Summary
Mekaniska krafter spela en nyckelroll i lungutveckling och lungskada. Här beskriver vi en metod för att isolera gnagare fetal lunga typ II epitelceller och fibroblaster och att utsätta dem för mekanisk stimulering med användning av en
Abstract
Mekaniska krafter som genereras i livmodern genom återkommande andning-liknande rörelser och flytande buk är kritiska för normal lungutveckling. En viktig del av lungan utveckling är differentieringen av alveolära typ II epitelceller, den största källan till lungsurfaktant. Dessa celler deltar också i vätska homeostas i alveolära lumen, värd försvar och skada reparation. Dessutom kan distala lungparenkym cellerna direkt utsatt för överdriven stretch under mekanisk ventilation efter födseln. Men de exakta molekylära och cellulära mekanismer som lungceller känner av mekaniska stimuli för att påverka lung utvecklingen och främja lungskada inte helt klarlagd. Här ger vi en enkel och hög renhet metod för att isolera typ II-celler och fibroblaster från gnagare fetala lungor. Därefter, beskriver vi ett in vitro-system, i Flexcell Strain enheten, för att åstadkomma mekanisk stimulering till fosterceller, simulerande mekaniska krafter ifostrets lunga utveckling eller lungskada. Detta experimentella system tillhandahåller ett utmärkt verktyg för att undersöka molekylära och cellulära mekanismer i fetal lunga celler exponerade för att sträcka. Med detta tillvägagångssätt har vårt laboratorium identifierat flera receptorer och signalering proteiner som deltar i mechanotransduction i fetal lunga utveckling och lungskada.
Protocol
1. Beläggning av plattor med ECM-proteiner
- Under sterila betingelser, blanda 120 | ag av laminin med 12 ml kall steril 1 x PBS per platta.
- Ta Bioflex obehandlade plåtar och tillsätt 2 ml av lösningen till varje brunn (slutlig koncentration av laminin är 2 pg / cm 2). Alternativt skulle andra ECM-proteiner användas, såsom kollagen-1 [10 | ig / cm 2], fibronektin [5 ng / cm 2], vitronektin [0,5 pg / cm 2] eller elastin [10 | ig / cm 2]. Beläggningen teknik liknar det som beskrivs för laminin-beläggning. Se till brunnarna fullständigt täcks av lösningen.
- Linda plattorna med plast och kan ställas till 4 ° C på en plan yta över natten för att tillåta laminin att adsorbera till botten av brunnarna. Under dessa förhållanden kan plattorna lagras under minst en vecka och ändå behålla en god ECM-funktion.
- Nästa dag, under sterila betingelser, tvätta brunnarna 3 gånger med 1 X PBS.
- Skölj plattorna 3 gånger med 1 x PBS för att avlägsna icke adsorberade proteiner.
- Hålla plattorna vid 37 ° C i DMEM tills cellerna isoleras från steg 2,14.
2. Isolering av fetala typ gnagare lung II epitelceller
Dagen före isoleringen har skärmen koppar med olika maskor storlek nylon autoklaveras och klar.
- Skaffa foster Lungor från tidsinställd-gravida mus / råtta på E17-19 av dräktigheten. Överföra den vävnad i en 50 ml koniskt rör innehållande DMEM-medium och placera den på is.
- Göra digereringsbuffert i en 50 ml koniskt rör (10 ml). För denna volym, är lungvävnad från cirka 20 foster från mus / råtta som används.
8,5 ml DMEM
0,5 ml 500 mM pH 7,4 HEPES-
5 mg Kollagenas 1
5 mg Kollagenas 1A
1 ml kycklingserum, värmeinaktiverat - Blanda väl till dess att alla komponenterna är upplösta och filtrera genom ett 0,2 mikron sprutfilter inuti den sterila huven. Placera det koniska röret innehållande digereringsbuffert i ett vattenbad vid 37 ° C.
- Avlägsna DMEM-medium från den koniska röret från steg 2,1 och överför den vävnad i en steril petriskål.
- Färs lungorna väl med en steril sax eller ett rakblad för att göra vävnadsbitar mindre än 1 mm och överföra vävnaden i den koniska röret innehållande den förvärmda digereringsbuffert från steg 2,3.
- Smälta vävnaden genom pipettering upp och ned:
100 gånger med 10 ml pipett
100 gånger med 5 ml pipett
100 gånger med Pasteurpipett - Centrifugera homogenatet vid 1300 rpm under 5 minuter vid rumstemperatur.
- Försiktigt avlägsna supernatanten genom avsugning och återsuspendera pelleten innehållande cellerna i 15 ml DMEM plus 20% FBS.
- Ta ut skärmen koppar med 100 -, 30 - och 15-mikron maskor nylon och plats: eem på sterila 150 ml bägare.
- Lägg cellhomogenatet från steg 2,8 och sekventiellt filtrera genom 100 -, 30 - och 15-micron mesh koppar skärmen.
- Samla hopklumpade icke-filtrerade celler från 30 - och 15-mikron nät efter flera tvättar med DMEM plus 10% FBS för att underlätta filtrering av icke-epitelceller.
- Kassera filtratet från 15-mikron mesh som innehåller mest fibroblaster.
- Rena ytterligare typ Il-celler genom att inkubera cellerna från steg 2,11 i 75-cm 2 kolvar under 30 minuter (approximatelly10 ml cellsuspension per kolv).
- Samla upp supernatanten och centrifugera vid 1300 rpm under 5 minuter vid rumstemperatur för att pelletera cellerna.
- Försiktigt avlägsna supernatanten genom avsugning och återsuspendera pelleten innehållande cellerna i serumfritt DMEM. Volymen av återsuspension beror på mängden bearbetas av vävnad. Ca Vi platta motsvarande celler som erhållits från ett foster i varje brunn (2 ml) för att AchiInför mellan 60-70% konfluens följande dag.
- Plattan cellsuspensionen på Bioflex sex-brunnars plattor förbelagda med laminin eller fibronektin.
3. Isolering av fetala fibroblaster gnagare lung
- Följ samma steg som beskrivits ovan för typ II-celler isolering upp till 2,11.
- Ta filtratet från 15-mikron mesh (utan föregående tvättning; ungefärlig volym uppgår till 10-15 ml) och plattan på 75-cm 2 vid 37 ° C under 30-60 min för att medge fibroblaster att vidhäfta.
- Aspirera supernantant och ersätt med serumfritt DMEM och inkubera över natten.
- Nästa dag skörda cellerna med 0,25% (vikt / vol) trypsin i 0,4 mM EDTA och plattan dem på Bioflex plattor förbelagda med fibronektin.
4. Experimentellt system för att ge mekanisk stimulans till lungceller
- Utsäde cellerna (omkring 50% sammanflytande) på Bioflex odlingsplattor i serum-fri DMEM (2 ml / brunn) och låta dem fästa och SPREannons för minst 6 timmar innan experiment. I allmänhet vårt laboratorium håller celler i kultur för cirka 24 timmar innan mekanisk påfrestning. Om ett visst antal celler som krävs för experimenten, efter isolering, är typ Il-celler upprätthölls i serumfritt DMEM 75-cm2 kolvar och nästa dag, celler trypsinerades, räknades och såddes sedan.
- Nästa dag är ersattes mediet med färskt serumfritt DMEM (2 ml / brunn) och Bioflex plattor är monterade i en Flexcell FX-5000 Strain enheten. Monoskikt bör inte vara högre än 80% sammanflytande före start av experimenten.
- Equibiaxial töjning appliceras på membranen. Kuren av stam varierar beroende på simuleringen av mekaniska krafter in vivo (se diskussion).
- Celler odlade på icke-sträckta membranen odlade parallellt används som kontroller.
- Vid slutet av experimenten kan monoskikt bearbetas för att analysera förändringar i genexpression (t.ex. ytaktivt protein C)av Real Time-PCR, protein överflöd av Western blot, etc. Dessutom kan monolager fastställas för immunocytokemi experiment. För denna teknik efter fixering, är silastiska membran skars ut från plattorna och monterades på objektglas med användning av 10-20 | il av vatten som ett montage medlet före permeabilisering och inkubering med antikroppar. Supernatanten kan också användas för att undersöka närvaron av tillväxtfaktorer, cytokiner etc.
5. Representativa resultat
Figur 1 och Figur 2 visar representativa faskontrast fotografier av E18 foster II mustyp celler isolerades med hjälp av teknik som beskrivs i detta manuskript.
Figur 3 visar att mekaniskt stam inducerar differentiering av fetala typ II epiteliala celler med användning ytaktivt protein-C som en markör.
Figur 1. Repsentant faskontrast fotografi taget direkt efter isolering som visar hopklumpade utseendet av fetala typ II celler.
Figur 2. E18-fetala typ II epiteliala celler isolerades såsom beskrivits här och ströks ut på Bioflex plattor belagda med laminin. Bilden är tagen dagen därpå efter icke-sträckta cellerna fixerades i paraformaldehyd. Renheten hos cellerna bestämdes vara 90 ± 5% genom mikroskopisk analys av epitelceller morfologi och immunfärgning för SP-C.
Figur 3. Fetala typ II epiteliala celler exponerades för 5% cyklisk belastning vid 40 cykler / min under 16 timmar. A) Northern blöt av ytaktivt protein C (SP-C)-mRNA-expression som visar att stam inducerar typ Il-cell differentiering med hjälp av olika ECM substrat . + / - Tecken representerar exponering eller inte sträna, respektive. Data presenteras som medelvärde + / - SEM, n = 3; * P <0,05 B) Fluorescence immunocytokemi bilder som visar SP-C-proteinnivåer (grön) i fetala typ Il-celler exponerade eller inte (kontroll) för mekanisk påfrestning.. Kärnor motfärgades med DAPI (blå). Bar, 10 nm. C) Western blot resultat från tre försök som visar att mekanisk stretch ökar SP-C-protein. N = 3, * P <0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta manuskript beskriver vi en metod för att isolera fetala typ II epitelceller och fibroblaster och att utsätta dem för mekanisk stimulering med stam Flexcell Apparatus. Vi har använt denna teknik för att bedöma differentiering av epitelceller 1,2 och för att studera receptor och signalvägar som aktiveras av sträckning 3-9. Dessutom kan denna metod även användas för att undersöka cellsvar som induceras av mekanisk skada 10,11. Förfarandet är baserat på nedbrytning av lungvävnad med kollagenas. Det tar fördel av tendensen hos typ Il-celler att klumpa ihop sig efter digerering. Viktiga steg när de utför denna teknik är mals vävnaden och för att underlätta nedbrytning av lungan och tvätta noggrant de icke-filtrerade celler på 30 och 15 micron maskor för att underlätta filtrering av icke-epitelceller och därmed uppnå större renhet av typ II-celler .
Vårt laboratorium använder membranes belagd med kollagen eller laminin för att simulera ECM sammansättning basalmembran. När emellertid cellerna utsattes för 20% förlängning, kan celler bort från substratet under sträckning och fibronektin bör betraktas som ett alternativt substrat.
Ett annat viktigt övervägande är att undvika 100% konfluens av cellmonoskikt före sträcka, eftersom detta kan befrämja cell-till-cell-kontakt snarare än cell-till-matris kontakt och därför celler kanske inte "känner" procentandelen töjning inrättad genom protokollet.
Den Flexcell Strain Enheten använder ett vakuum för att deformera en flexibel platta botten kultur. Tillämpning av vakuum sträcker sig varje membran över de centrala cylindern inlägg, skapa enhetliga radiell och perifer stam över membranet ytan och ger därför equibiaxial buk, liknande in vivo villkor (se tecknad film, schematisk översikt video, med tillstånd, Dr AJ Banes FlexCell International Corporation, www.flexcellint.com). Detta system ger en definierad och kontrollerad statisk eller cyklisk deformation av den angivna stammen regimen. För att efterlikna foster andningsrörelser en cyklisk sträcka regim mellan 2,5-5% stretch i 40-60 cykler per minut tillämpas. Det finns inte enighet om den andel av förlängningen att fetala lung sinnen under fostrets andning. Vissa författare menar att 5% buk är lämpligt 12, medan andra forskare hävdar att 2,5% är mer representativ för in vivo förhållanden 13,14. För att simulera konstant buk tryck, en 2,5% kontinuerlig stretch protokoll som används. Att efterlikna lungskada, 20% cyklisk sträckning vid 40 cykler per minut användes. Potentiella begränsningar av denna teknik innefattar en ökning av deformation av celler sådda i området för det perifert membranområdet till lastning stolpen. En annan begränsning är oförmågan att ge förlängning mer än 15-20% om en hög cykelhastighet används (över 40 cykler / min).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Med stöd av NIH bidrag HD052670.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Collagenase 1 | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| Collagenase 1A | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| Screen cups | Sigma-Aldrich | CD1-1KT | |
| Syringe filters | Fisher Scientific | 09-754-25 | |
| 100 micron nylon mesh | Small Parts, Inc. | CMN-100-D | |
| 30 micron mesh | Small Parts, Inc. | CMN-30-D | |
| 15 micron mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX15 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Collagen-1 | Collagen Biomed | PC0701 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Vitronectin | Sigma-Aldrich | V-0132 | |
| Elastin | Sigma-Aldrich | E-6402 | |
| Bioflex plate | Flexcell International | BF-3001U | Uncoated |
| Flexcell Strain Unit | Flexcell International | FX-5000 |
References
- Sanchez-Esteban, J., Tsai, S. W., Sang, J., Qin, J., Torday, J. S., Rubin, L. P. Effects of mechanical forces on lung-specific gene expression. Am. J. Med. Sci. 316, 200-204 (1998).
- Sanchez-Esteban, J., Cicchiello, L. A., Wang, Y., Tsai, S. W., Williams, L. K., Torday, J. S., Rubin, L. P. Mechanical stretch promotes alveolar epithelial type II cell differentiation. J. Appl. Physiol. 91, 589-595 (2001).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Cicchiello, L. A., Rubin, L. P. Cyclic mechanical stretch inhibits cell proliferation and induces apoptosis in fetal rat lung fibroblasts. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 282, L448-L456 (2002).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Cicchiello, L. A., Rubin, L. P. Cyclic mechanical stretch inhibits cell proliferation and induces apoptosis in fetal rat lung fibroblasts. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 282, L448-L456 (2002).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Gruppuso, P. A., Rubin, L. P. Mechanical stretch induces fetal type II cell differentiation via an epidermal growth factor receptor-extracellular-regulated protein kinase signaling pathway. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 30, 76-83 (2004).
- Wang, Y., Maciejewski, B. S., Lee, N., Silbert, O., McKnight, N. L., Frangos, J. A. Strain-induced fetal type II epithelial cell differentiation is mediated via cAMP-PKA-dependent signaling pathway. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 291, L820-L827 (2006).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Filardo, E. J., Rubin, L. P., Ingber, D. E. Integrins {beta}1, {alpha}6, and {alpha}3 contribute to mechanical strain-induced differentiation of fetal lung type II epithelial cells via distinct mechanisms. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 290, L343-L350 (2006).
- Wang, Y., Maciejewski, B. S., Soto-Reyes, D., Lee, H. S., Warburton, D., Sanchez-Esteban, J. Mechanical stretch promotes fetal type II epithelial cell differentiation via shedding of HB-EGF and TGF-alpha. J. Physiol. 587, 1739-1753 (2009).
- Wang, Y., Maciejewski, B. S., Drouillard, D., Santos, M., Hokenson, M. A., Hawwa, R. L. A role for caveolin-1 in mechanotransduction of fetal type II epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 298, L775-L783 (2010).
- Lee, H. S., Wang, Y., Maciejewski, B. S., Esho, K., Fulton, C., Sharma, S. Interleukin-10 protects cultured fetal rat type II epithelial cells from injury induced by mechanical stretch. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 294, L225-L232 (2008).
- Hawwa, R. L., Hokenson, M. A., Wang, Y., Huang, Z., Sharma, S., Sanchez-Esteban, J. IL-10 inhibits inflammatory cytokines released by fetal mouse lung fibroblasts exposed to mechanical stretch. Pediatric Pulmonology. , (2011).
- Kitterman, J. A. The effects of mechanical forces on fetal lung growth. Clin. Perinatol. 23, 727-740 (1996).
- Harding, R. Fetal breathing movements. The Lung: Scientific Fountations. Crystal, R. G., West, J. B., Banes, P. J. , 2nd Ed, Lippincott-Raven. Philadelphia. 2093-2104 (1997).
- Harding, R., Liggins, G. C. Changes in thoracic dimensions induced by breathing movements in fetal sheep. Reprod. Fertil. Dev. 8, 117-124 (1996).
