Summary
Aerial plante organer er beskyttet av skjellaget, en supramolecular biopolyester-voks montering. Vi presenterer protokoller for å overvåke selektiv fjerning av epi-og intracuticular voks fra tomat frukt neglebånd på molekylære og mikro skalaer med solid-state NMR og atomic force mikroskopi, henholdsvis, og å vurdere kryssbinding kapasitet av konstruerte cuticular biopolyesters.
Abstract
Skjellaget, en hydrofob beskyttende lag på luftig deler av landplanter, fungerer som en allsidig defensiv barriere til ulike biotiske og abiotiske stressfaktorer og regulerer også vannføringen fra det ytre miljø. 1 A biopolyester (cutin) og langkjedede fettsyrer ( voks) danner den viktigste strukturelle rammen av skjellaget, den funksjonelle integritet cuticular lag avhenger av ytre 'epicuticular' lag samt blanding bestående av cutin Biopolymer og 'intracuticular' Choice voks to her, beskriver vi en omfattende protokoll. å trekke voks uttømmende fra kommersiell tomat (Solanum lycopersicum) frukt neglebånd eller fjerne epicuticular og intracuticular voks sekvensielt og selektivt fra cuticle kompositt. Metoden for Jetter og Schäffer (2001) ble tilrettelagt for trinnvis uttak av epicuticular og intracuticular voks fra frukten neglebåndet. 3,4 å overvåkeProsessen med sekvensiell voks fjerning, solid-state cross-polarisering magic-angle-spinning (CPMAS) 13 C NMR spektroskopi ble brukt parallelt med atom kraft mikroskopi (AFM), som gir molekylære nivå strukturelle profiler av bulk materialer supplert med informasjon om mikroskala topografi og ruhet av cuticular overflater. Å vurdere tverrbindinger egenskapene avvoksede neglebåndene fra dyrket villtype og single-genet mutante tomat frukt, ble MAS 13 C NMR brukt for å sammenlikne de relative andeler av oksygenrikt alifatisk (CHO og CH 2 O) kjemiske moieties.
Uttømmende dewaxing ved trinnvis Soxhlet ekstraksjon med et panel av løsemidler med varierende polaritet gir et effektivt middel for å isolere voks moieties basert på hydrofobe egenskapene deres alifatiske og aromatiske bestanddeler, og samtidig bevare den kjemiske strukturen i cutin biopolyester. Den mekaniske utvinning av epicuticular voks og Selective fjerning av intracuticular voks, da overvåket av komplementære fysiske metoder, gir en enestående mulighet til å undersøke cuticle montering: denne tilnærmingen avslører supramolecular organisasjon og strukturell integrasjon av ulike typer voks, arkitekturen av cutin-voks matrise, og den kjemiske sammensetningen av hver bestanddel. I tillegg avslører solid-state 13 C NMR forskjeller i de relative antallet CHO og CH 2 O kjemiske moieties for villtype og mutant røde modne tomater frukt. NMR teknikker tilby eksepsjonelle verktøy for å fingeravtrykk den molekylære strukturen av cuticular materialer som er uløselige, amorfe, og kjemisk uensartet. Som en ikke-invasiv overflate-selektiv avbildningsteknikk, møblerer AFM et effektivt og direkte måte å undersøke den strukturelle organiseringen av cuticular forsamlingen på nm-mikrometer lengde skala.
Protocol
1. Enzymatisk Isolering av Tomato hårfibrene 5
- Plasser flere kommersielle eller dyrket tomater i en bolle. Skrell huden fra frukt i store seksjoner; forkaste den indre skall vev. Vask tomatene skins med avionisert vann og bevare dem under vann i et begerglass.
- Forbered en 50 mM pH 4,0 natriumacetat buffer (ved 31 ° C) ved å sette 1,22 g natriumacetattrihydrat (M r. 136,08 g / mol) og 2,34 ml iseddik (17.485 M) i et begerglass, og legger 200 ml avionisert vann, og deretter justere pH til 4,0 ved 31 ° C. Forbered en blanding som inneholder 4 ml pectinase (EF 3.2.1.15; 10 U ml -1, TCI-Amerika), 0,2 g Cellulase (EF 232.734.4; 1.3 enheter / mg solid, Sigma Aldrich), og 13 mg NaN 3, og deretter legge 196 ml natriumacetat buffer til enzymet blandingen å få 200 ml av den endelige enzymet cocktail. 5 Helt senk skrelt tomat huden i enzymet cocktail og inkuberved 31 ° C i 24 timer med konstant risting (G24 Environmental Inkubator Shaker, New Brunswick Scientific Co).
- Samle tomat skins med et kjøkken sil eller Büchner trakt og vask dem med avionisert vann. Deretter plasserer dem i et vakuum ovn ved romtemperatur i en time. Bevar de tørkede tomater skins i en merket og avsluttes flaske for senere avvoksing prosedyrer.
2. Uttømmende avvoksing av Soxhlet Extraction 6
- Utstyret som brukes til uttømmende dewaxing består av en varmekilde (oppvarming mantelen og Variac controller), rund bunn kolbe for en løsemiddel reservoar, Soxhlet kjøkkenvifte, sintret-glass fingerbøl eller engangs utvinning fingerbøl, anti-bumping chips og en kondensator (se fig. 1). Merk at den trange vannlåsen armen (deler 6 og 7 i fig. 1) er svært delikat og utsatt for brekkasje, som krever forsiktig håndtering.
- Sett 0,5 til 1 g tomat hud (fås itrinn 1). i en morter, og male prøven til en grov pulver med en stampe med mindre prøvene skal brukes til AFM målinger (§ 5). Fyll en sintret-glass eller disponibel fingerbøl omtrent halvveis med prøven og bruke pinsett for å plassere den nøye på bunnen av utvinning kolonnen.
- Fest kondensatoren og pakk den i aluminiumsfolie. Varm metanol løsemiddel (ACS karakteren) i nærvær av noen anti-bumping chips til det koker forsiktig og refluxes på veggene i kolben. Dekk løsemiddel reservoaret med både glassull og aluminiumsfolie. Sjekk prosessen for en time, skjer justere Variac spenningen slik at reservoaret akkumuleres om en dråpe per sekund og snylte innenfor Soxhlet apparatet når fingerbøl er full.
- Fortsett utpakkingen i 12 timer, senk varmen mantelen og la apparatet avkjøles. Fjern kjøkkenvifte og reservoaret som en enhet til å disponere over løsemiddel. Bruk tweezers å heve fingerbøl til like under halsen på utvinning kolonnen, drenere overflødig væske fra det, og plasser fingerbøl på en ren overflate. Vipp utvinning kolonnen for å tillate snylte inn i kolben under. Koble kolben og helle avfallet inn i en merket avfall løsemiddel stikkontakten.
- Gjenta trinn 2.3 og 2.4 for påfølgende løsemidler av gradvis minkende polaritet, f.eks, kloroform og heksan i 12 timer i hvert enkelt tilfelle.
- La tomat cutin prøven tørke inne i fingerbøll, enten ved å blåse en strøm av nitrogen gass over det eller ved å plassere den i et vakuum ovn ved romtemperatur. Endelig måle massen av tørr prøve og oppbevare det ved romtemperatur i en skrue-top krukke forseglet med Parafilm.
3. Selektiv Isolering av Epicuticular og Intracuticular Waxes 3,4
- Først vaske hele tomater (en egen gruppe med tomater fra det som er beskrevet i en.) Med destillert vann. Tørk dem med papeh håndklær og Kimwipes, og plassere dem demme ned på et stykke aluminiumsfolie.
- Lakkere hele tomatene med 120% (w / w, masseforhold) gum arabic vandig løsning i en top down mote og la om en time for gum arabic til tørk på frukten hud og etterlater en tynn film. Fjern denne filmen ved hjelp av pinsett, være forsiktig for ikke å punktere tomat huden. Gjenta prosedyren en gang til.
- Legg filmene til hetteglass som inneholder 01:01 (v / v) kloroform-vann og bland i tre minutter. Etter kraftig omrøring og fase separasjon, pipetter ut kloroform fraksjoner og fordampe dem i separate avdekket ampuller, forlater epicuticular voks. Tomatene forblir fysisk intakt. Dypp dem i kloroform for to minutter ved romtemperatur og samle intracuticular voks etter fordamper væsken. Nå skrelle tomatene og behandle dem enzymatisk (med Cellulase og pectinase i natriumacetat buffer) for å fjerne cellulose og pektin, henholdsvis (som beskrevet i
- Om ønskelig utfører uttømmende dewaxing på disse enzymatisk isolerte neglebåndene med Soxhlet ekstraksjon (se trinn 2), ved hjelp av tre løsemidler av forskjellig polaritet (metanol, kloroform, og heksan, henholdsvis).
4. Molekylær karakterisering av Tomato Fruit Cutin av Cross-polarisering Magic-vinkel Spinning Solid-state Nuclear Magnetic Resonance (CPMAS ssNMR) 6
- Place 4-6 mg fullt avvoksede tomat neglebåndene (cutins) i en 1,6 mm fastMAS zirkonia rotoren ved hjelp av leverandøren pakking verktøy. (Enten bakken avvoksede tomat neglebånd eller veldig små biter av delvis avvoksede neglebåndene er egnet.) Sørg for at prøven er pakket jevnt, men ikke for hardt, i rotoren. Etter å ha lagt på toppen cap, male halvparten av korken med en svart-blekk markør penn for å lette målinger av spin rate.
- Juster shimsingen av NMR spektrometer for minimum spektral linjebredde på halv høyde ennd kalibrere proton (en H) og karbon (13 C) 90 ° puls bredder ved hjelp av en standard sammensatt som adamantane.
- Bruke glysin eller glutamin som modell forbindelser, oppnå maksimal signal intensitet ved å optimalisere alle parametre (Hartmann-Hahn matchende effektnivåer, 1 H - 13 C kontakttid, heteronuclear 1 H frikopling styrke) av kryss-polarisasjon magic-vinkel sentrifugering (CPMAS) eksperiment. For spektra kjøpt til en H frekvens på 600 MHz, anbefalte forholdene omfatter 10 kHz eller 15 kHz spinne frekvens, en 3-sec forsinkelse mellom oppkjøp, og Spinal heteronuclear proton dekobling 7 ved et magnetfelt styrke tilsvarende en frekvens på 185 kHz.
- Sett cutin-packed rotoren inn sonden. Deretter plasserer sonden inn i magneten. Øk sentrifugehastighet opp til 10 kHz gradvis å sjekke for god prøve pakking og rotor stabilitet. Kontroller den endelige spinnende stabiliteten i rotoren til innenfor± 20 Hz.
- Juster tuning og matchende kondensatorer av sonden iterativt å oppnå minst mulig strøm refleksjon både 1 H og 13 C NMR frekvenser. Sett eksperimentelle temperaturen til 25 ° C (eller romtemperatur).
- Start pre-optimalisert CPMAS eksperiment tilsvarende Hartmann-Hahn matchende tilstand bestemmes ved 10 kHz spinne frekvens.
- Tilegne 4096 transienter, tilstand spekteret med eksponentiell (Lorentzian) linje utvidelse av 50-100 Hz, og gjør en Fourier transformere til å generere en NMR spekter av signal intensitet vs kjemisk skjerming (ppm).
- Referere til 13 C kjemisk skift eksternt bruk adamantane sett på 38,4 ppm (-CH 2 - gruppen) 8 som standard.
- Øk rotoren spinne frekvensen til 15 kHz og gjenta CPMAS måling (trinn 4.6-4.8) tilsvarende Hartmann-Hahn matchende tilstand beregne på dette sistnevnte spinne frekvens.
- Repepå CPMAS eksperimenter (trinn 4.1-4.9) med naturlige (voksaktig) og delvis avvoksede frukt cuticle prøver.
5. Undersøkelser av Tomato Cuticle Overflate med Atomic Force Mikroskopi (Digital Instruments Nanoscope IIIa; prosedyrer vil variere litt mellom mikroskop) 6
- Slå på scanning probe mikroskop (SPM) (Fig. 2) og sørge for at mikroskopet modusen vippebryter er satt til kontakten Atomic Force Mikroskopi (AFM) modus.
- Manuelt heve SPM hodet ved å slå sine to user-justerbare foran knottene. Løsne AFM tipholder fra SPM hodet ved å skru klemskruen på baksiden av hodet.
- Bruk pinsett til å fjerne den eksisterende AFM cantilever fra tipholder, deretter forsiktig ta en ny silisiumnitrid cantilever (AFM probe) fra pakken og installere den i stedet for den gamle cantilever. Bruk en lys mikroskop for å bekrefte at den nylig installerte AFM cantilever ikke er brutt.
- Fest the tomat cuticle sample (en del av delvis avvoksede tomat skjellaget ~ 10 mm x 10 mm) til en rustfritt stål disk (prøve puck) med dobbeltsidig tape. Bruk en lys mikroskop for å bekrefte at skjellaget overflaten forblir flat og glatt etter plassering av prøven på pucken.
- Plasser pucken med tomat skjellaget prøven på den magnetiske regionen på toppen av SPM skanneren.
- Sett de fremre to manuelle justeringsskruer av skanneren høye ved å vri på knottene, setter den motoriserte tilbake justeringsskruen til omtrent samme nivå som de andre to fremre skruene. Pass på at alle tre skruer er satt høyt nok til å unngå å bryte AFM spissen når du plasserer tipholder i SPM hodet.
- Sett inn tipholder i SPM hodet og fest det ved å stramme klemskruen på baksiden av hodet.
- Etter å ha slått på laseren, justere laser spot på AFM cantilever med den sentrale (y) og høyre (x) laser justeringsknapper på toppen av hodet.Overvåk reflektert laserstrålen på et stykke papir for å plassere laser spot nøyaktig på slutten av AFM cantilever.
- Juster plasseringen av bevegelige speil iterativt bruke fotodetektoren justeringsknottene å oppnå maksimal signal (SUM signal), og dermed sikre at det reflekterte laserstrålen mottas jevnt av de fire kvadrantene av fotodetektoren.
- Senk AFM spissen ved å trekke tilbake de manuelle innstillingsmuligheter foran skruer og den motoriserte tilbake justeringsskruen av SPM skanneren, visuelt overvåke tilnærming av AFM spissen mot prøven overflaten med en invertert mikroskop. Kontroller at alle tre skruene er på samme nivå for å unngå artefakter fra bildebehandling en skrå prøve. Ta spissen mot prøven, men ikke så nær at tuppen berører eller bryter gjennom prøven overflaten.
- På dette punktet, reflektert laserlys av AFM cantilever preller av den bevegelige speil til fotodetektoren. For kontakten AFM modus med Silicon nitride AFM spissen, setter utgangssignalet (Vertical Deflection) spenning til -2 V for en 0 V Setpoint og DIFF Signal (vertikal / horisontal forskjell) til 0 V ved å justere plasseringen av speilet.
- Bruke Nanoscope programvaren, klikk på mikroskopet ikonet og velg riktig profil (Contact mode AFM).
- Bruke "Scan Controls Settings" panelet, sett skannehastighet og skanning størrelse f.eks 10 micron skanstørrelse og 2 Hz skanning rate.
- La AFM spissen for å engasjere prøven overflaten ved å klikke engasjere-tip ikonet. Ved å kontrollere den motoriserte tilbake skruen på SPM base, vil programmet nå senke tuppen før den koples prøven overflaten. Skanneprosessen starter automatisk når spissen har engasjert vellykket.
- Overvåk skanning prosessen ved hjelp av både bilde og omfang moduser av programvaren, justere parametere som settpunkt, integrert gain, proporsjonal forsterkning, scan størrelse, skannehastighet, linjer og prøver / linje iterativt å oppnå høyestoppløsning. Start skanningen med en stor z-aksen range (data skala), deretter nøye redusere data skalaverdi for å observere den beste kontrasten overflateformasjonene på bildet. Redusere forekomsten av hvite områder i det skannede bildet, noe som tyder på at høyden på overflaten funksjoner enn det tilgjengelige z-aksen rekkevidde.
- Fange bildet for å lagre datafilen, så behandle data ved hjelp av flater funksjoner for å fjerne bilderester grunn til vertikal (Z) skanner drift, image buer, og vertikal forskyvning mellom linjer; 9 endelig beregne gjennomsnittlig ruhet. Etter lagring av data, trekke AFM spissen ved å reversere handlingen av datastyrt skruen motor som ble brukt til å engasjere det. Bildebehandling kan utføres i frakoblet bildeanalyse modus og / eller bruke en annen datamaskin.
- Bruk foran nederste grå metall knotter i spissen innehaveren å endre x og y posisjoner skanneområdet, så gjenta målingen på fem prøven locasjoner for å kontrollere reproduserbarheten, erstatter AFM cantilever hvis bildekvaliteten forringes.
6. Representative Resultater
Kjemisk skift analyse av CPMAS 13 C NMR spektra (Fig. 3) identifisert de viktigste funksjonelle gruppene til stede i uttømmende avvoksede tomat skjellaget (cutin). De viktigste karbon moieties i cutin biopolyester ble funnet å være langkjedede aliphatics (0-45 ppm), oksygenert aliphatics (45-110 ppm), multiplisere-limt og aromater (110-160 ppm), og carbonyls (160-220 ppm). De oksygenerte alkylfenoler moieties (CHO + CH 2 O) spiller en avgjørende rolle i etableringen av kovalente forbindelser mellom monomere enheter av cutin biopolymer, og dermed danner den molekylære arkitektur cutin matrise. Forskjeller i relative topp områder observert i spektral-regionen mellom 45 og 100 ppm antyder at mutant cutin har en relativt stor andel av kryss-link forming CHO structura l moieties sammenlignet med vill-type cutin; forsiktige kvantitative målinger ved hjelp av direkte polarisering (DPMAS) NMR 5 metoder støtter denne slutning (data ikke vist).
CPMAS 13 C NMR spektra viste også en gradvis avtagende voks topp på 31 ppm (Fig. 4), indikerer den sekvensielle fjerning av Epi-og intracuticular voks fra cutin-voks kompositt og samtidig beholde den viktigste kjemiske arkitektur cutin biopolymer. Parallell AFM bildeanalyse (Fig. 5) viste overflaten uregelmessigheter på grunn av en trinnvis uttak av Epi-og intracuticular voks fra frukten skjellaget, betegner endringer i organiseringen av cuticular forsamlingen.
. Figur 1 Soxhlet extractor (bildekilde: Wikipedia).
"/>
Figur 2. A) Scanning probe mikroskop. B) SPM hode (tilpasset fra AFM trening manuelle leveres av Digital Instruments).
Figur 3. 150 MHz CPMAS 13 C NMR spektra av uttømmende avvoksede røde modne tomater frukt neglebåndene (cutins) fra vill-type (M82) og mutant (CM15) viser resonanser med kjemisk skift tilsvarende de funksjonelle grupper av en cross-linked hydroxyfatty syre -baserte polyester og også noen formere limte moieties. All spektra ble kjøpt med en 10 kHz spinner frekvens.
Figur 4. 150 MHz 13 CCPMAS NMR spektra av kommersielle røde modne tomater frukt neglebåndene stille kompositoriske endringer ved sekvensiell fjerning av epicuticular og intracuticular voks med tyggis arabisk mekanisk avtrekk og en two minutters kloroform dip, henholdsvis. All spektra ble kjøpt med en 15 kHz spinner frekvens.
Figur 5. AFM bilder og ruhet anslag for den delvis avvoksede kommersielle tomat hårfibrene beskrevet i figur 4 etter trinnvis fjerning av epicuticular (til venstre) og intracuticular (høyre) voks.
Discussion
Protokollene beskrevet tillate for detaljert molekylær og mikroskala karakterisering av en kompleks intraktabel plantemateriale uten behov for destruktive kjemisk nedbrytning. For å undersøke blandingen av cutin biopolyester med ulike lipider (voks) som styrer den strukturelle organiseringen av cuticular forsamlingen, 10 vi gjennomførte og overvåket prosedyrer for selektiv fjerning av epicuticular og intracuticular voks fra heterogene cuticular blanding. Solid-state 13 C NMR ble brukt til å måle utvinning av voks molekylære komponenter, og atomic force mikroskopi servert å undersøke samtidige endringer i overflateruhet. 6,11 For å sammenligne tverrbindinger egenskapene cutins fra dyrket vill-type og single-genet mutante tomat frukt, ble solid-state 13 C NMR også brukt til å estimere de relative tall av Cho og CH 2 O kjemiske moieties.
En rekke designelements av denne protokollen, er bemerkelsesverdig. Som voksen materialene omfatter et bredt spekter av lipider, behandle frukt cuticle med en rekke løsemidler har avvikende polariteter er avgjørende for å oppnå uttømmende dewaxing. I tillegg kan avvoksing tid variere fra 8 timer til 24 timer avhengig av innholdet av de cuticle prøvene. Hvis du vil trekke epicuticular voks konsekvent fra intakt frukt skjellaget, er det viktig å påføre limet belegget jevnt til overflaten.
Solid-state CPMAS 13 C NMR 12 er en rask kvalitativ metode for å identifisere ulike strukturelle komponenter i svært heterogene og uløselig plante biopolymerer og samtidig bevare sitt opprinnelige fysiske egenskaper; 13 tradisjonelle løsningen state NMR kan også brukes til å karakterisere de utpakkede voks blandinger. Hvis kvantitativ estimering av funksjonelle grupper er ønskelig for de intakte anlegget polymerer, 5 hifi-direkte-polarisering magic-vinkel spinnende (DPMAS) 13 C NMR 5,14 bør brukes som en komplementær metode. Nøyaktig kvantifisering av de funksjonelle gruppene krever nøye optimalisering av resirkulerer ganger, eksitasjon puls lengder, og styrken av heteronuclear frikopling. 15. heteronuclear frikopling kan stilles for en 1 H feltstyrke spenner fra 50 kHz til 185 kHz ved hjelp av TPPM 16 eller Spinal 7 metoder. I tillegg til disse parametrene, avhenger sensitiviteten CPMAS målinger på spin-lock tid og Hartmann-Hahn matchende tilstand. 15. I stedet for tradisjonelle CPMAS, kan en trappet-amplitude CP (RAMP-CP) teknikken bli iverksatt for å maksimere korset -polarisering effektivitet ved å variere en H amplitude lineært (~ 20-50%) eller tangentially samtidig amplituden til 13 C feltstyrken konstant i spin-lås periode (eller vice versa). 17,18 Gjennomføring av CPMAS målinger på minimum to ulike rotor-spinnende frekvenser er viktig å skille spinnende sidebands fra de største spektrale topper.
Samtidige AFM målinger utført i kontakt modus muliggjøre direkte avbildning av skjellaget overflaten tilstand med høye scanning hastigheter og høy oppløsning, 19 for eksempel under sekvensiell fjerning av voksaktig bestanddeler. Driftsresultat AFM i tappe (ikke-kontakt) modusen kan brukes som et alternativ for flate karakterisering av delikate "myke" plantematerialer, unngå mulig skade på grunn av sideveis (skjær) styrker og skraping av prøven overflaten. 5,20 I begge tilfeller , sekvensiell kjøp av flere bilder av samme sted på overflaten tjener til å identifisere eventuelle skade overflaten på grunn av "probe-overflate interaksjoner" i AFM målinger. 6,21 For optimal reproduserbarhet, bør AFM sonder med vårens konstanter egnet for myke cuticular overflater være brukt, og konstant temperatur og fuktighet bør opprettholdes. 6,15,20 22,23 for sporing overflatetopografi av disse utsøkt komplekse makromolekylær forsamlinger. 1,2
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av US National Science Foundation tilskudd # MCB-0741914 og MCB-0843627, ytterligere infrastruktur til støtte ble gitt på The City College of New York ved National Institutes of Health 2 G12 RR03060-26 fra National Center for Research Resources. Vi takke for den JKC Rose gruppen i Cornell University Plant Biology Department for å gi M82 (villtype) og CM15 (mutant) tomat neglebåndene. Vi takker Dr. Spyros Monastiriotis fra CCNY Chemical Engineering gruppen av professor Alexander Couzis for hans sjenerøse hjelp med AFM eksperimenter. Vi takker Ms Lauren Gohara for grafisk design støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium acetate trihydrate | Sigma-Aldrich | S8625-500G | |
| Pectinase | TCI America | P0026 | EC 3.2.1.15; 10 U ml-1, store in refrigerator |
| Cellulase | Sigma-Aldrich | C1184-100KU | EC232.734.4; 1.3 units/mg, store in refrigerator |
| Glacial Acetic acid | Sigma-Aldrich | A9967 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | Extremely hazardous |
| Incubator/shaker | New Brunswick Scientific | Model No.G24 | MFG No.M1036-000G |
| Vacuum Oven | Precision Scientific | 31566 | |
| Variac Controller | |||
| Sintered glass thimble (85 mm/25mm) | VWR international | 89056 | |
| Disposable extraction thimble ( 80 mm/ 25 mm) | VWR international | 28320 | |
| Methanol | VWR international | EMD-MX0485-7 | |
| Glass wool | VWR international | RK20789 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | |
| Tweezers | VWR international | 82027-452 | |
| Chloroform | VWR international | EM-CX1050-1 | |
| Hexane | Fisher Scientific | H302-4 | |
| Nitrogen gas | |||
| Parafilm | VWR international | 52858 | |
| Paper towels | VWR international | 89002-984 | |
| Kim wipes | VWR international | 21905-026 | |
| Gum arabic | Sigma-Aldrich | G9752 | |
| 1.6 mm fastMAS zirconia rotor | Varian Inc., Agilent | ||
| NMR spectrometer | Varian Inc., Agilent | standard bore magnet | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | Model compound for CPMAS |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | 49419 | Model compound for CPMAS |
| Adamantane | Sigma-Aldrich | 100277 | To calibrate 90° pulse in NMR |
| Multimode Scanning Probe Microscope (Nanoscope IIIA) | Digital Instruments | ||
| Nanoscope software | Digital Instruments | Version 5.30r3sr3 (2005) | |
| AFM probe (Nonconductive silicon nitride tip) | Veeco Instruments, Inc. | Model NP-20 | |
| Light microscope | Digital Instruments | ||
| Magnetic puck | Digital Instruments | ||
| Double sided tape | VWR international | ||
| Fruit Peeler | |||
| Büchner funnel | VWR international | 89038 |
References
- Dom#237;nguez, E., Heredia-Guerrero, J. A., Heredia, A. The biophysical design of plant cuticles: an overview. New Phytologist. 189, 938-949 (2011).
- Bargel, H., Koch, K., Cerman, Z., Neinhuis, C. Structure-function relationships of the plant cuticle and cuticular waxes - a smart material? Functional Plant Biol. 33, 893-910 (2006).
- Jetter, R., Schäffer, S. Chemical Composition of the Prunus laurocerasus Leaf Surface. Dynamic Changes of the Epicuticular Wax Film during Leaf Development. Plant Physiol. 126, 1725-1737 (2001).
- Vogg, G. Tomato fruit cuticular waxes and their effects on transpiration barrier properties: functional characterization of a mutant deficient in a very-long-chain fatty acid β-ketoacyl-CoA synthase. J. Exper. Botany. 55, 1401-1410 (2004).
- Isaacson, T. Cutin deficiency in the tomato fruit cuticle consistently affects resistance to microbial infection and biomechanical properties, but not transpirational water loss. Plant J. 60, 363-377 (2009).
- Round, A. N. The Influence of Water on the Nanomechanical Behavior of the Plant Biopolyester Cutin as Studied by AFM and Solid-State NMR. Biophysical J. 79, 2761-2767 (2000).
- Fung, B. M., Khitrin, A. K., Ermolaev, K. An Improved Broadband Decoupling Sequence for Liquid Crystals and Solids. J. Magn. Reson. 142, 97-101 (2000).
- Morcombe, C. R., Zilm, K. W. Chemical shift referencing in MAS solid state NMR. J. Magn. Reson. 162, 479-486 (2003).
- Fang, S. J., Haplepete, S., Chen, W., Helms, C. R., Edwards, H. Analyzing atomic force microscopy images using spectral methods. J. App. Phys. 82, 5891-5898 (1997).
- Pollard, M., Beisson, F., Li, Y., Ohlrogge, J. B. Building lipid barriers: biosynthesis of cutin and suberin. Trends. Plant Sci. 13, 236-246 (2008).
- Stark, R. E. NMR studies of structure and dynamics in fruit cuticle polyesters. Solid State Nucl. Mag. 16, 37-45 (2000).
- Schaefer, J., Stejskal, E. O. Carbon-13 nuclear magnetic resonance of polymers spinning at the magic angle. J. Amer. Chem. Soc. 98, 1031-1032 (1976).
- Sachleben, J. R., Chefetz, B., Deshmukh, A., Hatcher, P. G. Solid-State NMR Characterization of Pyrene-Cuticular Matter Interactions. Envir. Sci. & Tech. 38, 4369-4376 (2004).
- Zlotnik-Mazori, T., Stark, R. E. Nuclear magnetic resonance studies of cutin, an insoluble plant polyester. Macromolecules. 21, 2412-2417 (1988).
- Stark, R. E., Garbow, J. R. Nuclear magnetic resonance relaxation studies of plant polyester dynamics. 2. Suberized potato cell wall. Macromolecules. 25, 149-154 (1992).
- Bennett, A. E., Rienstra, C. M., Auger, M., Lakshmi, K. V., Griffin, R. G.
- Metz, G., Wu, X. L., Smith, S. O.
- Peersen, O. B., Wu, X. L., Smith, S. O. Enhancement of CP-MAS Signals by Variable-Amplitude Cross-Polarization - Compensation for Inhomogeneous B-1 Fields. J. Magn. Reson. Ser. A. 106, 127-131 (1994).
- lessandrini, A., Facci, P. AFM: a versatile tool in biophysics. Measurement Sci. & Tech. 16, 10-1088 (2005).
- Benítez, J. J., Matas, A. J., Heredia, A. Molecular characterization of the plant biopolyester cutin by AFM and spectroscopic techniques. J. Struct. Biol. 147, 179-184 (2004).
- Koch, K., Neinhuis, C., Ensikat, H. J., Barthlott, W. Self assembly of epicuticular waxes on living plant surfaces imaged by atomic force microscopy (AFM). J. Exper. Bot. 55, 711-718 (2004).
- Muller, D. J. AFM: A Nanotool in Membrane Biology. Biochemistry. 47, 7986-7998 (2008).
- Last, J. A., Russell, P., Nealey, P. F., Murphy, C. J. The Applications of Atomic Force Microscopy to Vision Science. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6083-6094 (2010).
