使用光声血流循环黑色素瘤细胞的检测和隔离

Summary

我们已经开发出一种使用激光诱导超声检测循环黑色素瘤细胞的转移性疾病的早期指标的流式细胞仪。

Abstract

循环肿瘤细胞（CTCS）是那些从宏观肿瘤分离，细胞通过血液和淋巴系统种子^1,2,3继发性肿瘤蔓延。车辆检验中心是转移性疾病和他们的血液样本检测指标，可用于诊断癌症和监测病人的治疗反应。由于车辆检验中心是罕见的，对肿瘤细胞之间的正常血细胞的数十亿美元，在晚期癌症患者，他们的检测和枚举组成，是一项艰巨的任务。我们利用在大多数黑色素瘤细胞色素的存在，产生的光声，或激光诱导超声波在自定义流式细胞仪检测循环黑色素瘤细胞^（CMCS ）4,5。这个过程需要使用离心和取得的白血细胞层分离全血样本。如果目前在全血，由于类似密度的白血细胞的CMC将单独。这些细胞悬浮于磷酸盐缓冲液（PBS），并引入流量计。而不是一个连续流动血细胞悬液，诱导两相流为了捕捉这些细胞作进一步研究。在两相流中，在一个微流体系统中的两个互不相溶的液体在路口^和蛞蝓液体6,7交替的形式满足。 PBS暂停依次用激光照射的白血细胞和空气形成微升蛞蝓。增加了液相的表面活性剂可以形成统一蛞蝓，用户可以通过改变两相的流速不同大小的蛞蝓。空气和白血细胞的PBS鼻涕虫的蛞蝓包含没有光吸收，因此，不产生光声波。然而，甚至包含单一的CMC的白血细胞，蛞蝓吸收激光和产生高频率的声波。这些蛞蝓产生的光声波，被隔离，并收集细胞化学染色为verificATION奇美通讯。

Protocol

1。血液样品制备

1. 从第四阶段的癌症患者分成两个5毫升vacutainers绘制约10毫升的全血。
2. 在每分钟3000转（RPM）为10分钟的离心管。
3. 血样将分成三个不同层次：底层包括红细胞，中间层，也称为“ 捉鬼外套，包括白细胞和黑色素瘤细胞，并在顶层包含血浆和血小板。删除尽可能多的血浆，而不会干扰捉鬼外套。
4. 将250μL的Histopaque 1077两个1毫升Wintrobe管。
5. 使用9“巴斯德吸管，提取剩余的血浆，整个捉鬼外套，甚至红细胞的顶层，一定要收集<500μL。
6. Histopaque层上面的解决方案，并在15 mL锥形管为10分钟3000转离心Wintrobe管。
7. 血液将再次分开的，但这个时候红细胞分开的Histopaque，允许容易提取的棕黄色大衣。使用9“巴斯德吸管获得整个捉鬼外套，并放置在2 mL Eppendorf管。
8. 暂停在1.5毫升的PBS 2％V / V吐温20捉鬼外套。

2。流室建设

1. 获取压克力缸，外直径20毫米，17毫米内径，和8毫米高。对方在90度角，钻透一侧气缸的3个5毫米直径的孔。剪切聚合物管件（内径1.6毫米，5毫米外径），并放入钻孔。
2. 横跨丙烯酸环的底部封口膜，使水的密封。封口膜形式与丙烯酸环的浅碗，将持有的丙烯酰胺溶液，将形成一个流动室。
3. 暂停通过管件，对面是一个直径为1.6毫米的电线对方，确保单丝通过环中可见。填写一个1.6毫米的线径和位置远离暂停丝管1毫米的油管第三件。这些导线进入油管防止丙烯酰胺。丙烯酰胺固化后，将提取的电线，留下一个圆柱的流动路径和一个地方的位置光纤聚焦到流动路径。
4. 加入5毫升准备丙烯酰胺[20克丙烯酰胺（Sigma公司Aldrich公司），0.7克双丙烯酰胺（Sigma公司Aldrich公司），100毫升的蒸馏水]小烧杯中。测量出0.02克过硫酸铵（Sigma公司），并把它添加到烧杯中。混合搅拌棒为3分钟。添加20μL的tetramethylethylenediamene（尔科技）的烧杯中。快速倒入混合物，丙烯酸环充填顶端。几秒钟后，该解决方案将凝胶，使流动腔模具。小心拉电线，确保不打扰的丙烯酰胺凝胶。流湛BER是现在使用的准备。

3。光声血流设置

1. 声学夫妇一个聚偏二氟乙烯压电声换能器（的Panametrics）一个以上的流动路径直接使用超声凝胶的流动腔。
2. 使用刺刀奥尼尔Concelman（BNC）电缆，连接传感器输入一个RITEC宽带接收机- 640A（低通滤波器，高通滤波器：1 MHz时，输入阻抗：50欧姆，放大：35分贝）。滤波器的输出连接到示波器（泰克TDS 2024B）。触发示波器，一个光电二极管（Thorlabs）成立附近的传感器是插入到示波器使用BNC电缆。
3. 一个T型接头（小零件）连接到一个流室的手臂。两个注射泵（布伦特里科学）连接到连接器的其他分支。一个注射器中含有空气，而其他将包含在第一部分中编写的细胞悬液。设置流速100微升/分钟。
4. 直到空气形式的小口袋中提取流室的小管，并插入该插槽一个0.37数值孔径1毫米直径的芯光纤。填写，以减少接口信号和增加量，适用于流动路径的激光与水的口袋。由于数值孔径的光纤和短距离流路，激光只照射在任何特定时间蛞蝓样品，确保样品直接在前面的激光是同一样品光声信号。激光的能量应约28兆焦耳/ ^厘米 2的光斑大小7 ^毫米 2 。
5. 将两个注射器泵上。当两个不混溶流体到达丁字路口，他们将分割成均匀的蛞蝓和流过去的传感器。
6. 与纳秒脉冲激光产生的黑色素细胞的光声波照射流动的样品。由于黑色素是一个broadb和光吸收器，任何可见的激光波长可用于。
7. 如果信号在示波器上时，会出现一个蛞蝓上盖传感器，蛞蝓包含黑色素瘤，应通过跟踪系统，直到下降到一个集合小瓶。

4。免疫细胞化学

1. 为了解决这些问题，以玻片，以捕捉蛞蝓一个Cytospin 4离心机（Thermo Scientific的）。到Cytofunnels放置玻片（Shandon EZ单Cytofunnel与布朗过滤卡的Thermo Scientific）和装入Cytospin 4离心机。放入100μL1％牛血清白蛋白的PBS（Sigma公司）到每一个漏斗，然后在3分钟600转离心机帮助捕获的细胞粘到载玻片。
2. 离心后，添加细胞样本的Cytofunnels，然后在3分钟600转离心机。再喷乙醇固定液的幻灯片。
3. 两次在PBS洗10分钟的幻灯片。
4. 孵化后，倒出与初级抗体溶液在室温下湿盒1小时的幻灯片和孵化。每张幻灯片应包含1％MART - 1抗体兔提出，CD - 45抗体在小鼠中提出的1％，10％山羊血清，89％PBS。
5. 孵化后，在PBS洗10分钟三次幻灯片。
6. 幻灯片，然后在一，二级抗体溶液，有荧光抗体绑定到的孵育。混合物含有羊抗兔抗体0.05％，0.05％的羊抗鼠抗体，0.1％山羊血清，99％PBS。幻灯片在黑暗中孵育，在室温下1小时。
7. 孵育后，倒出的幻灯片在PBS洗为5分钟三次。
8. 染色细胞核，细胞孵育0.1微克/毫升的DAPI（Invitrogen公司）1分钟。然后倒出的幻灯片，并在PBS洗。
9. 安装一个使用20μL每张幻灯片树脂为基础的安装媒体的样品对细胞的盖玻片。透明指甲油密封盖玻片保存幻灯片。现在的幻灯片，准备用荧光显微镜成像。

5。代表性的成果：

图1白血细胞和黑色素细胞的光声波形显示在这里。白血细胞，没有固有的色素沉着，产生的电子噪声平线（左）没有光声波和清单。色素性黑色素瘤细胞产生强大的光声波（右）。

图2免疫细胞化学染色后，黑色素细胞培养显示，在“基本法”的DAPI信号UE同时MART1以绿色突出显示。

图3。叠加的DAPI和MART1图像，如图2与CD45，白细胞的指标，这个数字显示几个白血细胞中的黑色素细胞。

Discussion

检测车辆检验中心仍然是极少数因难的问题隔离罕见的肿瘤细胞临床应用的研究密集型领域。许多其他技术正在评估的CTC检测，包括RT - PCR技术，微流体细胞捕捉，免疫捕获，和其他方法^8-12。然而，CMC的显示光声检测的承诺，因为它是标签，并提供了一​​种快速，准确的手段捕捉小，重量轻的吸收颗粒。

协议描述白血细胞分离效率高，还存在样品中的红血细胞的低数量。这些胭脂污染的细胞也能吸收激光灯，但在一个水平大大下降。为了确保红血细胞不干扰我们的黑色素瘤的检测系统，通过该系统推出5个健康的病人样本，没有人给一个信号，表明，目前在足够低浓度的红血细胞被忽略。

使用培养的黑色素细胞和光声流系统已被证明敏感下降到1细胞/μL（未发表数据），已进行了一系列的集中研究。这些研究下去，并很快将包括使用癌症病人样本的审判。

这光声技术也正在评估中使用，如乳腺癌和附加外源性生色前列腺癌，非色素的CTC。我们已经完成前期工作，利用黄金纳米粒子癌症cells13。这些试验表明，纳米粒子可以提供必要的光吸收产生光声波。其余的技术挑战是癌细胞的选择性附加这样的粒子。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	ABCD1234