プルダウンカルモジュリン結合タンパク質の

Summary

カルモジュリン（CaM）プルダウンアッセイは、様々なタンパク質とカルモジュリンの相互作用を調査するために効果的な方法です。このメソッドは、CAM -結合タンパク質の効率的かつ特定の分析のためのCaM -セファロースビーズを使用しています。これは、細胞機能のCAM信号を探索するための重要なツールが用意されています。

Abstract

カルシウム（Ca ^{2 +）は、}さまざまなメカニズムを通じて細胞機能の調節に重要なイオンで ​​す。多くのCa ^{2 +}のシグナリングは、カルモジュリン^（CaM）1,2として知られているカルシウム結合タンパク質によって媒介される。 CAMは、アポトーシス、代謝、平滑筋収縮、シナプス可塑性、神経の成長、炎症と免疫応答を含むほぼすべての細胞プロセス、内の複数のレベルで関与している。タンパク質の数は、CAMとの相互作用を介してこれらの経路を調節するのに役立ちます。これらの相互作用の多くは、Ca ²にバインドされたときに明らかに異なっているCAMのコンフォメーション^、+（のCa ^{2 +} - CaMの）としてのCa ^{2 +} -フリー状態^{（ApoCaM）3}とは対照的に依存する。

ほとんどの標的タンパク質は、Ca ^{2 +} - CaMのをバインドしながら、特定のタンパク質だけApoCaMに結合する。ニューロ^4、ニューログラニン（呉^）5、および特定のミオシンを含む彼らのIQ -ドメインを介して、いくつかのバインドCAM、 7、シナプス機能^8、および筋収縮⁹の重要な役割を果たすことが示されている。結合し、Ca ^{2 +}の存在下または存在下でCAMをリリースする⁺能力は、それらの機能に極めて重要である。対照的に、多くのタンパク質は唯一のCa ^{2 +} - CaMの結合し、それらの活性化のため、このバインディングを必要とする。例としては、ミオシン軽鎖キナーゼ¹⁰のCa ^{2 +} /カルモジュリン依存性キナーゼ^{（CaMKs）11}とホスファターゼ（例えばカルシニューリン^）12、及び直接的および下流効果¹⁴のバリエーションがスペクトリンキナーゼ^13を 、含まれています。

細胞機能に対するこれらのタンパク質の効果は、通常のCa ^{2 +}依存的にCAMに結合する能力に依存しています。例えば、我々は、シナプス機能とどのように異なる突然変異は、この結合に影響を与えるのNG - CaMの結合の妥当性をテストした。我々は、GFPタグ付き伍CONを生成のCa ^{2 +}依存的にCAMをバインドするために呉の能力を変更するようなIQ -ドメイン内の特定の変異を持つ構造体。これらの異なる突然変異の研究は、シナプス機能^8,15に関与する重要なプロセスに私たちに偉大な洞察力を与えた。しかし、このような研究で、それは変異タンパク質が予想されるのCaMへの結合を変更していることを証明するために不可欠です。

ここで、我々は、例としてCaMKIIとngを使用して、Ca ^{2 +}の存在下または非存在下でCAMに結合するタンパク質の能力をテストするための手法を提案する。このメソッドは、CaMとプルダウンアッセイと呼ばれるアフィニティークロマトグラフィーの形です。それは、CaMと⁺この結合に対するCa ^{2 +}の影響に結合するタンパク質をテストするためのCaM -セファロースビーズを使用しています。それは、効率的なかなり多くの時間であり、カラムクロマトグラフィーおよび他のアッセイの相対少ない蛋白質を必要とします。完全に、これはでているのCa ^{2 +} /カルモジュリンのシグナル伝達やタンパク質を探索するために貴重なツールを提供します。CAMとteract。

Protocol

ホモジネートで始まる手続きの基本的な回路図は図1を参照してください。細胞抽出物の作成からCAM -結合タンパク質の溶出に要する時間は約6〜7時間です。

1。組織の準備

1. 目的の組換えタンパク質を発現するプラスミドを含有するウイルスと器官型海馬スライス（この例では、緑色蛍光タンパク質（GFP）タグ付きng）を注入し、組織が一晩タンパク質を発現することができます。
2. ウイルス注射後約12〜18時間（ウイルス発現時間に応じて）、組織を収集するための準備。ペトリ皿に1mLの解剖バッファー（10mMのグルコース、4mmのKClを、26ミリメートルNaHCO3水溶液、233mMスクロース、5％CO ₂ 95％O ₂でガス処刑さ5mMのMgCl _2を 、1mMのCaCl _2で 、0.1％フェノールレッドを、）を追加します。ペトリ皿に培養組織/インサートを移し、水没に挿入組織に2mLの解剖のバッファを追加します。
3. Collec軽くメスを用いてインサート膜の自由な組織を掻きによるT器官型海馬組織（5〜10スライス）。特に関心のある特定の地域（例：CA1）を削除することもオプションです。反転パスツールピペットを用いて1.5ml微量遠心チューブに中断組織を転送する。
4. 解剖のバッファから別の組織への1分間に1,500 rcfで、サンプルを遠心分離します。慎重に吸引して上清を取り除く。ペレットを妨害しないことを確認してください。
5. 使用するスライスごとに、均質化緩衝液（150MMのNaCl、20mMのトリスpH7.5、1mMのDTT、1μg/mlのロイペプチン、1μg/mlのchemostatin、1μg/mlのアンチパイン、1μg/mlのペプスタチン、および1％トリトンXの30〜60μLの組織-100）とは、乳棒で十分にホモジナイズする。
6. 細胞残渣を除去するためには、10分1,100 rcfで、残りのホモジネートを遠心し、ペレットからの汚染を回避しながら慎重に吸引して上清を取り除く。
7. 入力のサンプル（サンプル1）として、上清の10％を取る。ステップ3で使用するためのCAM -セファロースビーズの調製中に氷の上の残りの上清を保存する。

注：ここで使用される組織は器官型海馬スライスです。ただし、1つ解離神経細胞やその他の細胞培養システムを使用することができます。このような場合には、適切な方法であなたの組織を収集した後、ステップ1.4から始まります。

2。プルダウン用のビーズの調製

ビーズを扱うには、ビーズをサルベージし、チューブの両側に乾燥からビーズを防ぐことによって、反応の効率を最大化するために重要です。そのためには、それは解決策がすぐに遠心分離する前に、チューブの壁にビーズを湿らせることができます、彼らの側にしてチューブを回転させることが最善です。

1. 各プルダウンのため、相対的にFLAで2 mlのマイクロチューブに懸濁カルモジュリン-セファロースビーズのピペット400μLあなたのインキュベーションの間のビーズを使用してソリューションの表面積との相互作用を最大化するためにT -底。
2. 30秒21,000 RCFでビーズを遠心し、慎重に吸引して上清を取り除く。ビーズを邪魔しないようにしてください。
3. ビーズを洗浄するためには、Ca ²プルダウンビーズ用⁺ - CaMの結合タンパク質および2mM EDTAを（既知のCa ^{2 +}キレート剤）プルダウンするために使用されているものに2mMのCaCl _2のいずれかを含むそれぞれの均質化緩衝液100μLを加えるApoCaM結合タンパク質。ゆっくりと1分間に1,500 rcfで再びサスペンドビーズや遠心するチューブをタップします。慎重にビーズを邪魔しないことを確認し、吸引して上清を取り除く。

注：すべての吸引の手順については、それがビーズを除去することなく、溶液の除去を可能にするために微細な開口部を（例えば、ゲルローディングチップ）を持つピペットチップを使用することをお勧めします。

3。タンパク質のCAM -セファロース結合

1. 等量を含む二つの条件にして上清を分割する。あなたの条件に応じて、各2 mMの濃度にして上清にCaCl ₂またはEDTAの適切な量を追加します。
2. ステップ1.7から対応する均質化緩衝液で洗浄したビーズに上清を追加。穏やかに混合するためにチューブをタップします。
3. シェーカーで3時間4℃でサンプルをインキュベートする。結合の効率性を高めるために毎30分ほどビーズを再懸濁する。
4. 3分1,500 rcfで、サンプルとビーズを含むチューブを遠心する。
5. 非結合タンパク質のサンプル（サンプル2）として、上清の50μLを取り、慎重に吸引し、廃棄によって、残りの上清を取り除く。
6. それぞれの均質化緩衝液の100μLを用いて、ステップ2.3で説明したようにビーズを3回洗浄する。

4。溶出

1. 反対の条件（10mMのCを含む溶出バッファー（50mMトリス - 塩酸pH7.5の、および150mmのNaCl）の50μLを追加ビーズにACL ₂または10mMのEDTA）。例えば、 ^{カルシウムを}含む緩衝液中でホモジナイズし、バインドされていたサンプルは⁺ EDTAおよびその逆を含む溶出バッファーで溶出されています。

オプション：° Cビーズに添加する前に37に溶出バッファーのウォーミングは、歩留まりを高めることができる。

2. シェーカーで30分間室温でビーズを備えたソリューションをインキュベートする。静かに5分ごとに約チューブをタップしてビーズを混ぜる。
3. 3分1,500 rcfでビーズを遠心し、慎重に吸引によって結合タンパク質（サンプル3）のために上清の50μLを削除します。ビーズを邪魔しないようにしてください。
4. すべてのサンプル（すなわちホモジネート、非結合および結合蛋白質だけでなく、それらはまだビーズに結合）するタンパク質のローディングバッファーを追加。

注：、（特に非効率的な溶出の場合）溶出を最大限に対応する溶出バッファー（EDTAを含む、bufを追加するなどの50μLを追加する残りの結合蛋白質と、残りの結合タンパク質を除去するために4.3で説明した手順を繰り返しますを溶出するためのサンプルを加熱する前に、ビーズに）のCaCl ₂にバインドされているビーズのFER。

5。 SDS - PAGEおよびウェスタンブロット

SDS - PAGEを行い、陽性対照として、反対の条件でCAMを結合することが知られているタンパク質の関心とプローブのタンパク質に対するプロービングによるウェスタンブロットを用いて分析する。

6。代表的な結果

図2Bは、内因性の呉に比べてGFP -タグ付き呉のCAMの結合をテストするのCaM -プルダウンアッセイの例を示しています。そのためには、GFP - NGは一晩私たちの器官型海馬切片において過剰発現され、組織をホモジナイズした。ホモジネートを、Ca ^{2 +}またはEDTAのいずれかの存在下でカルモジュリン-セファロースビーズとインキュベートした。ホモジネート入力は、GFP - NGは、内因性NgとのCa ^{2 +} /カルモジュリン依存性キナーゼIIに加えて、発現していることを示しています。（CaMKII）。として内因性NG（図2Aに示す）の既知の結合に基づいて予想される、呉はCa ^{2 +（EDTA}結合タンパク質）の有無およびCa ^{2 +}の存在下で結合していない（図2B）で溶出されたGFPタグ。対照的に、制御、CaMKIIは、唯一のCa ^{2 +（}結合タンパク質）の存在下で溶出され、その不在（EDTA）にバインドされていないていた。これは、CAMのビーズが正しく機能していたと溶出が効率的であったことを示しています。最も重要なことは、GFP - ngは内因性のフォームに類似した方法でApoCaMに結合することをこのショーは、GFPタグが私たちの組換えタンパク質の機能を変化させなかったことを示唆している。

CaMとプルダウンアッセイの図1。概要
（A）組織ホモジネートは、細胞残渣を除去するためにスピンダウンされています。上清の約10％は、入力のサンプル（1）として取られます。残りの上清を別のために均等に分割されます条件と適切な試薬（CaCl ₂またはEDTA）は、これらの条件で結合テストするために追加されます。 （CaCl ₂またはEDTAのいずれかを含む）それぞれの上清には、それぞれ準備のCaM -セファロースビーズにロードされ、（B）結合できるようにインキュベートされる。未結合のタンパク質は削除されます（2）及び（C）結合蛋白質（3）結合として反対の条件を含む溶出バッファー（EB）を使用してビーズのオフ溶出される。これら3つのタンパク質試料のタンパク質組成はSDS - PAGEおよびウェスタンブロット分析を用いて分析することができます。

図2 A.）プルダウンアッセイの例ではCa ^{2 +}依存性のCaMの結合と溶出の回路図は、Ca ^{2 +}依存的にタンパク質の2種類のそのバインドCAMの与えられている。ニューログラニン（Ngは）バインドAPO - CaMとCaMKIIは、Ca ^{2 +} -リッチに結合するタンパク質を表しているタンパク質を表しますカルモジュリン。 CAMは、ホモジネートのタンパク質とのインキュベーションに先立って、その解離状態で表示されます。一度高いCa ^{2 +}濃度（2mM）をの条件下でインキュベートまたはCa ^{2 +}キレート剤、EDTA（2mMの）の存在下で、タンパク質は、それに応じてCAMにバインドします。 NgはないのCa ^{2 +}現在はほとんどがあるとしてEDTAの条件でCAMを結合し、Ca ^{2 +}の存在下でのCaM -セファロースビーズから溶出される。 CaMKIIは、しかし、 ^{カルシウム}の多量の存在下でCAMにバインドします⁺とCa ^{2 +を}キレート化された後に解離するでしょう。
B.）例CaMとプルダウンアッセイの結果。この図は、CAM -セファロースの予想される最終結果サンプルNgとCaMKII用プローブでプルダウンを示しています。内因性NgとGFP - NGの両方は、EDTAの存在下でCAMに結合したタンパク質のレーンに存在する。サンプルはそのNを示す、Ca ^{2 +}の存在下でカルモジュリンとインキュベートしているときにンがバインドされgは唯一のアポ- CAMをバインドします。私たちのポジティブコントロール、CaMKIIは、その一方で、唯一のCa ^{2 +}の存在下でカルモジュリンと結合する。

Discussion

提供するプロトコルは、CAM -結合蛋白質のCa ^{2 +} -依存性を調査するようにCAM -セファロースビーズを利用しています。多くのタンパク質は、Ca ^{2 +}依存的にカルモジュリンを結合する。これらの相互作用は、多くのシグナル伝達経路におけるカルモジュリン結合タンパク質およびそれらの重要な役割の数は与えられた非常に重要です。このプロトコルでは、CAM -セファロースビーズを、Ca ^{2 +}の存在下または非存在下で組織ホモジネートからのCaM結合タンパク質を分離するために使用されています。このシンプルなアプローチの結果は、タンパク質は、Ca ^{2 +}依存的にカルモジュリンと相互作用することができる方法の理解を深めるだろう。このアプローチは、結合試験、カラムクロマトグラフィーは、そのでCAM -セファロースビーズが溶液ではなく、マトリックスに固定されているタンパク質で、一般的に使用されるテクニックとは異なります。

列なしでプロトコルが少ない時間がかかるので、何もNEがないので、列の使用を避けることが、、このアプローチの利点の1つですedはカラムを平衡化または重力のフロースルーを待つ。その効率の美徳のために、プルダウンCAMはカラムクロマトグラフィーよりも大幅に組織を必要とし、試料調製の簡素化、蛋白質試料からの細胞残渣の分離としてのみダウン説明したプルダウンのCaM -セファロースのための短い遠心分離を必要とします。列は、追加の精製工程を必要とする可能性のある細胞残渣の自由なタンパク質サンプルを、必要とする。また、このアプローチは、他の利点は、それをキャプチャするためにbaitタンパク質と試料内の任意の相互作用するタンパク質に対する抗体を必要とするような共免疫沈降法などの方法、、プルダウンしています。実験中の抗体とタンパク質の間に貧しい人々の相互作用は、プルダウン非効率につながることができるようにbaitタンパク質を捕捉する抗体の使用は制限することができます。これらの潜在的な問題は、説明するのCaM -セファロースプルダウンを使用することで回避されます。

しかし、のような共免疫沈降し、カラムクロマトグラフィーアッセイは、CaMと-セファロースは、プルダウンex vivoでのCaM結合に制限されています。得られた結果は、CAMの相互作用のin vivoで現実に反映されないことがあります。例えば、翻訳後修飾は、多くの場合、タンパク質相互作用に影響を与える。これは相互作用のCaMとのIQドメイン⁵のPKCを介するリン酸化により抑制されるニューログラニン、の場合です。組織を均質化するようなキナーゼやホスファターゼなどの酵素が正常に細胞内の酵素から分離される標的タンパク質にアクセスできるようにすることで、例えば翻訳後修飾を変更することができます。 2つのタンパク質が正常に細胞内で交流する機会を持っていないというときにローカライズおよび/または区分化の中断にも束縛される可能性があります。これらの反応を最小限に抑えるために、それは準備と負荷の間に氷の上ですべてのサンプルを格納することが重要です。それは、ビーズとのインキュベーションはドンであることがこの理由でもあります4℃のe℃、ホスファターゼ阻害剤または他の酵素の阻害剤はまた、それらの効果を制限するために均質化バッファに追加することができます。

ポジティブコントロールは、この実験のために有意なエラーが実験中に発生していないことを確認することが重要です。また、条件の違いは、それはCa ^{2 +}の存在下および非存在下での異なるタンパク質を結合させることは、CAMのコンフォメーション変化を引き起こすのに十分であることを確認することができます^+。例えば、目的のタンパク質には信号がない場合は、それがロードエラーやその他の潜在的なエラーが原因である可能性があります。 （そのような提供された例ではCaMKIIなど）、他の条件で結合することが知られている別のタンパク質の検出では、潜在的なエラーを解決するのに役立ちます。低Ca ^{2 +}又はCa ^{2 +}キレート剤（例えば、EDTA）の濃度はまた、予想される結果と干渉する可能性があります。 EDTAが正常に使用されていますが、他のCa ^{2 +}キレート剤（例えばEGTA）はさらに高いconcentrat場合、より効果的かもしれないイオンは効果がありません。それは、それがバインドされるべきタンパク質の溶出を引き起こして、利用可能なのCaM -セファロースビーズを飽和させる可能性があるので過度のCaM結合タンパク質はまた、予期しない結果につながることができます。 GFP - NGの比較的少量のEDTAの条件で溶出されるため、これが示すように、サンプルで使用しています。ビーズとのインキュベーション前のタンパク質の定量は、これを改善するのに役立つことがあります。

実験全体でのCaM -セファロースビーズの適切な準備と取り扱いも成功に不可欠です。ビーズは簡単に誤って廃棄されるために上清を除去または2.0 mLのチューブの側面と上部に付着するか、実験中に失われる場合があります。これは、上清を除去し、徹底的な遠心分離直前に混合を確保しつつ、十分に注意して使用することで回避できます。試料が混合し、それは、CAM -セファロースビーズをチューブの両側に乾燥させることができるように遠心分離の間に座っせないようにしてみてください。念のため、再懸濁し、ビーズやROなどすぐに遠心分離の前にウェットビーズに管の周囲のテートソリューション。結合および溶出のインキュベーションの両方の間にビーズとサンプルを徹底的に浸漬は、非常に重要です。ビーズとサンプルの適当な混合することなく、結合および溶出は、おそらく非効率になります。

このプロトコルは、用途が広く、簡単に他の目的のために改正することができます。観察された場合に切り捨てまたは変異タンパク質でこの実験を実行すると、地域に関する情報（s）と⁺ -依存性のCaM結合し、Ca ²の重要なタンパク質の残基を明らかにすることができます。 NGの場合には、我々は、GFP - ngは、内因性のタンパク質と同様に、唯一のCa ^{2 + 8}の不在下でカルモジュリンと結合することを示すことができた。さらに、そのIQ -ドメインを変更することは、このタンパク質のこの結合、異なる突然変異のこの機能を探索するには呉のCAMとの相互作用だけでなく、翻訳後修飾の機能の性質を理解するのに役立つ、このinteraを変更するどのction。セリンの場所（S36DまたはNG - SD）でphosphomimicアスパラギン酸およびCaMへの結合を防ぐために、IQレスNG：我々は、NG - CAMの結合二つの異なる変異体を使用することの重要性を試験した。我々はまた、さらにCa ^{2 +}の存在下で結合滞在、CAMとの結合強化したこと（NG - SFAW）変異体を生成する。最後に、我々は内因性の呉に似てのCa ^{2 +}に依存する形でCAMに結合するが、プロテインキナーゼC（PKC）のリン酸化を防ぐ、非リン酸化可能な変異体（NG - SA）を使用。 CaMとプルダウンアッセイは、これらの種々の変異体の機能をテスト支援し、シナプス機能⁸のNG - CaMの結合の重要性を示す助けとどのように呉リン酸化は微調整するシナプス可塑性^15をすることができます。

さらに、カルモジュリン結合タンパク質に結合するタンパク質を溶出することができます。これは間接的にCAMを結合するタンパク質を決定する際にこのアッセイのさらなるアプリケーションを提供することができます。それは、これらの他のインターアクトの研究を可能にイオンとCaMとその結合パートナーの他の潜在的な下流の影響。

要約では、CaMとプルダウンアッセイでは、CAM -タンパク質相互作用のCa ^{2 +} -依存性を調査するために効率的かつ効果的な方法を提供します。これは、CAM -タンパク質相互作用を研究する方法と、別の突然変異または変更は、これらの相互作用に影響を与える可能性のある重要なツールとなることができます。これは、Ca ^{2 +} / CaMのシグナル伝達経路の調節を探求することに役立つことがあります。さらに、我々は、Ca ²で混乱⁺ / CaMのシグナルによって引き起こされる病態を探るためにこれを使用することができます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calmodulin-Sepharose beads	GE Healthcare	17-0529-01
Anti-CamKII alpha	Sigma-Aldrich	C6974
Anti-neurogranin	EMD Millipore	07-425
Gel Loading Pipet Tips	Fisher Scientific	02-707-138	Use for aspiration of supernatants
Microcentrifuge tubes (2.0 mL)	Fisher Scientific	05-408-146	Use for all steps involving calmodulin-sepharose beads