Summary
Las fuerzas mecánicas juegan un papel clave en el desarrollo pulmonar y lesión pulmonar. A continuación, describimos un método para aislar roedores pulmonares fetales células tipo II epiteliales y fibroblastos y exponerlos a la estimulación mecánica mediante un
Abstract
Las fuerzas mecánicas generadas en el útero por la repetición como la respiración, los movimientos y por la distensión del fluido son fundamentales para el desarrollo normal de los pulmones. Un componente clave del desarrollo de los pulmones es la diferenciación de las células alveolares de tipo II epiteliales, la principal fuente de surfactante pulmonar. Estas células también participan en la homeostasis de los líquidos en la luz alveolar, la defensa del huésped, y la reparación de lesiones. Además, las células del parénquima pulmonar distal puede estar directamente expuestos a la extensión exagerada durante la ventilación mecánica después del nacimiento. Sin embargo, los mecanismos moleculares y celulares mediante el cual las células pulmonares detectan los estímulos mecánicos para influir en el desarrollo pulmonar y promover la lesión pulmonar no se conocen. Aquí, se proporciona un método simple y de alta pureza para aislar las células de tipo II y fibroblastos de pulmón fetal de roedores. A continuación, se describe un sistema in vitro, la Unidad de tensión Flexcell, para proporcionar la estimulación mecánica de las células fetales, simulando las fuerzas mecánicas deel desarrollo pulmonar fetal o lesión pulmonar. Este sistema experimental constituye una excelente herramienta para investigar los mecanismos moleculares y celulares en las células del pulmón fetal expuestos a estirar. Con este enfoque, nuestro laboratorio ha identificado varios receptores y las proteínas de señalización que participan en mecanotransducción en el desarrollo pulmonar fetal y la lesión pulmonar.
Protocol
1. El recubrimiento de placas con las proteínas ECM
- En condiciones estériles, mezclar 120 g de laminina con 12 ml de PBS estéril 1X frío por placa.
- Tomar Bioflex placas sin tratar y añadir 2 ml de la solución a cada pocillo (concentración final de laminina es 2 mg / cm 2). Alternativamente, otras proteínas ECM podrían ser utilizados, tales como colágeno-1 [10 g / cm 2], la fibronectina [5 g / cm 2], vitronectina [0,5 g / cm 2] o elastina [10 g / cm 2]. La técnica de revestimiento es similar a lo que se ha descrito para laminina-recubrimiento. Asegúrese de que los pozos están completamente cubiertas por la solución.
- Envolver las placas con plástico y poner a 4 ° C sobre una superficie plana durante la noche para permitir la laminina para adsorber al fondo de los pocillos. En estas condiciones, las placas pueden ser almacenados por lo menos una semana al tiempo que conserva una buena función ECM.
- Al día siguiente, bajo condiciones estériles, lavar los pocillos 3 veces con PBS 1X.
- Lavar las placas 3 veces con PBS 1X para eliminar las proteínas no adsorbidas.
- Mantener las placas a 37 ° C en DMEM hasta que las células se aíslan de paso 2,14.
2. Aislamiento de pulmón fetal roedores células de tipo II epiteliales
El día antes del aislamiento que las tazas de pantalla con diferentes mallas de nylon de tamaño autoclave y listo.
- Obtener los pulmones del feto a partir de disolución-embarazada de ratón / rata en la E17-19 de la gestación. Transferir el tejido en un tubo cónico de 50 ml que contenía medio DMEM y lo coloca en hielo.
- Hacer tampón de digestión en un tubo cónico de 50 ml: (10 ml). Para este volumen, el tejido pulmonar de aproximadamente 20 fetos de ratón / rata se utiliza.
8,5 ml de DMEM
0,5 ml de 500 mM de pH 7,4 HEPES
5 mg de colagenasa 1
5 mg de colagenasa 1A
1 ml de suero de pollo, inactivado por calor - Mezclar bien hasta que todos los componentes se disuelven y el filtro a través de un filtro de 0,2 micras jeringa dentro de la campana estéril. Se coloca el tubo cónico que contenía el tampón de digestión en un baño de agua a 37 ° C.
- Eliminar el medio DMEM del tubo cónico de paso 2,1 y transferir el tejido en una placa de Petri estéril.
- Picar los pulmones bien con tijeras estériles o cuchilla de afeitar para hacer piezas de tejido inferior a 1 mm y transferir el tejido en el tubo cónico que contenía el tampón de digestión pre-calentado desde el paso 2,3.
- Digerir el tejido pipeteando arriba y abajo:
100 veces con 10 ml de pipeta
100 veces con 5 ml de pipeta
100 veces con pipeta Pasteur - Centrifugar el homogenado a 1300 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Retirar con cuidado el sobrenadante por aspiración y volver a suspender el precipitado que contiene las células en 15 ml de DMEM más FBS al 20%.
- Saca las copas de pantalla con 100 -, 30 - y 15 micras y mallas de nylon º lugarem en estériles de 150 ml vasos.
- Añadir homogenado de células a partir del paso 2.8 y secuencialmente filtrar a través de 100 -, 30 -, y 15 micras tazas de malla.
- Recoge agrupadas sin filtrar las células de los años 30 - y las mallas de 15 micras después de varios lavados con DMEM más FBS al 10% para facilitar la filtración de células no epiteliales.
- Desechar el filtrado de la malla 15-micras que contiene principalmente los fibroblastos.
- Purificar nuevas células de tipo II mediante la incubación de las células de paso 2,11 cm en 75-2 matraces durante 30 min (approximatelly10 ml de suspensión de células por matraz).
- Recoger el sobrenadante y se centrifuga a 1.300 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente para precipitar las células.
- Retire con cuidado el sobrenadante por aspiración y vuelva a suspender el pellet que contiene las células en DMEM libre de suero. El volumen de resuspensión depende de la cantidad de tejido procesado. Aproximadamente, se placa el equivalente de células obtenidas de un feto en cada pocillo (2 ml) a fin de Achivíspera entre 60-70% de confluencia el día siguiente.
- Placa de suspensión de la celda en Bioflex seis placas recubiertas con laminina y fibronectina.
3. Aislamiento de fibroblastos fetales roedores pulmonares
- Siga los mismos pasos descritos anteriormente para las células de tipo II de aislamiento de hasta 2,11.
- Tomar el filtrado de la malla 15-micrones (sin lavado previo; volumen aproximado es de 10-15 ml) y la placa a 75 cm de 2 a 37 ° C durante 30-60 minutos para permitir que los fibroblastos de adherirse.
- Aspirar el sobrenadante y reemplazar con DMEM libre de suero y se incuba durante la noche.
- Al día siguiente, cosechar las células con 0,25% (peso / volumen) de tripsina en 0,4 mM EDTA y la placa de ellas en placas recubiertas previamente con fibronectina Bioflex.
4. Sistema experimental para proporcionar la estimulación mecánica a las células pulmonares
- De semillas de las células (alrededor del 50% confluente) en placas de cultivo de Bioflex en DMEM libre de suero (2 ml / pocillo) y dejar que ellos adhieren y SPREanuncio por lo menos durante 6h antes de los experimentos. En general nuestro laboratorio mantiene células en cultivo de alrededor de 24 horas antes de la aplicación de la tensión mecánica. Si un número determinado de células son necesarios para los experimentos, después del aislamiento, las células de tipo II son mantenidos en DMEM libre de suero de 75 cm 2 frascos y al día siguiente, las células se tripsinizaron, se contaron y sembraron entonces.
- Al día siguiente, los medios se sustituyen con fresco DMEM libre de suero (2 ml / pocillo) y las placas Bioflex están montados en una unidad Flexcell FX-5000 Cepa. Monocapas no debe ser mayor del 80% confluentes antes de la iniciación de los experimentos.
- Cepa Equibiaxial se aplica a las membranas. El régimen de deformación varía en función de simulación de fuerzas mecánicas in vivo (véase la discusión).
- Las células cultivadas en no-estirados membranas cultivadas en paralelo se utilizan como controles.
- Al final de los experimentos, las monocapas se pueden procesar para analizar los cambios en la expresión génica (por ejemplo la proteína C surfactante)por la abundancia de proteínas PCR en tiempo real, por Western blot, etc Además, las monocapas se puede fijar para los experimentos de inmunocitoquímica. Para esta técnica, después de la fijación, las membranas de silastic se cortan a partir de las placas y se montaron en portaobjetos de vidrio utilizando 10-20 l de agua como un agente de montaje antes de permeabilización e incubación con anticuerpos. El sobrenadante puede utilizarse también para investigar la presencia de factores de crecimiento, citoquinas, etc
5. Los resultados representativos
Figura 1 y Figura 2 muestra representativa de contraste de fase fotografías de fetos de ratón E18 células tipo II aislado utilizando la técnica descrita en este manuscrito.
La Figura 3 demuestra que la tensión mecánica induce la diferenciación de las células de tipo II fetales epiteliales utilizando la proteína surfactante-C como un marcador.
Figura 1. Repsentante de contraste de fase fotografía tomada justo después de aislamiento que muestra el aspecto de los fetos se agruparon las células tipo II.
Figura 2. E18 fetales células de tipo II epiteliales se aislaron como se describe aquí y chapada en placas recubiertas con Bioflex laminina. La fotografía fue tomada el día siguiente después de no estirado las células fueron fijadas en paraformaldehído. La pureza de las células se determinó que era de 90 ± 5% por análisis microscópico de la morfología de las células epiteliales y inmunotinción para SP-C.
Figura 3. Fetal las células tipo II epiteliales fueron expuestos a la cepa cíclico de 5% a 40 ciclos por minuto durante 16 horas. Una mancha) del Norte de la proteína surfactante C (SP-C) que muestra que la expresión del ARNm cepa induce la diferenciación de células de tipo II utilizando diferentes sustratos ECM . Signos + / - representan la exposición o no a la sentrenar, respectivamente. Los datos se presentan como media + / - SEM, n = 3; * P <0,05 B) Imágenes de fluorescencia inmunocitoquímica demuestra la SP-C los niveles de proteína (verde) en las células tipo II fetales expuestos o no (control) a una tensión mecánica.. Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). Bar, 10 m. C) los resultados de Western blot a partir de tres experimentos que demuestran que el estiramiento mecánico aumenta la proteína SP-C. N = 3; * p <0,05.
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Discussion
En este manuscrito, se describe un método para aislar células tipo II fetales epiteliales y fibroblastos y exponerlos a la estimulación mecánica utilizando el aparato de tensión Flexcell. Hemos utilizado esta técnica para evaluar la diferenciación de las células epiteliales 1,2 y el estudio de los receptores y las vías de señalización activadas por tramo 3-9. Además, este método también se puede utilizar para investigar las respuestas de células inducidas por lesión mecánica 10,11. El procedimiento se basa en la digestión del tejido pulmonar con colagenasa. Se aprovecha de la tendencia de las células de tipo II a agruparse después de la digestión. Los pasos importantes al realizar esta técnica son picado el tejido bien para facilitar la digestión de los pulmones y lavado a fondo las células no filtradas en 30 y 15 mallas micras para facilitar la filtración de células no epiteliales y por lo tanto, para lograr una mayor pureza de las células de tipo II .
Nuestro laboratorio utiliza membranes revestido con colágeno o laminina para simular la composición de ECM de las membranas basales. Sin embargo, cuando las células se exponen a 20% de alargamiento, las células pueden desprenderse del sustrato durante el estiramiento y la fibronectina se debe considerar como un sustrato alternativo.
Otra consideración importante es evitar el 100% de confluencia de las monocapas celulares antes de estirar, ya que esto puede fomentar la célula a célula de contacto en lugar de contacto de célula a la matriz y por lo tanto, las células no pueden "sentir" el porcentaje de alargamiento establecido por el protocolo.
La Unidad de Cepa Flexcell utiliza un vacío para deformar una placa inferior cultura flexible. La aplicación de vacío se extiende cada membrana sobre el poste cilindro central, creando tensión uniforme radial y circunferencial a través de la superficie de la membrana y por lo tanto proporcionar distensión equibiaxial, similar a las condiciones in vivo (ver dibujos animados, vídeo resumen esquemático, con el permiso, el Dr. AJ Banes FlexCell International Corporation, www.flexcellint.com). Este sistema proporciona una definida, deformación controlada estático o cíclico por el régimen de tensión especificado. Para imitar los movimientos respiratorios fetales un régimen de estiramiento cíclico entre el 2,5-5% en el tramo de 40-60 ciclos por minuto se aplica. No hay acuerdo sobre el porcentaje de elongación que detecta los pulmones del feto durante la respiración del feto. Algunos autores creen que el 5% de distensión es de 12 apropiada, mientras que otros investigadores sostienen que el 2,5% es más representativo de las condiciones in vivo 13,14. Para simular la presión constante distensión, un protocolo de 2,5% tramo continuo se utiliza. Para imitar la lesión pulmonar, tramo de 20 a 40% cíclica ciclos por minuto se utiliza. Las limitaciones potenciales de esta técnica incluyen el aumento de la deformación de células sembradas en el área de la membrana periférica para el puesto de carga. Otra limitación es la imposibilidad de facilitar el alargamiento mayor del 15-20% si la tasa de ciclo alto se utiliza (por encima de 40 ciclos por minuto).
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Apoyado por el NIH subvención HD052670.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Collagenase 1 | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| Collagenase 1A | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| Screen cups | Sigma-Aldrich | CD1-1KT | |
| Syringe filters | Fisher Scientific | 09-754-25 | |
| 100 micron nylon mesh | Small Parts, Inc. | CMN-100-D | |
| 30 micron mesh | Small Parts, Inc. | CMN-30-D | |
| 15 micron mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX15 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Collagen-1 | Collagen Biomed | PC0701 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Vitronectin | Sigma-Aldrich | V-0132 | |
| Elastin | Sigma-Aldrich | E-6402 | |
| Bioflex plate | Flexcell International | BF-3001U | Uncoated |
| Flexcell Strain Unit | Flexcell International | FX-5000 |
References
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