Et eksperimentelt system for å studere Mechanotransduction i Fetal lungeceller

Summary

Mekaniske krefter spiller en nøkkelrolle i lungene og lungeskade. Her beskriver vi en metode for å isolere gnager føtale lunge type II epitelceller og fibroblaster og å utsette dem for mekanisk stimulering ved hjelp av en

Abstract

Mekaniske kreftene som genereres i utero ved gjentatte puste-lignende bevegelser og ved væske distensjon er kritisk for normal lunge utvikling. En viktig del av lungene er differensiering av alveolære type II epitelceller, den viktigste kilden til pulmonal surfactant. Disse cellene også delta i væske homeostase i alveolar lumen, vert forsvar, og skade reparasjon. I tillegg kan distale lunge parenchyma celler utsettes for direkte overdrevet strekk under mekanisk ventilasjon etter fødselen. Imidlertid er presise molekylære og cellulære mekanismer som lungeceller fornuftig mekaniske stimuli for å påvirke lunge utvikling og for å fremme lungeskade ikke helt forstått. Her gir vi en enkel og høy renhet metode for å isolere type II celler og fibroblaster fra gnagere fosterets lunger. Deretter beskriver vi en in vitro system, The Flexcell Strain Unit, for å gi mekanisk stimulering til fosterets celler, simulere mekaniske krefter iføtal lunge utvikling eller lungeskade. Dette eksperimentelle systemet gir en utmerket verktøy for å undersøke molekylære og cellulære mekanismer i fosterets lungeceller eksponert å strekke. Ved hjelp av denne tilnærmingen, har vårt laboratorium identifisert flere reseptorer og signalering proteiner som deltar i mechanotransduction i fosterlivet lunge utvikling og lungeskade.

Protocol

1. Overflatebehandling av plater med ECM proteiner

1. Under sterile forhold, bland 120 mikrogram laminin med 12 ml kaldt steril 1X PBS per plate.
2. Ta Bioflex ubehandlede plater og legge 2ml av løsningen til hver brønn (endelig konsentrasjon av laminin er 2 mikrogram / ​​cm ^2). Alternativt kan andre ECM proteiner kan brukes, for eksempel kollagen-1 [10 mikrogram / ​​cm ^2], fibronectin [5 mikrogram / ​​cm ^2], vitronectin [0,5 mikrogram / ​​cm ^2] eller elastin [10 mikrogram / ​​cm ^2]. Belegget Teknikken er lik det den er beskrevet for laminin-belegg. Kontroller at brønnene er helt dekket av løsningen.
3. Pakk platene med plast og sett ved 4 ° C på et flatt underlag over natten slik at laminin å adsorberes til bunnen av brønnene. I disse forholdene, kan platene oppbevares i minst en uke og samtidig beholde god ECM-funksjon.
4. Neste dag, under sterile forhold, vaske brønnene 3 ganger med 1X PBS.
5. Skyll platene 3 ganger med 1X PBS å fjerne unadsorbed proteiner.
6. Hold platene ved 37 ° C i DMEM inntil cellene er isolert fra trinn 2.14.

2. Isolering av føtale gnager lunge type II epitelceller

Dagen før isolasjon har skjermen kopper med ulike størrelse nylon masker autoklaveres og klar.

1. Motta fosterets lunger fra tidsstyrt gravid mus / rotte på E17-19 i svangerskapet. Overfør vevet inn i en 50 ml konisk rør som inneholder DMEM medium og plassere den på is.
2. Gjør fordøyelsen buffer i en 50 ml konisk rør: (10 ml). For dette volumet, er lungevev fra ca 20 foster fra mus / rotte brukes.
   8,5 ml DMEM
   0,5 ml 500mm pH 7.4 HEPES
   5 mg collagenase 1
   5 mg collagenase 1A
   1 ml Kylling serum, varme inaktivert
3. Bland godt til alle komponentene er oppløst og filteret gjennom en 0,2 mikron sprøyte filter inni sterile panseret. Plasser den koniske rør som inneholder fordøyelsen buffer i et vannbad ved 37 ° C.
4. Fjern DMEM mediet fra den koniske røret fra trinn 2,1 og overføre vevet inn i et sterilt petriskål.
5. Finhakk lungene godt med steril saks eller barberblad for å lage vev stykker mindre enn 1 mm og overføre vevet inn i den koniske røret inneholder forvarmes fordøyelsen buffer fra trinn 2,3.
6. Fordøye vevet ved pipettering opp og ned:
   100 ganger med 10 ml pipette
   100 ganger med 5 ml pipette
   100 ganger med Pasteur pipette
7. Sentrifuger homogenat ved 1300 rpm i 5 minutter ved romtemperatur.
8. Fjern forsiktig supernatanten ved aspirasjon og re-suspendere pellet som inneholder cellene i 15 ml DMEM pluss 20% FBS.
9. Ta ut av skjermen kopper med 100 -, 30 - og 15-micron nylon duk og sted them på sterile 150 ml begerglass.
10. Legg celle homogenat fra trinn 2,8 og sekvensielt filtrere gjennom 100 -, 30 - og 15-micron mesh skjermen kopper.
11. Samle klumpet ufiltrerte celler fra 30 - og 15-micron maskene etter flere vask med DMEM pluss 10% FBS å lette filtrering av ikke-epitelceller.
12. Kast filtratet fra 15-micron mesh som inneholder det meste fibroblaster.
13. Rense ytterligere type II celler ved å inkubere celler fra trinn 2.11 i 75-cm ² kolber for 30 min (approximatelly10 ml cellesuspensjon per kolbe).
14. Samle supernatanten og sentrifuger ved 1300 rpm i 5 minutter ved romtemperatur til pelletskaminer cellene.
15. Fjern forsiktig supernatanten ved aspirasjon og re-suspendere pellet som inneholder cellene i serum-fri DMEM. Volumet av resuspensjon avhenger av mengden vev behandlet. Omtrent, vi plate tilsvarende celler hentet fra en foster i hver brønn (2 ml) for å Achieve mellom 60-70% confluency neste dag.
16. Plate cellesuspensjonen på Bioflex seks-brønns plater precoated med laminin eller fibronectin.

3. Isolering av føtale gnager lunge fibroblaster

1. Følg den samme fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor for type II celler isolert opp til 2,11.
2. Ta filtratet fra 15-micron mesh (uten forutgående vasking, omtrentlig volum er 10-15 ml) og plate på 75-cm ² ved 37 ° C i 30-60 min å tillate fibroblaster å følge.
3. Aspirer supernantant og erstatte med serum-fri DMEM og inkuber natten.
4. Neste dag, høster cellene med 0,25% (vekt / vol) trypsin i 0,4 mM EDTA og plate dem på Bioflex plater precoated med fibronectin.

4. Eksperimentell system for å gi mekanisk stimulering til lungeceller

1. Seed cellene (rundt 50% konfluent) på Bioflex kultur plater i serum-free DMEM (2 ml / brønn) og la dem feste og spreannonse i minst 6t før eksperimenter. Generelt vårt laboratorium holder celler i kultur for rundt 24t før påføring mekanisk belastning. Hvis et bestemt antall celler er nødvendig for forsøkene, etter isolasjon, er type II celler opprettholdes i serum-free DMEM 75-cm ² kanner og den neste dagen, blir cellene trypsinized, telles og deretter seedet.
2. Neste dag blir media erstattes med frisk serum-free DMEM (2 ml / brønn) og bioflex plater er montert i en Flexcell FX-5000 Strain Unit. Monolayers bør ikke være større enn 80% konfluent før oppstart av forsøkene.
3. Equibiaxial belastning brukes på membraner. Regimet av belastningen varierer avhengig simulering av mekaniske krefter i vivo (se diskusjon).
4. Celler dyrket på ikke-strukket membraner dyrket parallelt blir brukt som kontroller.
5. På slutten av forsøkene, kan monolayers bli behandlet for å analysere endringer på genuttrykk (for eksempel overflateaktive protein C)av real time-PCR, protein overflod av Western blot, etc. Også kan monolayers fastsettes for immunocytochemistry eksperimenter. For denne teknikken, etter fiksering, er silastic membraner kuttet ut fra platene og montert på glassplater med 10-20 mL av vann som en montering agent før permeabilization og inkubasjon med antistoffer. Supernatant kan også brukes til å undersøke tilstedeværelsen av vekstfaktorer, cytokiner, etc.

5. Representative resultater

Figur 1 og Figur 2 viser representative fase-kontrast fotografier av E18 føtale mus type II celler isolert ved hjelp av teknikken beskrevet i dette manuskriptet.

Figur 3 viser at mekanisk belastning induserer differensiering av føtale type II epitelceller med surfactant protein-C som en markør.

Figur 1. Reprepresentativ fase-kontrast fotografi tatt rett etter isolasjon viser klumpet utseendet føtale type II celler.

Figur 2. E18 føtale type II epitelceller ble isolert som beskrevet her og belagt på bioflex platene belagt med laminin. Bildet er tatt dagen etter ikke-strukket celler ble fikset i paraformaldehyde. Renheten av cellene var fast bestemt på å være 90 ± 5% ved mikroskopisk analyse av epithelial cellemorfologi og farging for SP-C.

Figur 3. Fetal type II epitelceller ble utsatt til 5% syklisk belastning på 40 sykluser / min for 16h. A) Northern blot av surfaktant protein C (SP-C) mRNA uttrykk som viser at belastningen induserer type II celledifferensiering med forskjellige ECM underlag . + / - Tegn representerer eksponering eller ikke strene, henholdsvis. Data er presentert som betyr + / - SEM, n = 3; * P <0.05 B) Fluorescens immunocytochemistry bilder demonstrerer SP-C protein nivåer (grønn) i fosterets type II celler eksponert eller ikke (kontroll) til mekanisk belastning.. Atomkjerner ble kontrafarget med DAPI (blå). Bar, 10 mikrometer. C) Western blot resultater fra tre forsøk som viser at mekanisk strekningen øker SP-C protein. N = 3; * P <0.05.

Discussion

I dette manuskriptet, beskriver vi en metode for å isolere føtale type II epitelceller og fibroblaster og å utsette dem for mekanisk stimulering ved hjelp av Flexcell Strain Apparatus. Vi har brukt denne teknikken til å vurdere differensiering av epitelceller ^1,2 og å studere reseptor og signalveier aktivert av strekningen ^3-9. I tillegg kan denne metoden også brukes til å undersøke celle responser forårsaket av mekanisk skade ^10,11. Prosedyren er basert på fordøyelsen av lungevev med collagenase. Det tar fordel av tendensen av type II celler til å klumpe seg sammen etter fordøyelse. Viktige skritt mens du utfører denne teknikken er hakking vevet godt for å lette fordøyelsen av lungen og vaske grundig de ufiltrerte celler på 30 og 15 mikron masker for å lette filtrering av ikke-epitelceller, og dermed å oppnå større renhet av type II celler .

Vårt laboratorium benytter membranes belagt med kollagen eller laminin å simulere ECM sammensetningen av kjellertrappen membraner. Men når cellene blir utsatt til 20% forlengelse, kan cellene løsner fra underlaget under strekk og fibronectin bør vurderes som et alternativ substrat.

Et annet viktig hensyn er å unngå 100% samløpet av celle monolayers før strekke, gitt at dette kan fremme celle-til-celle kontakt snarere enn celle-til-matrise kontakt og derfor celler kan ikke "fornuft" andelen av tøyelighet satt opp av protokollen.

Den Flexcell Strain Unit bruker et vakuum for å deformere en fleksibel bunn kultur plate. Anvendelse av vakuum strekker hver membran over sentrale sylinder innlegget, skaper uniform radial og omkrets belastning over membranen overflaten og dermed gi equibiaxial distensjon, ligner in vivo forhold (se tegnefilm, skjematisk oversikt video, med tillatelse, Dr. AJ Banes Flexcelle International Corporation, www.flexcellint.com). Dette systemet gir en definert, kontrollert statisk eller syklisk deformasjon ved angitt belastning regime. Å etterligne fosterets pustebevegelser en syklisk strekning regime mellom 2,5 til 5% strekning på 40-60 sykluser per minutt er brukt. Det er ikke enighet om hvor stor prosentandel av tøyelighet som føtale lunge sansene i fosterlivet puste. Noen forfattere mener at 5% distensjon er hensiktsmessig ^12, mens andre forskere hevder at 2,5% er mer representativ for in vivo forhold ^13,14. For å simulere konstant oppblåst press, er en 2,5% sammenhengende strekning protokoll som brukes. For å etterligne lungeskade, 20% syklisk strekning på 40 sykluser / min er brukt. Potensielle begrensninger av denne teknikken er økningen av deformasjon av celler seeded i området av membranen perifert i forhold til lasting innlegget. En annen begrensning er manglende evne til å gi forlengelse større enn 15-20% hvis en høy syklus sats benyttes (over 40 sykluser / min).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Sigma-Aldrich	D5648
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Collagenase 1	Sigma-Aldrich	C0130
Collagenase 1A	Sigma-Aldrich	C9891
Chicken serum	Sigma-Aldrich	C5405
Screen cups	Sigma-Aldrich	CD1-1KT
Syringe filters	Fisher Scientific	09-754-25
100 micron nylon mesh	Small Parts, Inc.	CMN-100-D
30 micron mesh	Small Parts, Inc.	CMN-30-D
15 micron mesh	Dynamic Aqua-Supply Ltd.	NTX15
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020
Collagen-1	Collagen Biomed	PC0701
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141
Vitronectin	Sigma-Aldrich	V-0132
Elastin	Sigma-Aldrich	E-6402
Bioflex plate	Flexcell International	BF-3001U	Uncoated
Flexcell Strain Unit	Flexcell International	FX-5000