Summary
Мы описываем набор тестов для анализа уровня экспрессии гистонов H1 компоновщика. мРНК отдельных генов H1 количественно измеряемых случайных грунтовка на основе обратной транскрипции следует ПЦР в реальном времени, в то время как белок количественно H1 гистонов достигается за счет анализа ВЭЖХ.
Abstract
Компоновщик гистона H1 связывается с нуклеосом частиц ядра и компоновщик ДНК, способствуя складной хроматина высшего порядка в структуре. H1 имеет важное значение для развития млекопитающих 1 и регулирует конкретные экспрессии генов в естественных условиях 2-4. Среди высоко консервативных белков гистонов, семья гистонов H1 компоновщик является наиболее разнородную группу. Есть 11 подтипов H1 у млекопитающих, которые дифференциально регулируется в процессе развития и в разных типах клеток. Эти подтипы H1 включает 5 соматических H1s (H1a-е), замена H1 0, 4 половых клеток конкретного подтипа Н1, и H1x 5. Наличие нескольких подтипов H1, которые отличаются в ДНК сродство хроматина и уплотнение способностью 6-9 обеспечивает дополнительный уровень модуляции функции хроматина. Таким образом, количественный анализ экспрессии отдельных подтипов H1, как мРНК и белков, необходимых для лучшего понимания регулирования высшегопорядок структуры хроматина и функции.
Здесь мы опишем набор тестов предназначен для анализа уровня экспрессии отдельных подтипов H1 (рис. 1). экспрессию мРНК различных генов вариант H1 измеряется набор высокочувствительных и количественные обратной транскрипции-ПЦР (QRT-PCR) анализы, которые быстрее, точнее и требуют гораздо меньше образцов по сравнению с альтернативным подходом Северной блоттинга. В отличие от большинства других клеточных сообщения мРНК, мРНК для большинства генов гистонов, в том числе большинство H1 генов, не имеют длинный хвост полиА, но содержат стволовые структуры петли на 3-нетранслируемой области (УТР) 10. Таким образом, кДНК готовят из общей РНК путем обратной транскрипции с использованием случайных праймеров, а не олиго-дТ праймеров. Realtime анализы ПЦР с праймеров, специфичных для каждого подтипа Н1 (табл. 1) выполняется для получения высокой количественного определения мРНК отдельных подтипом H1с. Экспрессия генов домашнего хозяйства анализируются в качестве контроля для нормализации.
Относительное содержание белков каждого подтипа Н1 и стержневых гистонов получается путем обратной фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ) анализ всех гистонов извлечены из клеток млекопитающих, 11-13. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и элюирования условиях, описанных здесь, дают оптимальное разделение подтипов H1 мыши. По количественному профиля ВЭЖХ, вычислить удельный вес отдельных подтипов H1 H1 в семье, а также определить H1 в нуклеосомы отношения в клетках.
Protocol
1. Подготовка проб РНК и добыча
- Прежде, чем добыча РНК, все рабочие поверхности и пипетки следует протереть 70% этанола и обрабатывают РНКазы обеззараживания решения, такие как РНКазы Зап. Эта практика снижает шансы РНКазы загрязнения и деградации РНК. Надевайте перчатки для всех процедур.
- Чтобы извлечь ДНК из тканей мышей, анализировать орган интерес эвтаназии мыши и стирать ткань в ледяной фосфатного буфера (PBS: 0,13 М NaCl, 5 мМ фосфат натрия двузамещенный гептагидрат, 5 ммоль натрия дигидрофосфат гептагидрат, рН 7,4) . Немедленно приступить к добыче РНК в пункте 1.4. Если свежей ткани не должны быть обработаны для выделения РНК, образцы тканей должны быть оснастки замораживали в жидком азоте сразу и храниться при температуре -80 ° C для дальнейшего использования.
- Если РНК должны быть извлечены из приверженцем культуры клеток, аспирации культуры средств массовой информации, промыть достаточным количеством PBS, а также добавить Trizol реагент (Инвитропоколения) на тарелку и перейдите к шагу 1.4. Для клеток, выращенных в подвеску, урожай клеток и гранул клеток путем центрифугирования. Отменить СМИ, промыть гранулы кратко PBS, и гранулы клеток центрифугированием. Добавить Trizol реагентов и перейдите к шагу 1.4.
- Достаточно реагентов Trizol необходимо для получения высокого качества РНК. Используйте 1 мл Trizol реагент для извлечения ДНК из 50 - 100 мг ткани, 5 - 10 х 10 6 клеток (для суспензионных культур), или на 3,5 см пластины (для приверженца культуры). Однородный ткани Trizol реагентов с Polytron PT2100 гомогенизатор (или эквивалент). Перейдите извлечь ДНК из образцов тканей или клеток, в соответствии с инструкцией производителя Trizol реагента (Invitrogen).
- Концентрации РНК измеряется с помощью Nanodrop 1000 (Thermo Scientific) и РНК качество анализируются с помощью гель-электрофореза. Типичный диапазон доходности от 1-10 мкг РНК на мг ткани или 5-15 мкг РНК в 1 х 10 6 культуре клеток. Для устраненияпотенциального загрязнения РНК из следовых количеств геномной ДНК, РНК пробы обрабатывали РНКазой без ДНКазы (Sigma AMP-D1) в соответствии с инструкцией производителя. Повторить определения концентрации РНК и гель-электрофореза чтобы убедиться в отсутствии деградации РНК из этого лечения. Магазин извлечь РНК при температуре -80 ° C.
* Примечание: РНК также могут быть извлечены при помощи RNAeasy комплект (Qiagen) в соответствии с ручной набор, или ДНК / РНК комплект (Qiagen), если ДНК и РНК лучшего.
2. Количественные обратной транскрипции ПЦР (QRT-PCR)
- Всего РНК в обратной транскрипции кДНК использованием Надстрочный III Первая прядь синтеза системы (Invitrogen). С мРНК большинство генов H1 не хватает поли-хвостами, важно использовать случайный гексамеров вместо олиго-дТ в качестве праймеров для синтеза кДНК. Однако, если анализ экспрессии генов с полиаденилированной сообщения на низком уровне, также желательно, смесь случайных гексамеров и олиго-дТ шоуЛ.Д. быть использованы в обратной транскрипции (RT) реакция на улучшение эффективности обратной транскрипции полиаденилированной мРНК.
- Выполнение реакции RT в соответствии с инструкцией производителя. Короче говоря,
- В 0,5 мл ПЦР трубы, объединить 5 мкг общей РНК, 1 мкл 50 нг / мкл случайных гексамеров, 1 мкл 10 мМ смеси дНТФ, а также добавить DEPC обработанных H 2 O, чтобы сделать общий реакционный объем в 10 мкл. Все хорошо перемешать и выдержать в течение 5 минут при 65 ° C, затем по 1 минуте инкубации на льду.
- Подготовить 10 мкл кДНК Синтез Mix: 2 мкл 10xRT буфера, 4 мкл 25 мМ MgCl 2, 2 мкл 0,1 М ДТТ, 1 мкл RNaseOut (40 ед / мкл), 1 мкл Надстрочный III RT (200 U / мкл) и добавить его в РНК / грунтовки смеси.
- Инкубировать 10 минут при 25 ° C, а затем на 50 минут при 50 ° C и прекратить реакции при 85 ° С в течение 5 минут.
- Каждая реакция обычно дает 100-250 нг / мкл кДНК продукт. Хранить кДНК продуктов при температуре -20° С и сразу же приступить в режиме реального времени количественный ПЦР (КПЦР).
- КПЦР может точно количественно копий целевой последовательности с высокой эффективностью и воспроизводимостью 14. Выберем КПЦР измеряется SYBR зеленый краситель, который дает флуоресцентный сигнал только тогда, когда интеркалирует с двухцепочечной ДНК (дц). Хотя не столь конкретны Taqman анализ 14, этот метод является более экономически эффективным, легче будет принят в лабораторию, и дает большую гибкость в КПЦР. Поэтому важно изучить усиление участка (рис. 2A) и производная кривых плавления продукта КПЦР (рис. 2В), чтобы обеспечить эффективность и специфичность реакции.
| Гистонов подтипы | Мышь гистонов номенклатуры | Человека гистонов номенклатуры | ||
| Geпе имя | Присоединение нет. | Гена имя | Присоединение нет. | |
| Гистонов H1a | Hist1h1a | NM_030609 | HIST1H1A (H1.1) | NM_005325 |
| Гистонов H1B | Hist1h1b | NM_020034 | HIST1H1B (H1.5) | NM_005322 |
| Гистонов H1c | Hist1h1c | NM_015786 | HIST1H1C (H1.2) | NM_005319 |
| Гистонов H1d | Hist1h1d | NM_145713 | HIST1H1D (H1.3) | NM_005320 |
| Гистонов H1e | Hist1h1e | NM_015787 | HIST1H1E (H1.4) | NM_005321 |
| Гистонов H1 ° | H1f0 | NM_008197 | H1F0 | NM_005318 |
| Гистонов H1oo | H1foo | NM_183811 | H1FOO | NM_153833 |
| Гистонов H1t | Hist1h1t | NM_010377 | HIST1H1T | NM_005323 |
| Гистонов H1t2 | H1fnt | NM_027304 | H1FNT | NM_181788 |
| Гистонов H1x | H1fx | NM_198622 | H1FX | NM_006026 |
| Гистонов Hils1 | Hils1 | NM_081792 | HILS1 | AY286318 |
Таблица 1. Гистонов номенклатуры подтипом H1 у мыши и человека.
- Дизайн вперед и назад ПЦР праймеров, специфичных для каждого гена H1 (табл. 1). В связи с высокой сходство последовательности между соматическими H1s, особенно в области, соответствующей центральной области шаровидные, очень важно для того, чтобы праймеры для конкретного подтипа Н1 не совпадают с отермо H1 генов, или крест усиливаются другими подтипами H1. Важно также отметить, что большинство генов H1 не содержат интронов. Таким образом, интрон охватывающей грунтовки обычно принято для RT-PCR, чтобы избежать загрязнения геномной недоступны. Вместо этого, РНК образцы должны быть предварительно обработаны ДНКазы (см. п. 1.5) для устранения любых следовых количеств геномной загрязнения. Кроме того, RT (-)-КПЦР должны выполняться параллельно, чтобы проверить отсутствие геномной в кДНК образцов.
- Кроме того, дизайн грунты для внутренних генов ссылки, которые выражении не изменился среди образцов. Часто хозяйства генов, таких как глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (GAPDH) и бета-актина, генов, которые выбраны в качестве эталонных генов. КПЦР сигналы хозяйства гены служат нормализации управления.
- Подготовка каждой реакции ПЦР (общим объемом 25 мкл) следующим образом: 12,5 мкл 2х IQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) (содержащие дНТФ, 50 Ед / мл iTaq ДНК-полимеразы, 6 мМ MgCl 2, SYBR Green I и 20нМ флуоресцеин), 2 мкл 4 нг / мкл кДНК, 1,25 мкл 10 нМ вперед / назад сочетание грунтовки, и 9,25 мкл DDH 2 O, и хорошо перемешать в Microseal 96-луночного ПЦР пластины. Используйте 'B' Microseal клей тюленей (Bio-Rad) для того, чтобы крышка запечатана к пластине. Нажмите или, коротко, вихрь пластине ПЦР и спином вниз реакционной смеси с помощью короткого центрифугирования. Поместите пластину в один цвет MyIQ ПЦР в реальном времени Detection System (Bio-Rad) для КПЦР.
- Мы используем следующие условия КПЦР: 95 ° C в течение 3 минут, затем 40 циклов 95 ° C в течение 10 секунд, 60 ° С в течение 20 секунд, 72 ° С в течение 30 секунд. Изучить усиления кривых (рис. 2A) для ПЦР эффективности и Ct (Порог цикл) значения. Порог линия может быть автоматически устанавливается IQ5 оптический 2.0 Software версии системы.
- Эффективность грунтовки и оптимальной концентрации кДНК необходимости могут быть проверены на стандартном анализе кривой, в которой серийного разведения геномной ДНК яИспользуется для КПЦР и Ct значения заговор против журнала шаблон количество ДНК. Оптимизированный анализа КПЦР с праймерами высокой специфичностью и эффективностью даст линейной калибровочной кривой, при этом коэффициент детерминации (R 2)> 0,98. Избегайте грунтовки с ампликонов длиной более 200 б.п., который, как правило, низкая эффективность усиления.
- Потому что SYBR Green обнаруживает дц, важно выполнять перспективе кривой плавления после КПЦР для того, чтобы желаемое ампликона, но не грунтовка димеров или загрязняющих веществ, усиливаются и детектируются. Для расплава анализа кривых, программа КПЦР прибор для нагревания образцов от 55 ° C до 95 ° C в течение 0,5 ° C с шагом сбора данных. Значение по умолчанию расплава анализа кривых для MyIQ (Bio-Rad) прибор выглядит следующим образом: 95 ° C в течение 1 минуты, 55 ° C в течение 1 минуты, а затем на 81 циклов по 10 секунд на уставки 55 ° C, растопить кривой, + температура 0,5 ° C (камера собирает данные при каждом цикле).
- С Температура плавления (Tm) в дц зависит от длины ампликона и GC содержания, различные ампликонов будут иметь различные т (ы). Изучить производная кривых плавления продуктов КПЦР для подтверждения определенной температуры плавления желаемой ампликонов, а также отсутствие шума ампликона пиков (рис. 2В).
- Подготовить дублировать или трех экземплярах реакции для каждого анализа для статистического анализа. Включите отрицательного контроля за QRT-PCR, таких как Татарстан (-)-КПЦР (КПЦР с РНК в качестве матрицы без обратной транскрипции) и КПЦР, не кДНК, РНК или ДНК, добавил источник в смеси ПЦР. RT (-)-КПЦР может служить контроль за потенциальными геномной ДНК (RT (-) на рисунке 2 и 3).
- Анализ данных с КПЦР IQ5 Оптическая система Программное обеспечение версии 2.0 (Bio-Rad). Нормализация выражения значения H1 генов изоформ с выражением генов домашнего хозяйства (например, GAPDH, бета-актина, HPRT), чтобы получить относительные уровни экспрессии гена H1.
* Все процедуры должны проводиться на льду или при температуре 4 ° C.
- Проанализируйте мыши ткани и промойте его с ледяным PBS. (Если не приступить к добыче сразу хватать замораживания и хранения образцов, как это описано в пункте 1.2.) Мелко ткань на куски лезвия бритвы. Передача фарша Dounce гомогенизатор (B пестиком). Добавить 10 мл Сахароза буфера (0,3 М сахарозы, 15 мМ NaCl, 10 мМ HEPES [рН 7.9], 2 мМ ЭДТА, 0,5 мМ PMSF, полный мини ингибитор протеазы коктейль Tablet, добавить свежие) на грамм ткани. Однородный ткани с 10-15 ударов.
- Передача гомогенатах до 15 мл трубку, спина на 500 оборотов в минуту в течение 30 секунд (центрифуги модели: Eppendorf 5810R), тщательно передать супернатант в новую пробирку (отказаться от гранул ткани мусора), а центрифуги в 2000 оборотов в минуту в течение 5 минут, для осаждения клеток. Переходите к пункту 3.4.
- Если гистонов хроматина и должны быть извлечены из клеток, выращенных в монослой, промойтес PBS, PBS добавить к культуре блюдо, и урожай клеток с помощью мобильного скребок, и гранулы клеток путем центрифугирования. Для клеток, выращенных в суспензии, гранулы клеток путем центрифугирования.
- Ресуспендируют клеточный осадок в 10 мл буфера Сахароза дополнена 0,5% NP-40 (на грамм исходного количества ткани или 10 (8) клеток). Передача образца Dounce гомогенизатор (B пестиком) и Dounce 10 ударов в течение 20 минут инкубации. На данный момент ядер. Изучите качество ядра под микроскопом. Гранул ядер центрифугированием при 2000 оборотов в минуту в течение 5 минут. Удалите супернатант.
- Ресуспендируйте ядер гранул в 3 мл буфера высокая соль (0,35 M KCl, 10 мМ трис [рН 7,2], 5 мМ MgCl 2, 0,5 мМ PMSF - добавлять свежий перед каждым использованием) на 1 г ткани или 10 (8) клеток. Передача образца небольшой Dounce гомогенизатор (B пестиком) и гомогенизации с 5-10 ударов.
- Алиготе приостановлении на 3 трубы Эппендорф (1 мл), инкубируют на льду в течение 20 минут, а затемцентрифугирования при 14000 оборотов в минуту в течение 10 минут, чтобы гранулы хроматина. Удалите супернатант.
- Добавить 0,8 мл 0,2 NH 2 SO 4 на каждый хроматином гранул. Используйте трубку Eppendorf пестик для измельчения Dounce осадок хорошо, пока осадок полностью диссоциированы. Инкубируйте образцы на вращающейся платформе при 4 ° С в течение ночи. Всего гистонов добывается этот шаг кислотной обработки.
- Центрифуга при 14000 оборотов в минуту в течение 10 минут. Перенести супернатант (гистонов выдержки) в две пробирки Eppendorf (400 мкл / трубка). Откажитесь от гранул. Добавьте 2,5 объема (1 мл) ледяной этанола в каждую пробирку .. Храните образцы при -20 ° С в течение ночи.
- Центрифуга при 14000 оборотов в минуту в течение 10 минут, чтобы шарик общего гистонов, удалите супернатант. Промойте осадок в три раза с 70% этанола, оставить на скамейке в течение 20-30 минут, чтобы высохнуть. Хранить высушенные белки при -80 ° С и растворить их в DDH 2 O и приступить к анализу ВЭЖХ немедленно. Сухие белки могут быть сохраненыпри -80 ° С в течение 1 года.
4. ВЭЖХ анализ компоновщика Гистоны
- Ресуспендируют гистонов гранул в рекомендованном объеме DDH 2 O в зависимости от емкости обратной фазы колонки и инструмент высокоэффективной жидкостной хроматографии. Мы используем C18 обратном колонке фаза 250 х 4,6 мм (Vydac) и Äktapurifier UPC 900 инструментов (GE Healthcare) для анализа ВЭЖХ. Мы обычно растворяются 50 100μg от общего числа гистонов в 100 мкл DDH 2 0 для анализа.
- Центрифуга при 14000 оборотов в минуту в течение 5 минут для удаления нерастворимого остатка. Брэдфорд белка анализ используется для определения количества белка, который будет введен в колонку. Вводите 50-100 мкг общего белка в обратном колонке фазы системы высокоэффективной жидкостной хроматографии. Загрузка избыточное количество белка следует избегать, чтобы предотвратить засорение колонны.
- Фракционирования компоновщик гистонов и стержневых гистонов с возрастающим градиентом ацетонитрила, которые перечислены в таблице 2.
Таблица 2. Увеличение градиентом ацетонитрила с течением времени.
- Сточные воды контролируется при 214 нм, и ВЭЖХ профилей (ФигуRe 4) записываются и анализируются с помощью Äktapurifier UPC 900 (GE Healthcare) с UNICORN 5,11 программное обеспечение (GE Healthcare). Белковых фракций также могут быть собраны с долей авто-коллектор (ГРП-920 - GE) для дальнейшего анализа, например, SDS-PAGE и масс-спектрометрии.
- 214 значений из вершин каждого подтипа Н1 и Н2В нормированы на число пептидных связей каждая из которых соответствует гистонов белка. Удельный вес отдельных подтипов H1 гистонов H1 в семье, а также отношение подтипов H1 для частиц нуклеосом ядро может быть вычислена из этих нормированных 214 значений (рис. 5).
5. Представитель Результаты
Список млекопитающих подтипа Н1, общая схема и представительства Результаты анализа экспрессии отдельных генов гистонов Н1 приведены в таблице 1, Рисунок 1 и Рисунок 2-5, соответственно.Рисунок 2А показывает типичные кривые усиления H1a реакции КПЦР использованием кДНК из печени мыши и mESCs, в то время как рисунок 2B показывает производная кривых плавления соответствующих ампликонов. Кривая плавления отображает один характерный пик при температуре плавления (Tm) при 86 ° С для ПЦР H1a ампликона, и не имеет неспецифический фон пики, что свидетельствует высокая специфичность теста H1a КПЦР. Оценка усиления участка (рис. 2A) показывает, что трех экземплярах КПЦР реакции каждого образца дали последовательно сигналы с почти одинаковые значения Ct, предлагая высокую воспроизводимость. Отсутствие ампликонов наращивание от RT (-)-КПЦР реакции показывает, что геномной ДНК не было, или минимальным. Используя Ct значения H1 генов и генов домашнего хозяйства, таких как GAPDH, относительном выражении уровни РНК каждого гена H1 были рассчитаны. Примеры результатов расчета за 1 полугодие ° и H1a гены приведены в Разница в выражении H1a или H1 ° в печени мышей мЭСК против взрослых тоже видно из профилей ВЭЖХ белков гистонов (рис. 4). H1 °, дифференциацию конкретных H1, накапливаются в большом количестве в зрелых тканях, что составляет 27,2% от общего числа H1 во взрослой печени (рис. 5а). В отличие от H1 ° белка практически отсутствует в недифференцированных mESCs (рис. 4В). С другой стороны, H1a сильно выражено, как в мРНК транскрипты и белки, в mESCs (рис. 3 и 4, б). С помощью количественного H1 пики в профиле ВЭЖХ, удельный вес каждого отдельного подтипа H1 в H1 семьи определяется (рис. 5а). Кроме того, значения отдельных подтипов H1 (илиобщий H1) в нуклеосомы может быть рассчитана как отношение нормированных 214 пикового значения соответствующих подтипов H1 (или сумма всех H1) до половины нормированного значения 214 H2B (рис. 5В). 
Рисунок 1. Общая схема анализа экспрессии млекопитающих компоновщика-гистонов подтипов. 
Рисунок 2. Представителю результаты анализа H1a КПЦР. (A) Усиление участок анализ H1a КПЦР. Линии порога и Ct значения, установленные IQ5 оптический системных программ указаны. (Б) Производные талой кривые КПЦР продукцию, представленную в (A). 
Рисунок 3. QRT-PCR анализ мРНК уровни H1a и H1 ° в mESCs и взрослых мУЗ печени. Y ось представляет относительный уровень экспрессии гена H1, что и ссылка гена фермента. КПЦР с РТ (-) образцов (РНК без обратной транскрипции) показывает минимальный или нет сигналов. 
Рисунок 4. ВЭЖХ гистонов извлечены из клеток млекопитающих. Обратный ВЭЖХ анализ 100 мкг общего гистонов, извлеченные из печени взрослых мышей (A) и мышей стволовые клетки (B). По оси Х: время элюирования. Y оси: Мау, милли-впитывающей единиц. 
Рисунок 5. H1 состав подтипом H1 и в нуклеосомы отношения во взрослой печени мыши. 214 значений площади пика для каждой изоформы H1 и H2B рассчитываются UNICORN 5,11 программное обеспечение (GE Healthcare), и нормировано количество пептидных связей, присутствующих в соответствующих гистонов белка. Сумма нормированных214 значений всех подтипов H1 получается как значение для общего H1. Процент от общего числа H1 для каждого подтипа Н1 (А), а также отношение к H1 нуклеосом (представлена половина нормированные значения 214 H2B) (B) в печени взрослой мыши рассчитываются исходя из профиля ВЭЖХ показал на рисунке 4а.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Набор тестов, представленные здесь включить всесторонний анализ уровня экспрессии млекопитающих компоновщик гистонов подтипов. Правильно спроектированные QRT-ПЦР обеспечивают высокую чувствительность и точность измерений сообщений РНК с любого млекопитающего гистонов гены H1. Важной частью QRT-ПЦР для компоновщика гистонов генов подтипа является подготовка кДНК с использованием случайных грунтовка на основе обратной транскрипции. мРНК гистонов самых генов, в том числе большинство генов H1, не содержат длинный поли-хвост, представленных в других клеточных мРНК. Таким образом, традиционный метод обратной транскрипции с олиго-дТ грунтовки не будет эффективно производить H1 кДНК. Выражение анализ нескольких генов H1 с мРНК транскрипты содержащих поли-хвосты, таких как H1 0, одинаково эффективен при случайном гексамеров основана QRT-PCR (рис. 3), вероятно, из-за высокой численности H1 РНК. Тем не менее, смесь олиго-дТ грунтовки и случайных гексамеров для RT реакцииТион могут быть приняты для улучшения эффективности РТ полиаденилированной мРНК, которые имеют низкое количество копий, что позволяет более широкий охват генов проанализированы QRT-PCR. QRT-PCR внутренних генов ссылки, такие как ген домашнего хозяйства GAPDH, входит, так что относительный уровень экспрессии специфических генов H1 различных тканей и типов клеток можно сравнить (рис. 3). Объединив QRT-PCR со стандартным анализом кривой, можно также получить абсолютные цифры копию H1 кДНК из различных образцов (данные не представлены).
Здесь также описываются протоколы гистонов добычи и ВЭЖХ белков гистонов. Преимуществом этого метода является то, что можно определить относительные пропорции каждого подтипа Н1 в пуле общего белка H1, а также количественное соотношение отдельных подтипом H1 (и общего H1) в нуклеосомы. Кроме того, по сравнению с другими методами анализа белков, таких как Западная блоттинга, анализ HPLC проVides количественные и воспроизводимые измерения всех подтипов H1. Различных уровней и состава H1 подтипов в клетке модулировать выше структуры хроматина порядке. Отношение к H1 нуклеосом была коррелируют с хроматином уплотнения и является определяющим для нуклеосомы длина повтора в хроматина 2. Таким образом, методы, описанные здесь, мы должны иметь широкое применение в исследованиях хроматина.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке гранта от НИЗ GM085261 и Коалиция Грузии Рак Уважаемые премии ученого (к YF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNase Zap | Applied Biosystems | AM9780 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-018 | |
| SuperScriptIII | Invitrogen | 18080-051 | |
| Absolute Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 | |
| IQ SYBR Green | Bio-Rad | 170-8880 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | AMP-D1 | |
| Microseal 96-well PCR plate | Bio-Rad | MSP-9605 | |
| Microseal ’B’ Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| Sucrose | Acros Organics | AC40594 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP332 | |
| Sodium chloride (NaCl) | American Bioanalytical | AB01915 | |
| Sodium dihydrogen phosphate heptahydrate (NaH2PO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP-330 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| Complete Mini proteinase inhibitor cocktail tablet | Roche Group | 11836153001 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E-5134 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | American Bioanalytical | AB01620 | |
| Nonidet-40 (NP-40) | American Bioanalytical | AB01425 | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366 | |
| Tris [hydroxymethyl aminomethane] | American Bioanalytical | AB02000 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) | VWR international | VW3648-3 | |
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Acros Organics | AC42330 | |
| Bradford Protein Assay | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Acetonitrile | EMD Millipore | AX0145-1 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | JT Baker | 9470-01 |
References
- Fan, Y. H1 linker histones are essential for mouse development and affect nucleosome spacing in vivo. Mol. Cell Biol. 23, 4559-4572 (2003).
- Woodcock, C. L., Skoultchi, A. I., Fan, Y. Role of linker histone in chromatin structure and function: H1 stoichiometry and nucleosome repeat length. Chromosome Res. 14, 17-25 (2006).
- Shen, X., Gorovsky, M. A. Linker histone H1 regulates specific gene expression but not global transcription in vivo. Cell. 86, 475-483 (1996).
- Alami, R. Mammalian linker-histone subtypes differentially affect gene expression in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 5920-5925 (2003).
- Happel, N., Doenecke, D. Histone H1 and its isoforms: contribution to chromatin structure and function. Gene. 431, 1-12 (2009).
- Clausell, J., Happel, N., Hale, T. K., Doenecke, D., Beato, M. Histone H1 subtypes differentially modulate chromatin condensation without preventing ATP-dependent remodeling by SWI/SNF or NURF. PLoS One. 4, 0007243-0007243 (2009).
- Khadake, J. R., Rao, M. R. DNA- chromatin-condensing properties of rat testes H1a and H1t compared to those of rat liver H1bdec; H1t is a poor condenser of chromatin. Biochemistry. 34, 15792-15801 (1995).
- Orrego, M. Differential affinity of mammalian histone H1 somatic subtypes for DNA and chromatin. BMC Biol. 5, 22-22 (2007).
- Th'ng, J. P., Sung, R., Ye, M., Hendzel, M. J. H1 family histones in the nucleus. Control of binding and localization by the C-terminal domain. J. Biol. Chem. 280, 27809-27814 (2005).
- Wang, Z. F., Sirotkin, A. M., Buchold, G. M., Skoultchi, A. I., Marzluff, W. F. The mouse histone H1 genes: gene organization and differential regulation. J. Mol. Biol. 271, 124-138 (1997).
- Brown, D. T., Sittman, D. B. Identification through overexpression and tagging of the variant type of the mouse H1e and H1c genes. J. Biol. Chem. 268, 713-718 (1993).
- Fan, Y., Sirotkin, A., Russell, R. G., Ayala, J., Skoultchi, A. I. Individual somatic H1 subtypes are dispensable for mouse development even in mice lacking the H1(0) replacement subtype. Mol. Cell. Biol. 21, 7933-7943 (2001).
- Fan, Y., Skoultchi, A. I. Genetic analysis of H1 linker histone subtypes and their functions in mice. Methods Enzymol. 377, 85-107 (2004).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M.
