och blanda väl genom att snurra en lösning för att undvika bubblor.
- Omedelbart häll lösningen i kassetten, låter det gå ner på sidan av kassetten för att förhindra att bubblor bildas mellan gel plattorna. Fylla kassetten till ca 2 cm från den övre kanten av den främre (kortare) platta.
- Tillsätt försiktigt 0,5 ml 1-butanol mättad med 1X upplösande gel-buffert och låta gelén polymerisera under 1timme.
3. Häller stackgelen
- Följande tillägg till en 125 ml sidoarm kolv: 0,75 ml 4X tris bas stackgelen, pH 6,80, 0,40 ml 30,8% akrylamid / bisakrylamid, 1,85 ml IRG-H2O till en total volym av 3 ml.
- Avgasa lösningen under 10 min såsom beskrivet i steg 2.
- Medan den staplande gelén lösningen avgasa, häll ut på 1-butanol mättad med 1X upplösande gel buffert från toppen av den upplösande gelén. Skölj toppen av den upplösande gelén en gång med IRG-H 2 O Hälla av vattnet och använda en uppsugande eller Whatman filterpapper för att absorbera eventuell kvarvarande vätska.
- Ta 3 ml av din avgasad lösning och tillsätt 9 pl 10% APS och 2 pl TEMED och blanda väl.
- Snabbt häll lösningen i kassetten, låter det gå ner sidan av kassetten tills den är nära den övre kanten av det kortare framtill gelplattan.
- Sätt en ren gel kam i toppen av gelén kassetten,Placera en bindemedel klipp på kassetten över kammen för att hålla den på plats. Låta den staplande gelén polymerisera under 1 timme till över natten.
4. Förvaring av gelen
- När gelén fullständigt har polymeriserats, avlägsna bindemedel klipp och placera kassetten i en värme-förseglingsbar plastpåse, eller en återförslutningsbar påse.
- Häll 20 ml 1X stackgelen buffert som innehåller 0,1% natriumazid i påsen.
- Värm försegla påsen i 5 sek och kontrollera att det inte finns några läckor i påsen.
- Lagra gel vid 4 ° C.
5. Förbereda prover
- I en tunnväggig mikrocentrifugrör, lägga upp till 6,5 | il av proteinprovet, 7,5 pl av 2x Novex Tris-glycin SDS-provbuffert, 1 pl 100 mM ditiotreitol (DTT) och IRG-H2O (om nödvändigt) för en total volym av 15 | il.
- Blanda provet genom virvling, och i korthet centrifugeras provet för att bringa innehållet till rörets botten. <li> Denaturera provet vid 70 ° C under 10 minuter.
6. Köra gelen
- Sätt upp Novex gelen apparaten.
- Tillsätt 200 ml Tris-Glycin kömingsbuffert som innehåller 500 | il av NuPAGE antioxidant till den inre kammaren, och 300 ml Tris-Glycin Elueringsbuffert till den yttre kammaren.
- Ladda det denaturerade proteinet prover (15 | il) till brunnarna med hjälp av en gel loading pipettspets.
- Kör gelen vid 200 V under 60-70 min.
7. Färgning av gelén
- Ta ur kassetten ur gelén apparaten och bryta epoxi förseglingen genom att bända de två plast gelplattorna isär med hjälp av en gel kniv eller en styv spackel. Försiktigt separera gelen från plattorna, se till att inte riva gel.
- Skölj gelén med IRG-H2O tre gånger med försiktig omrörning.
- Färgas gelén med Invitrogen SimplyBlue SafeStain under 1 timme med varsam omrörning.
- Häll av färglösningen ochavfärgning av gelén med IRG-H 2 O
8. Rengöring av kassetterna
- Använda en metallspatel att skrapa eller skalas av all epoxi på kassetterna, så att de kan återanvändas på nytt.
- Tvätta vart och ett av plast gel plattorna med milt rengöringsmedel och skölj väl med kranvatten och därefter destillerat vatten.
9. Representativa resultat
Eftersom epoxi bildar en vattentät tätning, (figur 1) kommer kassetterna inte läcka när akrylamid lösningen hälles i dem. Dessutom kan gelén kassetterna kan lätt öppnas för att hämta gelén för färgning, och epoxi kan skalas av kassetterna att tillåta fortsatt återanvändning. Såsom visas i figur 2, visar att gelén klar separation av protein-markörer, band prov som är lämpliga för rutinmässig proteinelektrofores.
Figur 1. Ansökan omning av epoxi för att täta minigel kassetter. Ett tunt skikt av epoxi anbringas på kanten av en av kassetterna före montering. För att markera epoxi, det var falskt färgat rött i denna bild.
Figur 2. Separation av proteinerna på en SDS-tris-glycin-gel med användning av hälldes återanvändas minigel kassetter. SDS-PAGE utfördes såsom beskrivits ovan. Efter elektrofores gelén bort från minigel kassett, betsad SimplyBlue SafeStain enligt tillverkarens anvisningar och fotograferades med överförda vitt ljus. Rad M innehåller SeeBlue Plus2 förfärgade proteinstandarder. Molekylvikterna hos proteinerna i spår M är indikerade på den högra sidan av gelén i kilodalton (kDa). De andra banorna visar proteiner från ett klarnat lysat från bakterier som uttrycker en glutation-S-transferas (GST)-märkt protein. De visade proteiner är de tvättas bort från glutathione pärlor före eluering av GST-märkt protein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protein gelelektrofores är ett oumbärligt sätt för de flesta molekylärbiologiska laboratorier. Kommersiellt tillgängliga minigeler ge en hög nivå av bekvämlighet, men kan bli kostsamt. Här visar vi hur man återanvända minigel kassetter från ett populärt märke av kommersiellt tillgängliga minigeler. Denna metod behåller bekvämligheten med att ha en färdig källa geler, men till en bråkdel av kostnaden för kommersiellt tillgängliga minigeler. Ett nyckelsteg i denna procedur är att tillämpa den korrekta mängden epoxi för att fullständigt tillsluta kassetterna före tillsats av opolymeriserade akrylamid för att förhindra läckage. Använda enbart epoxi som är klassad för plast, och ger tillräcklig tid för polymerisering av epoxi, såsom beskrivs i tillverkarens instruktioner. För ökad bekvämlighet kan flera kassetter förseglas och förvaras före upphällningen gelerna. Då hälla lösa gel, vara noga med att lämna tillräckligt med utrymme för stapling gel, vanligen ca 0,5 cm större än höjden av Than kam som används för att bilda fördjupningarna. Under polymerisation av den upplösande gelén, hålla gelén upprätt så att den buffert-mättad 1-butanol bildar en rak och plan yta för att bilda på toppen av den upplösande gelén. Om gelén inte polymeriserar inom 30 min, kan mängden av 10% APS TEMED och ökas. När väl gelén har körts, är det viktigt att noggrant bryta epoxi tätning för att förhindra att slita loss tunn gel. Metoden redovisas här att på nytt använda kommersiella gel kassetter kan spara betydande kostnader i samband med täta SDS-PAGE användning. Samma Kassetterna kan återanvändas i flera år och vi har inga bevis för att upprepad användning av samma kassett minskar deras användbarhet. Dessutom kan multipla geler framställas och lagras under flera veckor i en polyester-barriärfilm påse innehållande en liten mängd av 1 X stackgelen buffert innehållande 0,1% natriumazid.
Förkortningar:
Ditiotreitol (DTT), N, N, N ', N',-tetrametyletylendiamin (TEMED), typ I reagenskvalitet vatten (IRG-H2O), ammounium persulfat (APS), natriumdodecylsulfat (SDS), tris (hydroximetyl) aminometan (Tris-bas), N, N'-metylen-bis-akrylamid (bis -akrylamid)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna tackar Howard Hughes Medical Institute for en UF Science for Life utmärkelsen till AH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Invitrogen Nupage Novex Minigel Cassette (1.0 mm) | Invitrogen | NC2010 | Available in 2, 5, 10, 12, 15 and 2D wells |
| Plastic Epoxy | Loctite | 108771 | |
| Electrical Tape | Scotch Co. | ||
| 125 mL side arm flask | Pyrex | 5360 | |
| 4X Tris-Base resolving gel buffer | 1.5 M Tris-base pH 8.7 | ||
| acrylamide | Fisher Scientific | 01065-500 | |
| Bis-acrylamide | MP Biomedicals | 800173 | |
| 30.8% acrylamide solution | 30:0.8 acrylamide: bis-acrylamide in IRG-H2O | ||
| 10% APS | Fisher Scientific | BP179-25 | 0.1 g ammonium persulfate in 1 ml IRG-H2O, prepared immediately before use |
| TEMED | Acros Organics | 138450500 | |
| 1-butanol saturated with 1X resolving gel buffer | 5:2 1-butanol to 1X resolving gel buffer | ||
| 4X Tris-Base stacking gel buffer | 1.5 M Tris-base pH 6.8 | ||
| Gel comb | Invitrogen | NC3015 | 15 well, 1.0 mm thickness |
| Impulse Sealer | TEW Electric Heating Equipment | ||
| Heat Sealable Pouch | Kapak/Scotchpak | 1 pint size (6.5" x 8") | |
| Gel storage buffer | 1X stacking gel buffer with 0.1% sodium azide | ||
| Novex SDS Tris-Glycine sample buffer (2X) | Invitrogen | LC2676 | |
| DTT | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| 10X Tris-Gylcine Running buffer | Invitrogen | LC2675 | 1L of 10X stock: 29.0 g Tris-Base, 144.0 g Glycine, 10.0 g SDS |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | |
| Gel Knife | Invitrogen | EI9010 | |
| SimplyBlue Safe Stain | Invitrogen | LC6065 |
References
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Raymond, S., Weintraub, L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis. Science. 130, 711-711 (1959).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem. Biophys. Res. Commun. 28, 815-820 (1967).
