Summary
Este es un protocolo para aislar Kinesin activos de larga duración de la
Abstract
Proteínas motoras se mueven cargas a lo largo de los microtúbulos, y transportarlos a determinados lugares subcelulares. Dado que el transporte alteración se sugiere que la base de una variedad de enfermedades neurodegenerativas, la comprensión de los microtúbulos de transporte basada en el motor y su regulación es probable que en última instancia conducir a mejores estrategias terapéuticas. Kinesin-1 es una proteína motora eucariotas que se mueve en una dirección anterógrada (más extremo) a lo largo de los microtúbulos (MT), impulsado por la hidrólisis de ATP. Aquí se presenta un detallado protocolo de purificación para aislar kinesina activos de larga duración a partir de embriones de Drosophila, lo que permite la combinación de la genética de Drosophila con los estudios de una sola molécula biofísicos. A partir de aproximadamente 50 tazas de ponedoras, con aproximadamente 1.000 mujeres por cada taza, se llevó a cabo las colecciones de la noche. Esto proporcionó aproximadamente 10 ml de embriones envasados. Los embriones fueron dechorionated cloro (que produce aproximadamente 9 gramos de embriones), y se homogeneiza a continuación. After interrupción, el homogenado se aclaró mediante un giro de baja velocidad seguido por una centrifugación a alta velocidad. El sobrenadante clarificado se trató con GTP y el taxol para polimerizar MTs. Kinesin se inmovilizó sobre polimerizado MTs añadiendo el análogo de ATP, 5'-ciclasa imidodiphosphate a temperatura ambiente. Después de quinesina unión, los microtúbulos se sedimentaron mediante centrifugación a alta velocidad a través de un colchón de sacarosa. El sedimento de los microtúbulos se volvió a suspender, y este proceso se repitió. Por último, el ATP se añadió para liberar la kinesina de la MT. Centrifugación de alta velocidad luego centrifugadas la MT, dejando la quinesina en el sobrenadante. Este quinesina se sometió a una filtración centrífuga utilizando un corte 100 KD fuera filtro para una purificación adicional, alícuotas, se congelaron en nitrógeno líquido, y se almacenó a -80 ° C. Electroforesis en gel SDS y Western Blot se realizó utilizando la muestra purificada. La actividad motora de muestras purificadas antes y después de la etapa final de filtración centrífugase evaluó mediante un ensayo in vitro de una sola molécula de microtúbulos. Las fracciones kinesin antes y después de la filtración centrífuga mostró procesividad como ya se ha informado en la literatura. Otros experimentos están en marcha para evaluar la interacción entre kinesina y otras proteínas relacionadas con el transporte.
Protocol
Las cepas de moscas se pueden comprar y se amplifica en el laboratorio. Dependiendo de la cantidad de frascos de cultivo de Drosophila recibidos, una necesidad de frecuencia 'voltear' los frascos de cultivo, una vez que los viales ha alcanzado su capacidad máxima. La ampliación continúa hasta alrededor de 50 frascos de cultivo de Drosophila se llenan. Entonces se hace "volar tazas" con vasos de 100 ml de tres picos (Fly toma la taza se discute en la siguiente sección). Después de 24 horas, uso de embriones a partir de estos vasos a los frascos de cultivo de semillas nuevas de Drosophila con la comida mosca pegada en la parte inferior. A temperatura ambiente, el tiempo de crecimiento para los embriones de Drosophila a partir de embriones durante la noche a completos moscas cultivadas son aproximadamente 8,5 días. Embriones sembrados eclosionan después de 12-15 horas en la primera etapa de las larvas. Las larvas crecen durante unos cuatro días muda dos veces en la etapa de las larvas de segundo y tercer lugar, a las 24 y 48 horas después de la eclosión. Las larvas se encapsulan en pupariums y se somete a una metamorfosis cuatro días hasta que salen de theredero de pupas de los casos 1. Permitir un mayor crecimiento durante aproximadamente dos a tres días en los frascos de cultivo de Drosophila para aumentar la cantidad de moscas en cada uno. Cuando se llenan los frascos de 400, habrá una cantidad suficiente de moscas durante cincuenta tazas de postura de huevos (alrededor de 1,000 moscas hembra por taza). Las moscas necesitan tiempo para adaptarse a su nuevo entorno. Por lo general toma alrededor de dos días para que esté listo para la recolección, después de haber sido transferido a las copas. Sustitución de placas de agar diario mantendrá las tazas de moscas limpias, que permiten a las moscas que viven más tiempo. (Para una mayor comprensión de la atención de Drosophila y de amplificación, por favor refiérase a la Drosophila DB Roberts: Un enfoque práctico 2).
Una buena fuente para obtener grandes cantidades de embriones de Drosophila son 3 jaulas de población, que están disponibles comercialmente. El montaje y mantenimiento de las jaulas de la población se puede ver en el capítulo 5 y 7 en el libro de Drosophila melanogaster: PUsos PRÁCTICA en la célula y 4 de la Biología Molecular. Sin embargo, las jaulas de la población son caros y son difíciles de mantener. Dado que las jaulas de población puede mantener una cantidad abundante de moscas, el uso de dióxido de carbono es necesario para la transferencia y la alimentación de las moscas. Como se dijo antes, el dióxido de carbono disminuye la salud de las moscas, causando que no estaba así. A pequeña escala, vasos de precipitados de 100 ml de tres picos puede ser utilizado. Con cincuenta vasos de 100 ml, 9 gramos de dechorionated embriones puede ser alcanzado. Con el fin de eliminar las moscas muertas, la pasta de levadura utilizada y otras impurezas que hemos creado un receptor de doble tamiz de capas con diferentes tamaños de malla. Una trampa de tamiz los materiales no deseados, como las moscas muertas al tiempo que permite pasar a través de embriones (350 micras de tamaño de poro). La segunda parte contiene una malla (120 micras de tamaño de poro), que está destinado a coger embriones de Drosophila y otras impurezas pasarán a través de la malla.
1. Fly Preparación Copa y recolección de embriones
- Voltearlas moscas amplificados procedentes de varios viales en un frasco de plástico vacío, hasta que la cantidad de moscas han alcanzado una pulgada de altura del frasco. A continuación, transferir las moscas en una taza de 100 ml de huevo colección (vaso de Tricon con malla de nylon las ventanas). Mantenga tocando la copa sobre una superficie dura para evitar el escape de las moscas, cuando la transferencia de las moscas. Cubra la taza con una pasta de levadura que contiene la placa de agar y dejar 24-48 horas de tiempo de estabilización.
- Recoge las placas de agar durante la noche de cincuenta tazas de moscas y lavar el contenido de las placas para el receptor granulométrico con un pincel limpio y agua corriente. La carne de los embriones en el tamiz con agua abundante hasta que toda la pasta de levadura se lava lejos.
- Dechorionate los embriones limpiados por inmersión en 50% de lejía durante 3 min.
- Enjuague con agua destilada hasta que los embriones ampliamente perder el olor a cloro. Después hay que secar la malla con embriones, colocándolo en los tiempos de ac toalla varias veces. Transferencia de los embriones a un tubo de ensayo limpio y registrar el peso. </ Li>
2. Embriones homogeneización y clarificación
- Coloque dechorionated embriones en homogeneizador Dounce con volumen x 1,5 de tampón de extracción enfriado con hielo.
- Haga 5 golpes con la mano del mortero suelto. Alícuota del homogeneizado en tubos de centrífuga limpios. Centrifugar a 15.000 g durante 40 min. a 4 ° C.
- Recoger cuidadosamente el líquido sobrenadante claro sin la capa de lípidos superior de color blanco o la parte inferior de pellets.
- Transferir el sobrenadante para limpiar los tubos de centrífuga y se centrifuga a 50.000 g durante 30 min. a 4 ° C
- Como resultado de alta velocidad sobrenadante recogido como se explicó anteriormente puede ser utilizado inmediatamente o puede ser broche de congelados y almacenados a -80 ° C durante meses.
3. Microtúbulos polimerización y unión Kinesin
- Descongele el congelado de alta velocidad sobrenadante a temperatura ambiente. Para polimerizar microtúbulos, añadir GTP (0,3 mM) y taxol (20 mM) y agitar suavemente a temperatura ambiente durante 20 min enun agitador rotatorio.
- Para enlazar quinesina, añadir 2,5 mM de ATP no hidrolizable analógico 5'-ciclasa imidodiphosphate (AMPPNP), seguido por una agitación de 10 minutos a temperatura ambiente en un agitador rotatorio.
4. Diferencial de sedimentación de los microtúbulos y Kinesin
- Los sedimentos a través de una almohadilla de sacarosa volumen igual (20% de sacarosa y 10 taxol mM en tampón de extracción) por centrifugación a 23.000 g (sw41ti rotor, TLS-55) durante 30 min. a 4 ° C.
- Lavar precipitado por resuspensión en 10% de volumen original homogeneizado en tampón de extracción que contiene 10 mM de taxol y 75 mM de NaCl.
- Repetir la sedimentación con otro cojín volumen de sacarosa igual que en el paso 4,1.
- Vuelva a suspender sedimento lavado de la sal en tampón de extracción 5% con 20 mM de taxol, 75 mM de NaCl, 10 mM de MgSO 4, y 10 mM de ATP.
- Los sedimentos en 120.000 g (sw41ti rotor: 31.000 rpm, TLS-55: 42.000 rpm) durante 20 minutos a 4 ° C. Recoger el sobrenadante (kinesinfracción).
- Realizar una filtración centrífuga a 14.000 g durante 15 min a 4 ° C. Recuperar muestra concentrada y repetir la filtración con un filtro de nuevo como anteriormente durante 30 minutos y se recoge la muestra concentrada.
- Realizar un ensayo de proteínas para determinar la concentración. Brevemente, variando las concentraciones de una proteína conocida (albúmina de suero bovino; BSA) se mezcló con un volumen conocido de reactivo de Bradford y se midió la densidad óptica a la longitud de onda 595nm. Entonces una densidad óptica frente a la curva estándar de concentración se estableció para calcular la concentración desconocida de fracción purificada quinesina utilizando la densidad óptica de esta muestra medido bajo condiciones similares a la de las muestras de BSA estándar. La electroforesis en gel, así como el Western Blot También se realizó utilizando una cantidad conocida de la quinesina purificado.
- Fracción alícuota de kinesina en pequeños volúmenes de concentración deseada y la congelación de complemento en nitrógeno líquido para almacenar a -80 ° C.
De longitud completa Kinesin funcional se purificó a partir de embriones de Drosophila. La Figura 1 muestra el gel teñido con plata que muestra las diferentes fracciones durante la purificación. El carril 1 es una muestra del sobrenadante de alta velocidad después de la clarificación (paso 2,5), carril 2 es una muestra del sedimento después de la clarificación, carril 3 es una muestra del sobrenadante después de la sedimentación primero con colchón de sacarosa (paso 4,1), carril 4 Se una muestra del sedimento después de la sedimentación primero, carril 5 es una muestra del sobrenadante después de la sedimentación segundos (paso 4,3), carril 6 es una muestra del sedimento después de la sedimentación segundo, carril 7 es una muestra de la pastilla de la sedimentación final (paso 4,5), carril 8 es la muestra quinesina purificada, carril 9 es la muestra quinesina filtró, y el carril 10 es el marcador. La banda se concentró en el carril 8 y 9 a alrededor de 115 kD es quinesina la cadena pesada de 1, lo cual es consistente con Figure 1, carril 8 del documento Saxton publicado en 1988 5. Figura 2 representa la mancha c occidental de la fracción purificada quinesina detectaron utilizando el anticuerpo quinesina cadena pesada. El anticuerpo AKINO1-A no significativamente reacción cruzada con otros miembros de la familia kinesin 6. Nótese que aunque este protocolo resulta en una buena fuente de quinesina funcional, mientras que la fracción se enriquece para quinesina-1, hay contaminantes posibles, incluyendo potencialmente kinesins otros y otras proteínas de motor. Hemos eliminado una variedad de contaminantes más pequeños por filtración. En cuanto a la eliminación de otros motores que no pueden ser realizados por tamaño por sí solo, la purificación es similar a lo que se hizo por otros para estudiar quinesina 7, y creemos que la mayoría del motor activa es Kinesin-1, pero purificación más sofisticado permitir que eliminación de los contaminantes motores potenciales, como se hizo por Cole et al 8 y Saxton et al. 9 La procesividad de quinesina se evaluó in vitro por un solo ensayo microtúbulos molécula de unión, tal como se describe con más detalle en el libro de Scholey titulado "ensayo de motilidad de las proteínas del motor" 10. Brevemente, perlas de poliestireno con un motor activo solo se pone en contacto con los microtúbulos, en presencia de saturar (1 mm) ATP. El motor unido a los microtúbulos, y comenzó a caminar lejos del centro de la trampa láser. En un desplazamiento predefinido del talón desde el centro trampa (100 nm) la potencia del haz láser se convirtió automáticamente fuera, permitiendo que el motor de caminar a lo largo de la MT sin carga. La película muestra un diámetro de 500 nm de perlas con kinesin sola caminando por MT. La longitud de la pantalla de vídeo corresponde a 20 micras. Figura 3 representa la distribución medida de run-longitudes individuales para las moléculas de longitud completa de Drosophila kinesin, purificado de acuerdo con el protocolo presentado aquí. El exponentiAl ajustarse a la distribución proporciona la longitud de recorrido promedio de una sola kinesina 1,55 ± 0,1 m y 1,28 ± 0,12 micras para la muestra filtrada y no filtrada, respectivamente.
Figura 1 gel de plata manchado de las fracciones purificadas. Muestras de cada fracción se corrieron en un gel de 10%. 10 g de proteína se cargó en cada carril. El carril 1 es una muestra del sobrenadante de alta velocidad después de la clarificación (paso 2,5), carril 2 es una muestra del sedimento después de la clarificación, carril 3 es una muestra del sobrenadante después de la sedimentación primero con colchón de sacarosa (paso 4,1), carril 4 Se una muestra del sedimento después de la sedimentación primero, carril 5 es una muestra del sobrenadante después de la sedimentación segundos (paso 4,3), carril 6 es una muestra del sedimento después de la sedimentación segundo, carril 7 es una muestra de la pastilla de la sedimentación final (paso 4,5), carril 8 es la quinesina purificómuestra, carril 9 es la quinesina filtró utilizando un 100 kD de corte Amicon Ultra 0,5 ml de filtro centrífugo (Millipore, EE.UU.). Las flechas azules indican las proteínas cuyos montos se redujeron y la flecha roja indica la concentración de la quinesina debido a la etapa de filtración centrífuga utilizada en este protocolo.
. Figura 2 purificada fracción KHC borrados contra anti-anticuerpo quinesina: purificada muestra quinesina se sometió a electroforesis en gel y borrado (en la membrana de nitrocelulosa) contra el anticuerpo primario AKINO1-A (1:1.000 en TBST) durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido por incubación en Donkey-anticuerpo anti-conejo (1:10,000 en TBST) durante una hora a temperatura ambiente. Un ECL (quimioluminiscente) kit se utiliza para detectar la señal quinesina se muestra arriba.
Figura 3. de Drosophila completo: (A) y (B) longitud de recorrido y la velocidad de la muestra filtrada quinesina. (C) y (D) RunLength y la velocidad de muestra quinesina sin filtrar.
Figura 4. Vídeo de la motilidad Kinesin. Haga clic aquí para ver el video .
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Discussion
Cerebro bovino es el material más utilizado para purificar a partir 11 de longitud completa quinesina, aunque el cerebro murino se ha utilizado como bien 12. Una gran desventaja del uso de cerebro bovino como fuente quinesina es la disponibilidad de material fresco de partida: mataderos son típicamente inaccesible, y el cerebro debe ser extremadamente fresco con el fin de obtener quinesina activo. Además, sólo los cerebros de vacas jóvenes son eficaces. Por último, la manipulación genética de las vacas no es actualmente una opción viable, por lo que sólo 'tipo salvaje' de proteínas pueden ser estudiados.
Los ratones son más accesibles, pero la cosecha del cerebro de ratón está consumiendo un poco difícil y el tiempo de la purificación puede requerir más de 50 cerebros. Además, el mantenimiento de una colonia de ratones pueden ser bastante caros.
En contraste con las fuentes de bovino o murino, Drosophila tiene una serie de ventajas. En primer lugar, las moscas fácilmente que se puede cultivar en el laboratorio con el capital mínimo a cabolaicos, y por lo tanto están fácilmente accesibles. Drosophila ponen embriones prolíficos, que son fáciles de cosechar, como se describe aquí. Debido a que el genoma de Drosophila se puede manipular, y de hecho muchas moscas mutantes se obtienen fácilmente, ambas proteínas de tipo salvaje y mutante puede ser purificado, y debido a la combinación de manipulaciones genéticas y un tramo corto generación, más mutantes puede ser aislado. Sin embargo, hay que señalar que, debido a la pérdida completa de la función quinesina es letal, y proteínas en los embriones se proporciona predominantemente materna, no es posible purificar mutantes puros kinesin que están impedidos dramáticamente. No obstante, es posible purificar proteínas a partir de embriones heterocigotos (Kin-mut / +), y caracterizar la función de la población mixta y, a continuación se relacionan potencialmente tales cambios en la función a fenotipos en el animal.
La alteración o deterioro del transporte parece subyacer en muchas enfermedades neurodegenerativas, sin embargo, la relación mecanicistaentre la enfermedad y la alteración de una sola molécula de la función (ya sea por mutaciones o un entorno de señalización alterada) no está claro. El ensayo de purificación de proteínas desarrollado aquí debe ser una herramienta importante en la búsqueda de esta comprensión, porque una sola molécula de ensayos se puede utilizar para determinar el funcionamiento de los motores ". Mediante la combinación de estos estudios con la caracterización in vivo de los fenotipos, y con la ayuda de modelos, lo que permite la determinación directa de la relación entre la alteración de las propiedades específicas de un solo molecular y desarrollo de la enfermedad / progresión (como ejemplo, ver la relación entre la alteración de la función de una sola molécula de dineína y la transporte deterioro neuronal, en 13).
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Un agradecimiento especial a Kris Ngai y Jason Del Río por su apoyo y ayuda en este proyecto. Este trabajo fue apoyado por subvenciones RO1 GM070676 a SPG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar (Granulated) | Fisher Scientific | 1423-500 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous | Fisher Scientific | D16-3 | |
| Petri Dishes | BD Biosciences | 35 1007 | 60x15mm Style (Polyester) 20/bag |
| Drosophila Culture Vials | UCI | ||
| Tricorn beaker | Econo Lab Inc. | B700-100 | Volume:100ml, size: 58x72mm |
| Yeast | Red Star | 2751 | |
| Nylon Mesh | Genesee Scientific | 57-102 | 120 micron pore size |
| Nylon Mesh | Small Parts, Inc. | 06-350/35 | |
| Pipes | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Pipes | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 67-42-5 | |
| MgS04(Anhydrous) | Fisher Scientific | 7487-88-9 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 329-98-6 | |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | 103476-89-7 | |
| Aprotonin | Sigma-Aldrich | 9087-70-1 | |
| TAME | Sigma-Aldrich | 178403-8 | |
| STI | Calbiochem | 65635 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | 36051-31-7 | |
| Taxol | Sigma-Aldrich | 33069-62-4 | |
| ATP analog 5’-adenylyl imidodiphosphate | Sigma-Aldrich | 3605-31-7 | |
| NaCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 7647-14-5 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 74804-12-9 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters: .5 mL, 100kD cut off, 8 pack | EMD Millipore | UFC510008 |
References
- Ashburner, M., Thompson, J. N. The laboratory culture of Drosophila 2A. The genetics and biology of Drosophila. Ashburner, M., Wright, T. R. F. , Academic Press. 1-81 (1978).
- Roberts, D. B. Drosophila: A Practical Approach. , Oxford University Press. (1998).
- Kunert, N., Brehm, A. Mass production of Drosophila Embryosand Chromatographic Purification of Native Protein Complexes. Methods in Molecular Biology. 420, 359 (2008).
- Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A., Wilson, L., Matsudaira, P. T., Eds, Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. 44, (1994).
- Saxton, W. M. Drosophila kinesin: Characterization of microtubule motility and ATPase. Proceedings of the National Academy of Science. 85, 1109 (1988).
- Shubeita, G. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1098 (2008).
- Svoboda, K., Block, S. M. Force and Velocity Measured for Single Kinesin Molecules. Cell. 77, 773 (1994).
- Cole, D. G., Saxton, W. M., Sheehan, K. B., Scholey, J. M. A "Slow" Homotetrameric Kinesin-related Motor Protein Purified from Drosophila embryos. J. Biol. Chem. 269, 22917-22917 (1994).
- Saxton, W. M. Isolation and Analysis of Microtuble Motor Proteins. Drosophila Melanogaster. Bloomington: Academic. 44, 279 (1994).
- Scholey, J. Motility Assay for Motor Proteins. Methods in Cell Biology. 39, 138 (1993).
- Wagner, M. C., Pfister, K., Brody, S., Bloom, G. Purification of kinesin from bovine brain and assay of microtubule-stimulated ATPase activity. Methods in Enzymology. 196, 157 (1991).
- Aizawa, H.
- Ori-McKenney, K. M., Xu, J., Gross, S. P., Vallee, R. B. A cytoplasmic dynein tail mutation impairs motor processivity. Nature Cell Biology. 12, 1228-1228 (2010).
