Summary
ゼブラフィッシュ胚の心臓の免疫染色を実施する迅速な方法が説明されています。全体のマウント免疫染色の手法に比べ、この方法は劇的に非常に低下処理時間内に心臓の細胞/細胞内構造を明らかに高解像度の画像を得ることができる抗体の浸透を、増加させる。
Abstract
ゼブラフィッシュの胚は、心臓の開発とその有利な発生学と遺伝学1,2のために人間の心の病気を研究するためのin vivoで脊椎動物のモデルで人気となる。約100-200胚は、成魚の単一ペアから毎週容易に入手可能である。 EX子宮を開発透明な胚は、心臓の欠陥3を評価するために最適です。任意の遺伝子の発現は、モルホリノ技術またはRNAの注射4を介して操作することができます。また、前方に遺伝子スクリーニングは、すでに心臓発生5の様々な観点に影響を与える変異体のリストを生成している。
全体のマウント免疫染色では、特定の組織6に標的タンパク質の発現パターンを明らかにするためには、この動物モデルにおいて重要なテクニックです。しかし、携帯電話または細胞内構造を明らかにすることができる高解像度の画像は、主に物理的なlocatに、難しい状態が続いている心と抗体のほとんど通過のイオン。
ここで、我々は最初の心臓を解剖し、顕微鏡スライドの表面に染色処理を行うことにより、これらのボトルネックに対処する方法を提示する。小さな心臓サンプルの損失を防ぐために、ソリューションの取り扱いを容易にするために、我々はimmEdgeのペンによって描画される顕微鏡の表面をスライド上に円の中で心臓のサンプルを制限。染色後、蛍光シグナルを直接複合顕微鏡で観察することができます。
胚魚の心臓は、わずか数細胞層で構成されて以来、私たちの新しいメソッドは、抗体の浸透を大幅に向上します。無傷の心からの高品質の画像が2日から6日に歳のゼブラフィッシュ胚のために多くの削減行列の時間内に得ることができます。我々の方法は、潜在的にゼブラフィッシュや他の小動物のいずれかから切除した他の器官を染色するために拡張することができます。
Protocol
1。スライドの準備と加湿チャンバー
- 加湿チャンバーを空にチップボックスのようなボックスから行うことができます。チャンバーと光から試料を保護するためにアルミホイルでカバーの両方を包みます。
- チャンバー内に、乾燥から心臓サンプルを防ぐことがチャンバ内の湿度を維持するために湿紙タオルの山を置く。スライド用ラックとしてペーパータオルの上に小さなプレートを設定します。
- 5 × 5 mm程度の寸法と心臓のサンプル用井戸を作るためにimmEdgeのペンを使って顕微鏡スライドの表面に線や円のいずれかを描く。スライドを乾燥させて。
- 加湿チャンバー内のスライドを入れて、各ウェルに50UL新鮮な4％のホルムアルデヒドを追加。
2。胚の心臓の解剖
- 魚止めのボディの動きまで、約1分間0.4％tricaineを含むE3卵の水7で魚の胚を麻酔がまだ正常な心を持っている鼓動。
- 解剖顕微鏡のステージ上に凹の顕微鏡用スライドを置く。よく凹部に胚を移す。
- 明らかに心を明らかにするために解剖顕微鏡の光の組み合わせを調整します。個人の好みに応じて、暗視野やDICのような偏光状態のいずれかである可能性があります。
- その後、乾燥、75％エタノールで2つのインスリン注射器を清掃してください。
- 心臓より高い倍率と焦点に解剖顕微鏡を調整します。物理的に頭部に近い卵黄体節境界に1つの針の先端を挿入することによって胚を修正。心臓領域に別の針の近くに挿入し、すぐに心を引き出します。心臓が完全に胚から分離されていない場合は、心臓と卵黄の間に、残りの接続組織を切断。
- 分離された心臓の低倍率と焦点に顕微鏡を調整します。 10μlのpipettemanを使用し、1μlの音量に設定します。どちら描画または触れるためにpipettemanの先端を適用する単離心臓の内でまたは先端の表面に付着するのどちらかになるように心はサンプル、。
- 準備されたスライド上の4％ホルムアルデヒド溶液でピペット先端を浸して溶液中に心を解放するためにピペットピストンを押し下げる。水面の表面張力は、溶液にピペットチップから心を解放するのに役立ちます。各ウェルの3心より小さいを置く。
3。免疫染色
- チャンバーを閉じ、穏やかなロッキング運動でシェーカー上に置いた。室温で20分間心臓のサンプルを修正。
- スライドの裏面に水を拭いてから、交換するバッファのための解剖顕微鏡のステージにスライドを置く。
- 各ウェルに空の領域に10μlのpipettemanから先端を浸し、心臓のサンプルから可能な限り先端を保つ。ソリューションを先端に描画されるときに心が水の流れで移動する可能性がありますので、先端に装着、心臓を避けるために注意してください。変更必要に応じて先端のローカライズ、。
- 組織上に溶液を処分すると心臓のサンプルが容易に気泡の存在下で失われているので、先端に気泡を生成することは避けてください。短い時間のために心臓のサンプルは部分的に乾燥しておくこと心がスライドに付着したままでいることができます。
- 心臓のサンプルをカバーし、5分間ゆっくりと揺動運動の加湿チャンバー内でインキュベートする50μlのPBSTを追加。リンスつのより多くの時間を繰り返します。このステップの後、心臓のサンプルは4℃加湿チャンバーまでの1週間℃で保存することができます。
- 室温で1時間、PBSTで10％のヒツジ血清で心臓のサンプルをブロックする。
- 室温で1時間10％ヒツジ血清/ PBSTで、このようなβ-カテニン抗体の1:200希釈とMEF2特異抗体の1:200希釈などの一次抗体、と心臓のサンプルをインキュベートする。
- 室温でPBST三回（5分。ごと）で心臓のサンプルを洗浄してください。
- 二次でサンプルをインキュベートするPBSTで0.5時間のためのそのようなアレクサタグ付き抗マウスおよび/または抗ウサギ抗体の1:1000希釈のような抗体を、、。
- PBSTで3回心臓サンプルを洗う（5分。ごと）室温での。
4。イメージング
- PBSTを取り外し、各ウェルに10μlの封入剤を加える。溶液が透明になるまで数分間チャンバーを揺らし。
- 封入剤のほとんどを削除し、顕微鏡のカバーガラス（24x50）とのスライドで井戸のすべてをカバーしています。
- ツァイスAxioplan 2顕微鏡を用いて画像の魚の心臓は、線分（カールツァイス）を装備。
5。代表的な結果
すべてのゼブラフィッシュの心筋細胞の膜と核を明らかに画像の例を図に示します。 1。 MEF2Cとβ-カテニン抗体は52 HPFのゼブラフィッシュの胚から摘出心臓の試料を染色するために一緒に使用されていました。一方MEF2C抗体染色の心筋細胞の核、β-カテニン抗体は、各セル8-10の境界を明らかにする。複合顕微鏡のステージを調整することにより、心臓のサンプルの画像は、外側の曲率と心臓11の内側の曲率の観察を可能にする同じ方向に調整することができます。合計心筋細胞の数、心筋細胞のサイズ、および真円度を測定することができます。
胎児心臓のサルコメア構造を外部にもらす別の例を図に示します。 2。我々は解剖胎児心でF59、ミオシンの抗体を用いて免疫染色を行った。太いフィラメントの紋帯が高い倍率（図2）6で明らかにすることができますながら、全体の胎児心における筋原線維のネットワークを明確に、低倍率で明らかにすることができる。
核とOUTLを表示するMEF2（赤）とβ-カテニン（緑）の図1。免疫染色ゼブラフィッシュ心室の心筋細胞のINES。スケールバー=10μmの
どちらかの低倍率（）または高倍率（B）でゼブラフィッシュ脳室に太いフィラメントを表示するミオシンの図2。Immnostaining。スケールバー=10μmの
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Discussion
古典的な全体のマウント免疫染色の方法に比べ、本手法は次のような利点があります。最初に、はるかに強い蛍光シグナルが一貫して改善された浸透のために取得することができます。全体のマウント免疫染色法では、心臓を取り巻く濃い皮膚組織は大幅に全身に高グラウンドで、その結果、多くの抗体の浸透を減少させた。この問題は、3日後に受精（DPF）より古い胚には特に厳しいです。対照的に、解剖心ははるかに良い浸透をレンダリングする、いくつかの細胞層で構成されています。第二に、ために多くの改善浸透、免疫染色のプロセス全体は、1日からわずか数時間に短縮することができます。我々は成功し、1時間からこのようなアクチニンなどのいくつかの抗体のための30分にIntegin結合キナーゼ（ILK）、およびβ-カテニン特異的抗体をインキュベーション時間を短縮している。第三に、高解像度の画像は、一貫して無傷の心から得ることができます。セルラー/細胞内の情報を明らかにする。ため卵黄の横にある心膜嚢の内部心臓の局在から、より高い倍率の対物レンズは、画像はそのまま胚を使用することはできません。したがって、心はそのまま心の画像が必要な場合解剖する必要があります。しかし、このような胚を弱める全体マウント染色の手順で浸透を向上させるために使用されているトリトン- X - 100などの界面活性剤。結果として、心は容易に解剖の手順の間に分割されます。対照的に、ライブ心は容易にその隣接組織から分離することができる、はるかに強いです。したがって、完全な形態は、より容易に提案手法を用いて維持されます。小さなゼブラフィッシュの心臓を解剖すると、厳しいように見えることがありますが、ほとんどの人は簡単にいくつかのプラクティスの後にこの手順を行うことができます。
我々は2 DPF〜6 DPFから歳の心を染色するためにこのメソッドを利用してきた。その物理的な場所、さらに伯爵からの心のためにIERは、胚を細かく分析するのが困難な上演。それは、このメソッドは幼虫、大人の心のために調整することができるかどうかを決定されていない。それは、心臓への局所的損傷が物理的な力を伴う解剖のプロセス、中に生じる可能性があることを指摘する価値があります。この合併症は、いくつかの心を評価し、一貫性のある結果と最高の維持形態で画像を選択することによって克服することができます。
ために多くの改良された解像度で、この方法は開発ゼブラフィッシュの心臓の細胞と細胞内構造の両方を明らかにするために使用することができます。例えば、我々はすでに増殖とアポトーシスを評価するために、個々の心筋細胞の大きさを定量化するために、心筋細胞の総数をカウントする、とサルコメア組立6,12のプロセスを明らかにするためにこのメソッドを適用している。一緒にゼブラフィッシュのユニークな遺伝的なツールと、本方法は 、in vivoモデルでは、この中の心臓血管生物学の研究を容易にするでしょう。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
我々は、ゼブラフィッシュ畜産で彼の助けのためにBeninio Jomokに感謝。この作品は、NIH HL81753によって運営されている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| tricaine | Research organics | 3007T | |
| Formaldehyde | Polysciences, Inc. | 04018 | |
| Insulin syringe | BD Biosciences | 329461 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Anti-β-catenin antibody | Sigma-Aldrich | C7207 | |
| Anti-Mef2c antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC313 | |
| F59 | Zfin | ||
| Anti-α-actinin antibody | Sigma-Aldrich | A7811 | |
| Anti-Ilk antibody | Cell Signaling Technology | #3862 | |
| Alexa fluor 568 Goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11011 | |
| Alexa fluor 488 Goat anti mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | |
| Mounting medium for fluorescence | Vector Laboratories | H-1200 | |
| ImmEdge pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Poly-L-lysin coated slides | Electron Microscopy Sciences | 63410-01 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-543-D | |
| Concaved microscope slides | Fisher Scientific | 7-1305-8 | |
| Dissection microscope | Leica Microsystems | ||
| Compound microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioplan2 | |
| ApoTome | Carl Zeiss, Inc. | ||
| PBST: 1 x PBS 0.5% Triton-X 100 |
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| 25X Tricaine: 400 mg Tricaine 97.9 mL ddH2O 2.1 mL (1M Tris pH9) Adjust pH to 7.0 |
|||
References
- Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3, 311-340 (2002).
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