Analyse av Cell Cycle Posisjon i pattedyrceller

Summary

Bestemme cellesyklus plasseringen av en populasjon av celler, eller forstå hvordan signaler påvirker spredning, kan lett måles ved flowcytometri hjelp av denne protokollen. Vi rapporterer en enkel eksperimentell tilnærming til flekker celler og kvantifisering av sin posisjon i cellesyklus.

Abstract

Regulering av celleproliferasjon er sentralt i vev morphogenesis under utviklingen av flercellede organismer. Videre ligger til grunn for tap av kontroll over cellen spredning patologi av sykdommer som kreft. Som sådan er det stort behov for å kunne undersøke celle spredning og quantitate andelen av celler i hver fase av cellesyklus. Det er også av avgjørende betydning for indistinguishably identifisere celler som er replikere deres DNA i en større populasjon. Siden en celle beslutning om å spre er gjort i G1 fasen umiddelbart før oppstart av DNA syntese og progresjon gjennom resten av cellen syklus, tillater påvisning av DNA syntese på dette stadiet for en entydig fastsettelse av status for vekstregulering i cellekultur eksperimenter.

DNA-innhold i celler kan være lett quantitated ved flowcytometri av celler farget med propidium iodide, en fluorescerende DNA intercalating fargestoff.Likeledes kan aktiv DNA syntese være quantitated ved dyrkning celler i nærvær av radioaktive tymidin, høsting cellene, og måle inkorporering av radioaktivitet i en syre uløselig brøk. Vi har betydelig kompetanse med cellesyklus analyse og anbefaler en annen tilnærming. Vi undersøker celleproliferasjon bruker bromodeoxyuridine / fluorodeoxyuridine (forkortet bare som BrdU) flekker som registrerer inkorporering av disse tymin analogs inn nylig syntetisert DNA. Merking og farging av celler med BrdU, kombinert med total DNA beising av propidium iodide og analyse av flowcytometri ¹ tilbyr den mest nøyaktige mål på celler i ulike stadier av cellesyklus. Det er vår foretrukne metoden fordi den kombinerer påvisning av aktive DNA syntese, gjennom antistoff basert farging av BrdU, med total DNA innhold fra propidium iodide. Dette gir den klare separasjon av celler i G1 fra tidlig S-fasen, eller sent S fasen fra G2 / M.Videre kan denne tilnærmingen benyttes til å undersøke effektene av mange forskjellige celler stimuli og farmakologiske stoffer på regulering av progresjon gjennom disse ulike cellesyklus faser.

I denne rapporten beskriver vi metoder for merking og farging av dyrkede celler, samt deres analyse av flowcytometri. Vi inkluderer også eksperimentell eksempler på hvordan denne metoden kan brukes til å måle effektene av veksten hemme signaler fra cytokiner som TGF-β1, og proliferativ hemmere som cyclin avhengig kinase inhibitor, p27KIP1. Vi inkluderer også en alternativ protokoll som åpner for analyse av cellesyklus posisjon i en sub-populasjon av celler innenfor en større kultur ^5. I dette tilfellet viser vi hvordan du oppdage en cellesyklus arrest i celler transfektert med retinoblastom genet selv sterkt mindretall ved untransfected celler i samme kultur. Disse eksemplene illustrerer de mange måter som DNA flekker ogflowcytometri kan brukes og tilpasses for å undersøke grunnleggende spørsmål av pattedyr cellesyklus kontroll.

Protocol

1. Merking og fastsettelse av celler

1. Tilsett 1 mL av celleproliferasjon Merking reagens (BrdU) per ml i cellekultur medium (1-1000 fortynning) 1 time før høsting. Merkingen perioden må forlenges for langsommere voksende celler.
2. Å høste celler, aspirer kultur medium og vask grundig med fosfatbufret saltvann (PBS). Gjenta for å grundig fjerne spor av medium.
3. Vask kulturer raskt en tredje gang med PBS som inneholder 3mm EDTA og aspirer grundig.
4. Legg et lite volum av PBS som inneholder 3mm EDTA til hver rett, er 0,5 mL for en 6 cm parabolen ideal. Inkuber ved 22 ° C i ca 5 minutter å løsne cellene. Overføring til en 15 mL konisk tube.
5. Sentrifuger cellene ved 500 xg i 5 minutter til pellets, fjerne supernatant, og resuspender grundig i 100 mL PBS.
6. Fix celler ved å tilsette 5 mL av 95% EtOH, dropwise, mens virvling. På dette trinnet, kan cellene oppbevares ved 4 ° C i minst enmåneden.

2. Denaturering og farging av BrdU og DNA

1. Sentrifuger cellene ved 500 xg i 5 minutter til pellet celler og fjerne 95% EtOH. Gjensuspender i 1 mL 2N HCl og 0,5% Tx-100 ved å legge i en dråpe klok måte mens virvling. Inkuber ved romtemperatur i 30 minutter.
2. Sentrifuge som før i avsnitt 2.1 og nøye aspirer supernatant siden cellene danner en meget løs pellet på dette trinnet. Forsiktig resuspender i 1 mL 0,1 m NAB ₄ O ₇ (pH 8,5) og inkubert i minst 30 minutter ved romtemperatur.
3. Pellet celler som ovenfor i pkt. 2.1 og resuspender i 0,5 mL av antistoff løsning (PBS som inneholder 1% BSA og 0,2% Tween-20) med mus anti-BrdU antistoffer fortynnet 1-50. Inkuber ved romtemperatur i 30 minutter.
4. Pellet celler igjen og resuspender i 50 mL av antistoff løsning som inneholder kanin anti-mus sekundære antistoff konjugert til FITC fortynnet 1-25. Inkuber i 30 minutter påBorstemmaskin og beskytte mot lys.
5. Sentrifuger cellene en siste gang og resuspender i 0,5 mL propidium iodide og RNase løsning (PI-RNase løsning, PBS med 1% BSA, 10 mg / ml propidium iodide, 0,25 mg / ml RNase A) og inkuberes i mørke ved 37 ° C i 30 minutter. Alternativt RNA kan bli fordøyd over natten ved 4 ° C i mørket.
6. Pass løsning gjennom en celle sil for å fjerne aggregater og samle enkeltceller i en passende rør for sample opptak på din strømningscytometer. Igjen, må prøvene beskyttes mot direkte eksponering for lys.

3. Analyse av flowcytometri

1. Celler bør analyseres av en standard flowcytometer som er i stand til å diskriminere dubletter (to celler som passerer gjennom strømningscellen som én) med passende gjenkjenningsmuligheter for propidium iodide og FITC. Enkeltceller kan oppdages på denne flowcytometri søknad fra gating for hendelser basert på terminrente splitte og side scatter populations, og ved hjelp av egenskapene til DNA flekker av propidium iodide. Utseendet til en doublet diskriminerende prikk tomten varierer mellom flowcytometere og er avhengig av propidium iodide flekker egenskaper, se din lokale flowcytometri anlegg for råd om å sette opp en doublet diskriminator i analysen. Generelt, i et asynkront prolifererende populasjon av celler, enkeltceller er vanligvis de to mest tallrike topper (2N og 4N DNA) i doublet diskriminerende handlingen og en gate skal trekkes rundt dem. Dette vil markere én celle hendelser som er brukt for alle etterfølgende analyse nedenfor.
2. Den første prøven som skal analyseres skal være et asynkront proliferating kultur som fungerer som en positiv kontroll for flekker og flowcytometer set-up. Juster følsomheten photomultiplier rør for propidium iodide flekker slik at 2N og 4N topper fra singlet cellene er sentrert på 200 og 400 (vilkårlige enheter) på X-aksen. Vi ofte flekken et rikt eupply av disse cellene for å sikre at alle parametere for flowcytometer blitt justert riktig uten å bruke opp denne prøven. Denne positive kontroll er også nyttig for nye brukere å bli mer kjent med driften av strømningscytometer.
3. Juster følsomheten til photomultiplier rør for FITC deteksjon slik at G1 og G2 / M populasjoner er over bakgrunnen. BrdU positive celler bør være ca 10 ganger lysere og Y-aksen skal vises som en logaritmisk skala. Det kan være nyttig å inkludere en negativ kontroll for BrdU flekker (ved å erstatte den anti-BrdU antistoffer med ikke-spesifikk IgG i trinn 2.3 ovenfor) for å skille klart positivt fargede celler.
4. Juster kompensasjon mellom propidium iodide og FITC slik at enkelthendelser fanget av flowcytometer danner en hestesko formet bue fra G1 i nedre venstre opp til S-fase og ned i nedre høyre for G2 / M. Vennligst se følgende referanse for en mer dyptgående disunder veiledning av prinsippene og bruk av flowcytometri og referanser der i for spesifikke applikasjoner ^2.

Fire. Dataanalyse

1. 5 000 til 10 000 enkelt celle hendelser med ønsket spekter av DNA-innhold bør samles for hver prøve for å få tillit til at bestanden av celler i kultur har blitt grundig samplet.
2. Når cellene er blitt målt for propidium iodide og BrdU innhold de trenger å bli tildelt til G1, S, eller G2 / M faser. Gjør dette ved å tegne portene rundt de to BrdU negative populasjoner sentrert på 200 og 400 (G1 og G2 / M henholdsvis). Alt over disse boksene bør inkluderes i en enkelt gate som måler S-fasen (fig 1A). Andelen av celler i hver gate representerer det relative antallet celler i G1, S og G2 / M (Fig. 1B).

5. Alternative protokoll for analyse av cellesyklus i en blandet befolkning av celler

1. Denne alternative protokollen ermest nyttig når transfeksjon av uttrykk vektorer rutinemessig resulterer i en lav prosentandel av celler som uttrykker genet produktet av interesse, eller når medikamentell behandling for å velge en ren populasjon av celler er upraktisk. Dette resulterer i en relativt liten andel av cellene av interesse å være forurenset med en stor bestand av untransduced celler. I dette tilfellet, co-transfektere plasmider uttrykke genet eller shRNA av interesse sammen med en plasmid som uttrykker en markør for å oppdage transfektert celler ved flowcytometri, som en membran forankret GFP ^3, eller en utenlandsk celle overflate markør som CD19 ⁴ eller CD20 ^5.
2. Ved anvendelsen av denne protokollen vil vi bruke CD20 flekker som et eksempel, men farging for CD19 er i hovedsak identisk. I tilfelle av transfeksjon med CD20, er det ikke nødvendig å BrdU etikett, bare høste celler som beskrevet i trinn 1.2 til 1.5 ovenfor, og flekken ved å tilsette 20 mL FITC konjugert anti-CD20-antistoffer mot cellene ice i 20 minutter i mørket. Fix celler som beskrevet i trinn 1.6. Celler kan igjen lagres i minst en måned ved 4 ° C i mørket. For påvisning av GFP, utelate antistoff flekker fra dette trinnet og fikse og lagre celler som beskrevet.
3. Re-hydrate cellene ved pelletering i sentrifuger ved 500 xg i 5 minutter og resuspending i 5 mL PBS som inneholder 1% BSA.
4. Re-pellet cellene ved 500 xg i 5 minutter og resuspender cellene i 0,5 mL propidium iodide og RNase løsning som beskrevet ovenfor i avsnitt 2.5.
5. Fortsett å følge celleforberedelsen instruksjonene i 2.6 og analyse instruksjonene i 3.1 og 3.2.
6. Juster følsomheten til photomultiplier rør for FITC deteksjon slik at unstained cellene er over bakgrunnen. Ideelt sett vil CD20-FITC positive celler være 10X til 100X mer intenst farget enn bakgrunnen og Y-aksen på denne tomten skal vises som en logaritmisk skala (Fig. 2A). CD20 positive celler som er 10X lysere enn backgrunde (og med propidium iodide flekker mellom 200 og 400) bør velges for visning i en propidium iodide versus celletall histogram som vist i fig. 2C. For cellelinjer som uttrykker markører som er lett beiset lyst (ie. 10X til 100X over bakgrunnen) CD20 positive cut-off bør settes til 10X bakgrunn. Inkludering av svakere flekker celler øker variasjonen i disse eksperimentene, antagelig fordi genet av interesse er også svakt uttrykt i disse cellene. For cellelinjer som bare gir svakt farget CD20 positive (dvs. mindre enn 10X bakgrunnen), fastsettelse av en avskåret bør gjøres ved hjelp av en negativ kontroll bestående av CD20 fargede, untransfected celler.
7. Minst 1000 CD20 positive hendelser bør samles for hver prøve. Eksperimenter med færre enn 1000 hendelser vil produsere høy variabilitet. Programvarepakker som ModFit LT (Verity Software), Multi Cycle AV (Phoenix Flow Systems), og Flow Jo (Tre Star) bruke matematiske beregninger avG1, S og G2 / M populasjoner som bidrar til formen på kurven i histogrammene som de som er vist i fig. 2B og C.

Seks. Representant Resultater:

Vi gir tre eksempler på eksperimentelle cellesyklus analyser bruker våre tilnærminger. Den første bruker retrovirale uttrykk for cyclin avhengig kinase inhibitor p27KIP1 i mus embryonale fibroblaster. Tjuefire timer etter narkotika utvalg for viral infeksjon var ferdig, ble cellene puls merket med BrdU i én time. I dette eksperimentet ektopisk uttrykk for inhibitor brukes til å arrestere spredning av celler (Fig. 3A og B). Som vist i fig. 3B lite BrdU positive hendelser er tydelig i S-fase gate i respons til p27. Likeledes er andelen av celler i S-fasen for p27 uttrykke celler ganske lavt som diagramed i fig. 3C. Denne typen analyser har vært svært effektiv i å karakterisere cellesyklus kontroll defekter i celler hentet fra ulike stammer av gene målrettede ^{6 mus, 7, 8.}

I det andre eksperimentet ble untransformed mammary epitelceller (MCF10A) behandlet med veksten hemmende cytokin, transformerer vekst faktor beta ett (TGF-β1) i 24 timer. Celler ble merket med BrdU i fire timer umiddelbart før høsting. Som vist i fig. 4 BrdU merking i S-fase celler er sterkt redusert av TGF-β1 signalering, er spesifisiteten av flekker vår også validert med en IgG negativ kontroll (Fig. 4C). Kvantifisering av de ulike faser av cellesyklus bekrefter at TGF-β1 primært hemmer spredning i G1 fasen av cellesyklus, fører til en opphopning i denne fasen.

I vårt siste eksempelet er PRB mangelfull SaOS-2 celler transfektert med en CMV-CD20 uttrykk vektor og enten CMV-RB eller CMV-β-Gal som en kontroll. Tre dager etter transfeksjon cellene ble høstet, beiset, og faste. Flowcytometri analyse av disse celles er vist i fig. 5. Dette demonstrerer cellesyklus distribusjon av negativ kontroll transfektert celler (Fig. 5A) i sammenligning med fordeling følgende 72 timene av PRB uttrykk (Fig. 5B). Etter kurvetilpasning av Multi Cycle programvare, er en direkte sammenligning av andelen av cellesyklus faser vist i fig. 5C. Dette avslører opphopning av celler i G1 følgende PRB uttrykk og den relative utarming av celler fra S og G2 / M faser. Vi har brukt varianter av denne analysen for å sondere G1 arrestere mekanismer utstrakt ^{9, 10, 11, 12, 13.}

Disse eksemplene viser hvordan cellesyklus kontroll kan måles i respons til en rekke stimuli eller celle manipulasjoner. Denne tilnærmingen kan derfor tilpasses mange programmer som krever måling av cellesyklus posisjon i kultur typen eksperimenter.

Figur 1. Quantitasjon av cellesyklus faser av kombinert propidium iodide og BrdU flekker (PI-BrdU). (A) Dette panelet viser tre dimensjonal flowcytometri av propidium iodide og BrdU fargede cellene. Merk at celler med 2N og 4N DNA innhold er sentrert over 200 og 400 merker på X-aksen skala for propidium iodide flekker intensitet. BrdU flekker intensitet måles på en logaritmisk skala på Y-aksen. Legg merke til plasseringen av portene brukes til å quantitate celler i G1, S og G2 / M faser av cellesyklus. (B) Den relative andel av cellene i hver av de G1, S og G2 / M portene fra A er vist på denne grafen.

Figur 2. Kvantitering av cellesyklus faser i utvalgte celler ved hjelp av propidium iodide og celleoverflaten markør CD20. (A) Dette panelet viser propidium iodide og CD20 flekker for en blanding av celler, hvorav noen ectopically uttrykker CD20 og PRB. Merk at celler med2N og 4N DNA (den mest tallrike populasjoner) er sentrert over 200 og 400 merker på X-aksen. Plasseringen av CD20 + gate velger celler som er beiset minst 10X mer lyst enn bakgrunnen. (B) En graf av celletall versus propidium iodide farging er vist for CD20 negative celler i panel A som er asynkront proliferating. (C) En lignende graf vises for CD20 positive celler fra panel En som har blitt overtalt til å arrestere med PRB uttrykk og inneholder celler med primært 2N DNA innhold. Dette viser at en arrestert sub-populasjon kan skilles fra andre celler i denne kulturen bruke denne flekker teknikken.

Figur 3. Hemming av cellevekst med p27KIP1. (A) PI-BrdU analysen brukes til å måle cellesyklus fasene i et asynkront prolifererende populasjon av celler som ble transduced med en tom pBABE retrovirale Vetco Grayr. (B) En tilsvarende analyse av celler transduced med pBABE-p27. Legg merke til fraværet av cellene i S-fase og større intensitet av hendelser i G1 og G2 / M porter. (C) Kvantitering av celler i de respektive faser av cellesyklus i asynkront proliferating kontroll og p27 uttrykker celler.

Figur 4. Hemming av cellevekst med TGF-β1 (A) PI-BrdU analyse av asynkront proliferating MCF10A celler. (B) Analyse av celler behandlet med 100 pM av TGF-β1 i 24 timer. Merk akkumulering av cellene primært i G1 fasen av cellesyklus. (C) Validering av BrdU flekker ved å erstatte den anti-BrdU primær antistoff med en ikke-spesifikk IgG kontroll i asynkront proliferating celler. (D) Grafisk kvantifisering av de respektive cellesyklus faser fra A og B.

Figur 5. Hemming av cellevekst med PRB. (A) Cell teller versus propidium iodide farging av CD20 og ß-gal transfektert celler er vist. Dette er en viktig kontroll som transfeksjon kan delvis synkronisere celler, gjengi untransfected befolkningen (CD20 - celler) som en upassende kontroll for transfektert sub-populasjon. Transfektert cellene trenger for å bli sammenlignet med andre analogously transfektert celler. (B) Cell teller versus propidium iodide graf av CD20 og PRB transfektert celler. Merk den nesten eksklusive tilstedeværelsen av en 2N topp. (C) Grafisk fremstilling av cellesyklus fase proporsjoner bestemt fra A og B med kurvetilpasning metoder i Multi Cycle programvare.

Discussion

Vår erfaring er suksess med disse teknikkene avhengig av noen få viktige kontroller og eksperimentelle forhold. Den ene er å etablere en asynkront proliferating kontroll for bruk i disse eksperimentene. Denne kontrollen har tre viktige formål. Først sikrer det at kultur forholdene brukes for alle eksperimentelle prøvene er tilstrekkelige til å støtte kontinuerlig spredning i fravær av behandling. Denne prøven tjener også hensikten med en positiv kontroll for beising metodikk for å sikre at BrdU eller CD20-positive celler kan oppdages når de er til stede. Endelig er dette utvalget brukes til å kalibrere strømningscytometer. Denne kontrollen prøven kan brukes til å justere propidium jodid beising intensitet for å oppdage 2N og 4N celler på 200 og 400 henholdsvis. Videre kan deteksjon følsomhet BrdU eller CD20 justeres slik at negative og positive signaler er sentrert som vist i figur 1A og 2A. Når alle prøvene har en lignende konsentrasjon av celler i PI-RNase løsning, så noen justeringer cytometeret er nødvendig som etterfølgende prøver er kjørt. Dette er viktig for grunner vist i fig. 4B og 5B hvor sterk G1 opphopning skaper egentlig et enkelt G1 peak som kan feiltolkes som G2 / M.

Den representative eksperimentene også gjøre andre viktige punkter. Først av alt, viser de at BrdU opptak og merkingen kan variere mellom celletyper. Av denne grunn er det viktig å empirisk bestemme lengden på puls og flekker forutsetninger for å tilstrekkelig oppdage celler i S-fase. Generelt kan celletyper som dobbel i kultur i 24 timer eller mindre merkes med BrdU i en time. Langsommere vekst celletyper kan kreve lengre pulser og endringer antistoff flekker betingelser og varighet. MCF10A celler er et utmerket eksempel i denne forbindelse som de var merket med BrdU i fire timer og farget med dobbelt standard konsentrasjon av antistoffer til fire ganger så lang. Etterforskernebør være forsiktig med ikke å overstige 6 timer BrdU merking selv med svært langsomt voksende celler som dette kan feilaktig føre til inkludering av G2 / M celler i S-fasen befolkningen. Dernest å sammenligne effekten av p27KIP1 uttrykk med de av TGF-β1, er det klart at p27 kan indusere en akkumulering i verken G1 eller G2 / M faser mens TGF-β1 signalering induserer en G1 arrest. Tradisjonell måte å oppdage spredning eksempel ³ H-Thymidine innlemmelse og scintillation telling ikke klarer å skille disse mulighetene.

I vårt alternative protokoll demonstrerer vi påvisning av en sub-populasjon av celler i en større untransfected befolkning. Det er viktig å empirisk finne de mest aktuelle reporteren for å oppdage transfektert celler. Etter vår erfaring enkelte celletyper verken direkte celleoverflaten markører dårlig, eller ikke kan skikkelig trafikk dem til plasma membran, noe som resulterer i en manglende evne til å oppdage transfektert celler. Likewise, ikke alle celler tåler membran bundet form av GFP. Valg av de mest aktuelle reporteren bør gjøres ved å vurdere transfeksjon effektivisering av reporteren samt den relative intensiteten av uttrykket i forhold til untransfected kontroller. Ideelt sett vil heterologe uttrykk for disse molekylene være godt tolerert og det er tankevekkende at markørene har liten eller ingen effekt på cellesyklus distribusjon.

En begrensning av disse typene flowcytometri tilnærminger er at de er bare i stand til å etablere relative Forekomsten av cellesyklus faser i forhold til hverandre. Av denne grunn er det tvetydig om uttrykket av p27 i figur 3 virkelig induserer en arrestasjon i G1 og G2 / M, eller om det bare bremser progresjon gjennom disse fasene i forhold til S-fase. Disse mulighetene kan undersøkes nærmere ved å behandle en parallell prøve av celler med en mitotisk inhibitor som nocodazole, eller G1 / S inhibitor som aphidicolin. Siden disse stoffene skaper en Dominant arrest i M-fase eller tidlig S-fasen henholdsvis vil sakte prolifererende celler akkumuleres ved legemiddelindusert arrestasjonen punkt. For eksempel celler arrestert i G1 grunn av PRB uttrykk vil forbli i G1 tross nocodazole behandling mens kontroll cellene vil akkumuleres i M-fase ^13.

Samlet utgjør disse eksperimentelle tilnærminger tilbyr en fleksibel metode som kan brukes til et bredt spekter av pattedyrceller syklus problemstillinger. De kan lett oppdage endringer i cellesyklus progresjon og kvantifisere forskjeller sammenlignet med kontroller.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Proliferation Labeling reagent	GE Healthcare	RPN201
Anti-BrdU Antibodies	BD Biosciences	347580
Anti-Mouse FITC conjugated Antibodies	Vector Laboratories	FI-2000
Cell Strain Filters	BD Biosciences	352235
Anti-CD20 Antibodies	BD Biosciences	347673
Multi Cycle Software	Phoenix Flow Systems	N/A