Summary
Un modo rapido per condurre immunocolorazione cuore embrionale di zebrafish è descritto. Rispetto alla intero approccio immunostaining monte, questo metodo aumenta notevolmente la penetrazione degli anticorpi, che permette di ottenere immagini ad alta risoluzione che mostrano strutture cellulari / subcellulari nel cuore entro un tempo di elaborazione molto più ridotto.
Abstract
Zebrafish embrione diventa un popolare modello vertebrato vivo per lo studio dello sviluppo delle malattie cardiache e cuore umano grazie alla sua vantaggiosa embriologia e genetica 1,2. Circa 100-200 embrioni sono disponibili ogni settimana da una singola coppia di pesci adulti. Gli embrioni che si sviluppano in utero trasparente ex li rendono ideali per la valutazione dei difetti cardiaci 3. L'espressione di un gene può essere manipolato tramite morfolino tecnologia o RNA iniezione 4. Inoltre, in avanti schermi genetici hanno già generato una lista di mutanti che interessano diverse prospettive di cardiogenesis 5.
Tutto immunocolorazione mount è una tecnica importante in questo modello animale per rivelare il pattern di espressione della proteina bersaglio di un particolare tessuto 6. Tuttavia, le immagini ad alta risoluzione che possono rivelare le strutture cellulari o subcellulari sono stati difficili, principalmente a causa della Locat fisicoione del cuore e la scarsa penetrazione degli anticorpi.
Qui vi presentiamo un metodo per affrontare questi colli di bottiglia da dissezionare il cuore e poi condurre il processo di colorazione sulla superficie di un vetrino da microscopio. Per prevenire la perdita dei campioni piccolo cuore e da facilitare la manipolazione soluzione, abbiamo ristretto il cuore dei campioni all'interno di un cerchio sulla superficie del microscopio diapositive tratte da una penna immEdge. Dopo la colorazione, i segnali di fluorescenza può essere osservata direttamente da un microscopio composto.
Il nostro nuovo metodo migliora significativamente la penetrazione per gli anticorpi, perché un cuore da un pesce embrionale costituito solo da pochi strati di cellule. Immagini di alta qualità dal cuore intatto può essere ottenuto in tempi molto ridotti per la processione embrioni di zebrafish anni dal giorno 2 al giorno 6. Il nostro metodo può essere potenzialmente esteso a macchia di altri organi sezionati sia da zebrafish o altri piccoli animali.
Protocol
1. Preparazione di diapositive e da camera umidificata
- La camera umidificata può essere fatto da una scatola, come una scatola di punta svuotato. Avvolgere sia la camera e la copertura con fogli di alluminio per proteggere i campioni dalla luce.
- All'interno della camera, mettere un mucchio di tovaglioli di carta bagnata per mantenere l'umidità all'interno della camera, che impedirà i campioni cuore si asciughi. Impostare un micropiastre piccolo sulla sommità del tovagliolo di carta come una rastrelliera per le diapositive.
- Disegnare sia le linee o cerchi sulla superficie di un vetrino da microscopio utilizzando la penna immEdge per fare i pozzi per i campioni del cuore con una dimensione di circa 5x5 mm. Lasciate asciugare le diapositive.
- Mettere i vetrini in camera umidificata e aggiungere 50ul formaldeide fresca 4% in ogni pozzetto.
2. La dissezione del cuore embrionale
- Anestetizzare l'embrione di pesce in acqua uovo E3 7 contenente 0,4% tricaine per circa 1 minuto fino a quando il movimento del corpo smettere di pesce ma hanno ancora cuore normalebattere.
- Mettere un vetrino da microscopio concavo sul palco di un microscopio di dissezione. Trasferire gli embrioni al pozzo concavo.
- Regolare la combinazione luce del microscopio da dissezione per rivelare chiaramente il cuore. A seconda delle preferenze personali, potrebbe essere uno dei due campi scuri o DIC-come condizione di luce polarizzata.
- Pulire due siringhe da insulina con il 75% di etanolo, quindi asciugare.
- Regolare il microscopio a dissezione maggiore ingrandimento e mettere a fuoco sul cuore. Fisicamente fissare un embrione con l'inserimento di una punta ago nel tuorlo-somite confine vicino alla testa. Inserire un altro primo ago per la regione del cuore e tirare fuori il cuore in fretta. Se il cuore non è totalmente separata dalla embrione, tagliare il tessuto rimanente collegato tra il cuore e il tuorlo.
- Regolare il microscopio a basso ingrandimento e mettere a fuoco sul cuore separati. Utilizzare un pipetteman 10μl e impostarlo al volume 1ml. Applicare la punta del pipetteman per disegnare una o toccare ilcuore del campione, in modo che il cuore isolato sarà all'interno o attaccato alla superficie della punta.
- Immergere la punta della pipetta nella soluzione di formaldeide al 4% sui vetrini preparati e premere il pistone pipetta per rilasciare il cuore nella soluzione. La tensione di superficie dell'acqua aiuta anche a liberare il cuore dalla punta della pipetta alla soluzione. Mettere meno di 3 cuori in ogni pozzetto.
3. Immunocolorazione
- Chiudere la camera e metterlo su un agitatore con un movimento dolce dondolio. Fissare il campione di cuore per 20 minuti a temperatura ambiente.
- Asciugare l'acqua sulla parte posteriore delle diapositive e mettere le diapositive sul palco di un microscopio per dissezione tampone scambio.
- Intingere nell'acqua la punta di un pipetteman 10μl in una zona vuota di ogni bene e tenere la punta per quanto possibile dai campioni del cuore. Prendere precauzioni per evitare il cuore allegando alla punta, dato che il cuore può muovere con il flusso dell'acqua quando la soluzione viene disegnato in punta. Cambiarela localizzazione punta, se necessario.
- Smaltire la soluzione su un tessuto ed evitare la produzione di eventuali bolle nella punta perché il campione cuore si perde facilmente in presenza di bolle d'aria. Mantenere i campioni cuore parzialmente a secco per un breve periodo può aiutare i cuori rimanere attaccati alle diapositive.
- Aggiungere 50μl PBST per coprire il cuore del campione e incubare nella camera umidificata in un movimento a dondolo lento per 5 minuti. Ripetere il risciacquo una volta. Dopo questo passo, il cuore dei campioni possono essere conservati nella camera umidificata fino a 1 settimana a 4 ° C.
- Blocca il campione di cuore con siero di pecora 10% in PBST per 1 ora a temperatura ambiente.
- Incubare il campione cuore con anticorpi primari, come la diluizione 1:200 di β-catenina anticorpo e la diluizione di 1:200 MEF2 anticorpo specifico, nel 10% di siero ovino / PBST per 1 ora a temperatura ambiente.
- Lavare il campione cuore con PBST tre volte (5 min.) A temperatura ambiente.
- Incubare il campione con secondarioanticorpi, come ad esempio 1:1000 diluizione di Alexa-tagged anti-mouse e / o anticorpi anti-coniglio, in PBST per 0,5 ore.
- Lavare i campioni cuore con PBST tre volte (5 min.) A temperatura ambiente.
4. Imaging
- Rimuovere PBST e aggiungere 10 microlitri di montaggio media in ciascun pozzetto. Rock the camera per diversi minuti fino alla soluzione diviene limpida.
- Rimuovere la maggior parte del mezzo di montaggio e coprire tutti i pozzi in una diapositiva con un bicchiere di copertura microscopio (24x50).
- Pesce cuore immagine utilizzando Zeiss Axioplan 2 microscopio dotato di ApoTome (Carl Zeiss).
5. Rappresentante Risultati
Un esempio di un'immagine che rivela membrana e nuclei di tutti i cardiomiociti zebrafish è mostrato in fig. 1. anticorpi mef2c e β-catenina sono stati utilizzati insieme per colorare i campioni cuore sezionato da 52 embrioni di pesce zebra HPF. Mentre le macchie di anticorpi mef2c i nuclei di cardiomiociti, β-cateninaanticorpi rivela il confine di ogni 8-10 cellule. Regolando la fase del microscopio composto, le immagini dei campioni del cuore può essere regolata per lo stesso orientamento, che permetterà l'osservazione di curvatura esterno e curvatura interno nel cuore 11. Il numero totale dei cardiomiociti, le dimensioni delle cellule cardiomiociti, e la circolarità può essere misurata.
Un altro esempio che rivela la struttura del sarcomero di un cuore embrionale è mostrato in fig. 2. Abbiamo eseguito immunostaining con F59, un anticorpo miosina, in un cuore sezionato embrionale. La rete miofibrilla in un cuore tutto embrionale può essere chiaramente rivelato a basso ingrandimento, mentre la band striato di filamenti spessi può essere rivelato a più alto ingrandimento (Fig. 2) 6.
Figura 1. Immunocolorazione di MEF2 (rosso) e β-catenina (verde) per mostrare i nuclei e outlines di cardiomiociti in un ventricolo zebrafish. Barra di scala = 10μm
Figura 2. Immnostaining della miosina per mostrare il filamento spesso in un ventricolo zebrafish sia a basso ingrandimento (A) o ad alto ingrandimento (B). Barra di scala = 10μm
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Discussion
Rispetto ai metodi classici montare tutto immunostaining, il nostro metodo ha i seguenti vantaggi. In primo luogo, molto più forte dei segnali fluorescenti possono essere congruenti a causa di una migliore penetrazione. Nel metodo tutto immunostaining monte, il tessuto cutaneo denso che circonda il cuore ha ridotto significativamente la penetrazione di molti anticorpi, nel fondo di elevata in tutto il corpo. Questo problema è particolarmente grave per gli embrioni di età superiore ai 3 giorni di post-fertilizzazione (DPF). Al contrario, il cuore sezionato solo consistono in un paio di strati di cellule, rendendo la penetrazione molto meglio. In secondo luogo, a causa della penetrazione molto migliorata, l'intero processo di immunoistochimica può essere ridotto da 1 giorno a poche ore diverse. Siamo riusciti a ridurre il tempo di incubazione da 1 ora a 30 minuti per alcuni anticorpi come actinina, Integin-linked chinasi (Ilk) e β-catenina anticorpi specifici. In terzo luogo, immagini ad alta risoluzione possono essere sistematicamente ottenuti da cuori intattoa rivelare informazioni cellulare / subcellulare. A causa della localizzazione del cuore all'interno del sacco pericardico che si trova accanto al tuorlo, più lenti di ingrandimento obiettivo non può essere usato per embrioni immagine intatta. Pertanto, il cuore dovrà essere sezionato se le immagini di un cuore intatto sono necessari. Tuttavia, detergenti come tritone-x-100 che vengono utilizzati per migliorare la penetrazione nell'intera procedura colorazione montare indebolire gli embrioni. Di conseguenza, i cuori si rompono facilmente durante la procedura di dissezione. Al contrario, un cuore vivo è molto più forte, che può essere facilmente separato dal suo tessuti vicini. Pertanto, la morfologia intatte sono più facilmente mantenuta utilizzando il metodo proposto. Anche se sezionare un cuore piccolo pesce zebra può apparire impegnativo, la maggior parte le persone possono facilmente effettuare questa procedura dopo diverse pratiche.
Abbiamo utilizzato questo metodo per colorare i cuori di età compresa da 2 a 6 dpf dpf. A causa della sua posizione fisica, il cuore anche da conteIer in scena gli embrioni sono difficili da sezionare. Resta da stabilire se questo metodo può essere regolata per larva o cuori adulti. Vale la pena sottolineare che i danni locali al cuore potrebbe comportare durante il processo di dissezione, che coinvolge la forza fisica. Questa complicanza può essere superato con la valutazione cuori diversi, e quindi selezionando le immagini con risultati costanti e la migliore morfologia mantenuto.
A causa di risoluzione molto migliore, questo metodo può essere utilizzato per rivelare strutture sia cellulare e subcellulare di un cuore zebrafish via di sviluppo. Per esempio, abbiamo già applicato questo metodo per contare il numero totale dei cardiomiociti, per quantificare dimensioni singoli cardiomiociti, per valutare la proliferazione e l'apoptosi, e per svelare il processo di assemblaggio sarcomero 6,12. Insieme con unica strumenti genetici in zebrafish, l'attuale metodo faciliterà lo studio della biologia cardiovascolare in questo modello in vivo.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo Beninio Jomok per il suo aiuto in zebrafish allevamento. Questo lavoro è finanziato dal NIH HL81753.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| tricaine | Research organics | 3007T | |
| Formaldehyde | Polysciences, Inc. | 04018 | |
| Insulin syringe | BD Biosciences | 329461 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Anti-β-catenin antibody | Sigma-Aldrich | C7207 | |
| Anti-Mef2c antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC313 | |
| F59 | Zfin | ||
| Anti-α-actinin antibody | Sigma-Aldrich | A7811 | |
| Anti-Ilk antibody | Cell Signaling Technology | #3862 | |
| Alexa fluor 568 Goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11011 | |
| Alexa fluor 488 Goat anti mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | |
| Mounting medium for fluorescence | Vector Laboratories | H-1200 | |
| ImmEdge pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Poly-L-lysin coated slides | Electron Microscopy Sciences | 63410-01 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-543-D | |
| Concaved microscope slides | Fisher Scientific | 7-1305-8 | |
| Dissection microscope | Leica Microsystems | ||
| Compound microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioplan2 | |
| ApoTome | Carl Zeiss, Inc. | ||
| PBST: 1 x PBS 0.5% Triton-X 100 |
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| 25X Tricaine: 400 mg Tricaine 97.9 mL ddH2O 2.1 mL (1M Tris pH9) Adjust pH to 7.0 |
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References
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