Summary
기계 군은 폐 개발 및 폐 부상에서 핵심적인 역할을한다. 여기서는 쥐 태아의 폐 유형 II 상피 세포 및 섬유아 세포를 분리하고 사용하여 기계적인 자극에 노출하는 방법을 설명
Abstract
반복적인 호흡과 같은 움직임 의해 유체 팽만에 의한 utero에서 생성된 기계적 세력은 정상 폐 개발을위한 중요합니다. 폐 개발의 핵심 구성 요소는 폐포 유형 II 상피 세포, 폐 계면 활성제의 주요 소스의 차별화입니다. 이러한 세포는 폐포 루멘, 호스트 방어 및 부상 수리에 유체 항상성에 참여합니다. 또한, 말초 폐 실질 조직 세포를 직접 출산 후 기계적 환기 중 과장 확대 해석에 노출됩니다. 그러나 폐암 세포가 폐 발달에 영향을 미치는하고 폐 손상을 촉진하기 위해 기계적인 자극을 감지하는 정확한 분자 및 세포 메커니즘은 완전히 이해되지 않습니다. 여기서는 쥐 태아의 폐가에서 2 형 세포와 섬유아 세포를 분리하기위한 간단하고 고순도 방법을 제공합니다. 그렇다면, 우리는에 기계적 힘을 시뮬레이션, 태아 세포에 기계적 자극을 제공하기 위해, 체외 시스템, Flexcell 스트레인 단위에 대해 설명태아의 폐 발달이나 폐 부상. 이 실험 시스템은 신축에 노출 태아의 폐 세포에서 분자 및 세포 메커니즘을 조사하기위한 훌륭한 도구를 제공합니다. 이 방법을 사용, 저희 연구실은 태아의 폐 발달과 폐 부상 mechanotransduction에 참여하는 여러 수용체 및 신호 전달 단백질을 찾아냈습니다.
Protocol
1. ECM 단백질과 플레이트의 코팅
- 멸균 조건에서 플레이트 당 차가운 멸균 1X PBS의 12 ML과 laminin 120 μg을 섞는다.
- Bioflex 치료 접시를 타고 각 잘으로 솔루션의 2ml를 추가 (laminin의 최종 농도 2 μg / cm 2). 또는 다른 ECM 단백질 같은 콜라겐-1로서 사용될 수 [10 μg / cm 2], fibronectin [5 μg / cm 2], vitronectin [0.5 μg / cm 2]이나 엘라스틴 [10 μg / cm 2]. 코팅 기술은 그것이 laminin 코팅에 대해 설명하는 것과 비슷합니다. 우물이 완전히 솔루션이 적용되어 있는지 확인합니다.
- 플라스틱으로 번호판을 정리하고 우물의 바닥에 adsorb로 laminin을 허용하도록 하룻밤 평평한 표면에 4 ° C에 넣어. 여전히 좋은 ECM 기능을 유지하면서 이러한 조건에서는 플레이트는 최소한 1 주일 동안 저장할 수 있습니다.
- 다음날, 무균 조건 하에서, 1X PBS로 우물 3 회 씻는다.
- 접시에게 unadsorbed 단백질을 제거하는 1X PBS로 3 회 씻어.
- 세포 단계 2.14 격리되기 전까지는 37 ° DMEM에서 C에서 번호판을 유지.
2. 태아 쥐 폐 유형 II 상피 세포의 분리
분리하기 전에 하루 autoclaved하고 준비 서로 다른 크기의 나일론 meshes로 화면 컵 있습니다.
- 태동의 E17-19 마우스 / 쥐 초과 - 임신에서 태아의 폐가를 구합니다. DMEM 매체를 포함하는 50 ML 원뿔 튜브로 조직을 전송하고 얼음에 배치하십시오.
- 50 ML 원뿔 튜브 소화 버퍼를 만들기 : (10 ML). 이 볼륨의 경우, 마우스 / 쥐에서 약 20 fetuses에서 폐 조직이 사용됩니다.
8.5 ML DMEM
0.5 ML 500mM 산도 7.4 HEPES
5 MG Collagenase 일
5 MG Collagenase 1A
한 ML 치킨 혈청, inactivated 열 - 모든 구성 요소가 무균 후드 내부에 0.2 마이크론 주사기 필터를 통해 해산 및 필터 때까지 잘 섞는다. 37 물 목욕으로 소화 버퍼를 포함하는 원뿔 튜브 ° C를 놓으십시오
- 2.1 단계에서 원뿔 튜브에서 DMEM 배지를 제거하고 멸균 배양 접시에 조직을 전송합니다.
- 1mm 이상의 조직 조각이 덜하고 단계 2.3에서 미리 예열 소화 버퍼를 포함하는 원뿔 튜브로 조직을 전송할 잘 멸균 가위 또는 면도날과 폐가 말하다.
- 아래로 pipetting 및하여 조직을 소화 :
10 ML 피펫 100 회
5 ML 피펫 100 회
파스퇴르 피펫으로 100 배 - 상온에서 5 분간 1,300 rpm으로 homogenate를 원심 분리기.
- 조심스럽게 흡인에 의해 뜨는을 제거하고 펠릿 15 DMEM의 ML 플러스 20% FBS에서 세포를 포함하는 다시 일시 중지합니다.
- 30 - - 100과 함께 화면 컵을 타고 15 마이크론 나일론 meshes 및 장소 일멸균 150 ML의 비커에 내려요.
- 2.8 단계에서 세포 homogenate를 추가하고 순차적으로 100을 통해 필터링 - 30 - 15 - 마이크론 메쉬 스크린 컵.
- 비 상피 세포의 여과를 촉진하는 DMEM 플러스 10% FBS 여러 세차장 후 및 15 마이크론 meshes - clumped 30 일부터 아닌 필터링된 세포를 수집합니다.
- 주로 섬유아 세포를 포함하는 15 마이크론 메쉬에서 여과물 폐기하십시오.
- 30 분 (플라스크 당 세포 현탁액의 approximatelly10 ML) 2 75 cm flasks에서 2.11 단계의 세포는 잠복기에 의해 추가로 2 형 세포를 정화.
- 펠렛 셀 실온에서 5 분간 1,300 rpm으로 뜨는와 원심 분리기를 수집합니다.
- 조심스럽게 흡인에 의해 뜨는을 제거하고 펠릿의 혈청이없는 DMEM으로 세포를 포함하는 다시 일시 중지합니다. resuspension의 볼륨이 처리 조직의 양에 따라 달라집니다. 약, 우리 음식 세포의 상응은 아치에게 위해 (2 ML) 각 잘 한 태아에서 얻은다음 날 전날 % 60-70 사이 confluency.
- Bioflex 여섯 잘 차량 번호판 플레이트 세포 현탁액은 laminin이나 fibronectin과 precoated.
3. 태아 쥐 폐 섬유아 세포의 분리
- 2.11까지 2 형 전지 절연을 위해 위에서 설명한 동일한 단계를 수행하십시오.
- 섬유아 세포가 준수 있도록 30-60 분 37 ° C에서 75 cm 2에와 플레이트, 15 마이크론 메쉬 (대략적인 볼륨이 10-15 ML은 이전의 세척없이)로부터 여과물를 가져가라.
- supernantant을 기음과 하룻밤 혈청이없는 DMEM과 부화로 바꿉니다.
- 다음날, 0.25 % (wt / 권) 0.4 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 및 fibronectin과 precoated Bioflex 접시에 접시들을에서는 트립신으로 세포를 수확.
4. 폐 세포에 기계적 자극을 제공하는 실험 시스템
- 혈청이없는 DMEM (2 ML / 잘)들을 연결하고 spre하자의 Bioflex 문화 판에 씨앗 세포 (50 % 정도 합류)실험을하기 전에 최소한 6h에 대한 광고입니다. 일반적으로 저희 연구실은 기계적 변형을 적용하기 전에 주위를 24 시간 동안 문화의 세포를 유지합니다. 세포의 특정 번호는 실험에 필요한 경우 격리 후, 유형 II 세포는 75 cm 2 flasks 그리고 다음날, 세포, trypsinized 계산 후 놓는되는 혈청이없는 DMEM에 보관됩니다.
- 다음날, 미디어가 신선 혈청이없는 DMEM (2 ML / 음)과 bioflex 플레이트로 대체하고는 Flexcell FX-5000 스트레인 단위에 마운트됩니다. Monolayers는 실험 개시 전에 더 큰 80 % 합류해야합니다.
- Equibiaxial 변형은 세포막에 적용됩니다. 변형의 공표는 (토론 참조) 생체내의 기계적 세력의 시뮬레이션에 따라 다릅니다.
- 병렬로 배양해 아닌 뻗어 세포막에 성장 세포는 컨트롤로 사용됩니다.
- 실험의 끝에서 monolayers는 유전자 발현의 변화 (예 : 계면 활성제 단백질 C)를 분석 처리할 수 있습니다서양 얼룩 등에 의해, 시간 PCR 실제 단백질 풍부하여 또한 monolayers는 immunocytochemistry 실험에 해결할 수 있습니다. 이 기법의 경우 고정 후 silastic 세포막은 접시에서 잘라되며 항체와 permeabilization과 부화하기 전에 장착 요원으로 물의 10-20 μl를 사용하여 유리 슬라이드에 장착. 뜨는 또한 성장 요인 크린 시토킨 등의 존재를 조사하는 데 사용할 수 있습니다
5. 대표 결과
그림 1과 E18 태아 마우스 타입 II 전지의 그림 2 공연 관계자 위상 콘트라스트 사진이 원고에서 설명한 기법을 사용하여 고정.
그림 3은 기계적인 변형이 마커로서 계면 활성제 단백질-C를 이용하여 태아의 유형 II 상피 세포의 분화를 유도 보여줍니다.
그림 1. 담당자resentative 위상 콘트라스트 사진은 바로 태아의 유형 II 세포의 clumped 모습을 보여주는 격리 후 촬영.
laminin과 코팅 bioflex 접시에 여기와 도금 설명된대로 그림 2. E18 태아 2 형 상피 세포 격리되었다. 비 뻗어 세포를 paraformaldehyde에서 해결 된 뒤에 사진은 다음날 찍은. 세포의 순도은 90로 결정되었다 ± SP-C에 대한 상피 세포 형태학 및 immunostaining의 현미경 분석을 약 5 %.
그림 3. 태아 2 형 상피 세포는 40 사이클 / 16h에 대한 분에 5 %의 주기적 변형에 노출되었다. 계면 활성제 단백질 C (SP-C) 그 변형이 다른 ECM 기판을 사용하여 2 형 세포 분화를 유도 보여주는 mRNA의 표현의) 북부 얼룩 . + / - 징후 s의 노출 여부를 나타냅니다각각 양성. 데이터는 뜻으로 나타난 + / - SEM, N = 3, * P <0.05 B)를 기계적 응력으로 SP-C 단백질 노출된 태아의 유형 II 세포의 수준 (녹색) 또는하지 (제어)를 보여주는 형광 immunocytochemistry 이미지.. 핵은 dapi (파란색)과 counterstained되었다. 바, 그 기계 신축성을 보여주는 세 실험에서 10 μm의. C) 서양 얼룩 결과는 SP-C 단백질을 증가시킵니다. N = 3, * P <0.05.
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Discussion
본 원고에서는 태아의 유형 II 상피 세포 및 섬유아 세포를 분리하고 Flexcell의 위기 장치를 사용하여 기계적인 자극에 노출하는 방법을 설명합니다. 우리는 상피 세포의 분화 1,2을 평가하고 수용체와 스트레치 3-9 활성화 신호 전달 경로를 연구하기 위해이 기술을 사용해 왔습니다. 또한,이 방법은 또한 기계적 손상 10,11 의해 유도된 세포 반응을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 절차는 collagenase와 폐 조직의 소화에 근거한다. 그것은 소화 후에 같이 덩어리로 2 형 세포의 경향을 이용합니다. 이 기법을 수행하는 동안 중요한 단계는 폐의 소화와 비 상피 세포의 여과를 촉진하기 때문에 2 형 세포보다 순결을 달성하기 위해 철저하게 30 15 마이크론 meshes에 비 필터링된 세포를 세척을 용이하게하기 위해 잘 조직 닦지입니다 .
우리 연구소는 m을 사용합니다embranes은 콜라겐이나 지하 점막의 ECM 구성을 시뮬레이션하는 laminin으로 코팅. 그러나 세포는 20 % 신장에 노출되면, 세포는 스트레치하는 동안 기판으로부터 분리 수 및 fibronectin은 대체 기판으로 간주되어야한다.
또 다른 중요한 고려 사항이 휴대 전화 접촉보다는 휴대 매트릭스 접촉을 촉진 수도 있으므로 세포가 "감각"로 설정 연신율의 비율을 수 없다는 사실을 주어 신축하여 이전 세포 monolayers의 100 %의 합류를 회피하는 것입니다 프로토콜.
Flexcell의 위기 유닛 유연한 바닥 문화 판을 변형하기 위해 진공을 사용합니다. 진공의 응용은 멤브레인 표면에 걸쳐 균일 요골과 원주 변형을 생성하기 때문에 (권한, 만화, 도식 개요 비디오를보고, 박사 AJ Banes 플렉스에게 생체내 조건에서와 유사한 equibiaxial 팽만을 제공하는 중앙 실린더 게시물을 통해 각 멤브레인를 뻗어세포 인터내셔널 주식 회사, www.flexcellint.com). 이 시스템은 지정된 변형 처방에 의해 정의된, 통제된 정적 또는 주기적 변형을 제공합니다. 태아 호흡 운동을 모방하기 위해 40-60 사이클 / 분의 2.5-5 %의 신축성 간의 순환의 스트레치 처방이 적용됩니다. 신장의 비율에 대한 합의는 없었기에 태아 호흡하는 동안 태아의 폐 감각니다. 일부 저자들은 다른 수사관은 2.5 %가 생체내 조건 13,14에서 더 많은 대표한다고 주장하는 반면 5 % 팽만 적절한 12 생각합니다. 상수 팽만 압력을 시뮬레이션하려면 2.5 % 지속적인 스트레치 프로토콜이 사용됩니다. 40 사이클 / 분의 폐 부상을 모방하려면 20 % 순환의 신축성이 사용됩니다. 이 기법의 잠재적인 한계 로딩 게시물 주변 멤브레인의 영역에 놓는 세포 변형의 증가 등이 있습니다. 또 다른 제한은 높은 사이클 속도를 사용하는 경우에는 신장보다 큰 15-20%를 제공하는 무능력 (40 사이클 / 분 이상입니다).
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Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
NIH 교부금 HD052670 지원.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Collagenase 1 | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| Collagenase 1A | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| Screen cups | Sigma-Aldrich | CD1-1KT | |
| Syringe filters | Fisher Scientific | 09-754-25 | |
| 100 micron nylon mesh | Small Parts, Inc. | CMN-100-D | |
| 30 micron mesh | Small Parts, Inc. | CMN-30-D | |
| 15 micron mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX15 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Collagen-1 | Collagen Biomed | PC0701 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Vitronectin | Sigma-Aldrich | V-0132 | |
| Elastin | Sigma-Aldrich | E-6402 | |
| Bioflex plate | Flexcell International | BF-3001U | Uncoated |
| Flexcell Strain Unit | Flexcell International | FX-5000 |
References
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